Các công ty cung cấp thiết bị, thuốc thử và/hoặc vật tư: Abcam, Cambridge, MA; Phòng thí nghiệm ACD, Toronto, CA; Kháng thể Acris, Inc), San Diego, CA; Advanced Bioscience Resources, Inc (ABR), Rockville, MD; Công nghệ Agilent, Santa Clara, CA; Chẩn đoán Alpco, Salem, NH; Hệ sinh học ứng dụng, Thành phố Foster, CA; BD Pharmingen, San Jose, CA; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ; Phòng thí nghiệm Bethyl, Montgomery, TX; Hệ thống xét nghiệm sinh học, Hayward, CA; Phòng thí nghiệm đồng vị Cambridge, Tewksbury, MA; Thời gian sinh học, Inc, Alameda, CA; Kính hiển vi Carl Zeiss, Thornwood, NY; Carolina Liquid Chemistries, Corp., Winston-Salem, NC; Charles River Laboratories International, Inc, Wilmington, MA; Chenomx, Inc, Alberta, Canada; Cole-Parmer, Tòa án Vernon Hills, IL; DiaPharma, thị trấn West Chester, OH; Khoa học Fisher, Pittsburgh, PA; Gatan, Inc, Pleasanton, CA; Illumina, San Diego, CA; Khéo léo, Thành phố Redwood, CA; Life Technologies Corp, Grand Island, NY; Leica, Washington, DC; LifeSpan Bioscatics, Inc, Seattle, A; Thiết bị phân tử, Sunnyvale, CA; Tập đoàn Giải pháp Khoa học Olympus Châu Mỹ, Waltham, MA; PhoenixSongs Biologicals (PSB), Branford, CT; Khoa học đa khoa, Inc, Warrington, PA; Qiagen, Germantown, MD; Hệ thống R&D, Minneapolis, MN; RayBiotech, Norcross, GA; Roche Chẩn đoán, Mannheim, Đức; Công nghệ sinh học Santa Cruz, Inc), Dallas, TX; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; Sofregen, Medford, MA; Takara, Otsu, Nhật Bản; Công ty Nghiên cứu Tousimis, Rockville, MD; Phòng thí nghiệm Nghiên cứu Tam giác (TRL), Công viên Tam giác Nghiên cứu, NC; Umetrics, Umea, Thụy Điển; Varian Medical Systems, Inc), Palo Alto, CA; Phòng thí nghiệm Vector, Burlingame, CA; Khoa học VWR, Radnor, PA.

Các tuyên bố đạo đức tóm tắt cách các động vật được duy trì. Tất cả các thí nghiệm trên động vật đều được thực hiện theo đúng quy định của Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thể chế đã được phê duyệt của Đại học Bang North Carolina (NCSU) ở Raleigh và tại Đại học North Carolina (UNC) ở Chapel Hill và do đó đã tuân theo các nguyên tắc được nêu trong Tuyên bố của Helsinki cho tất cả các cuộc điều tra thử nghiệm trên người hoặc động vật. Tất cả các quy trình được sử dụng trong nghiên cứu trên động vật và những quy trình liên quan đến việc sử dụng mô người đã được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thể chế (IACUC) và Ủy ban Đánh giá Thể chế (IRB) ở cả hai tổ chức: UNC và tại Trường Cao đẳng Thú y tại NCSU . Các số phê duyệt của IACUC là 16-316.0 và 17-225.0. Các nghiên cứu về tế bào người trong dự án này đã được đánh giá bởi ủy ban IRB và được cung cấp số phê duyệt của IRB là 97-1063.

Các mẫu người bao gồm thông tin về từng mẫu cộng với thông tin chung cho tất cả các mẫu và được cung cấp chi tiết trong các nghiên cứu trước đây:^39,41,42

Mô gan của thai nhi được cung cấp bởi một cơ quan được công nhận (Advanced Biological Resources, San Francisco, CA) từ các thai nhi từ 18 đến 22 tuần tuổi thai thu được bằng cách chấm dứt thai kỳ tự chọn. Đề cương nghiên cứu đã được IRB xem xét và phê duyệt cho Nghiên cứu Nghiên cứu Con người tại UNC. Tất cả các mẫu đều được sàng lọc các mầm bệnh khác nhau và chỉ những mẫu không có mầm bệnh này mới được chấp nhận cho các nghiên cứu.

Gan sau khi sinh được lấy từ những người hiến tặng sơ sinh, trẻ em và người lớn đã chết và được lấy thông qua các chương trình hiến tặng nội tạng thông qua UNOS. Những người được sử dụng cho các nghiên cứu này được coi là bình thường không có bằng chứng về quá trình bệnh bao gồm cả việc sàng lọc mầm bệnh sau đây. Việc sử dụng gan cho mục đích nghiên cứu đã nhận được sự đồng ý có hiểu biết từ người thân, các quy trình đã nhận được sự chấp thuận của IRB và quá trình xử lý tuân thủ Thực hành sản xuất tốt.

Các mẫu lợn được lấy từ động vật được bảo quản tại các cơ sở của Trường Đại học Thú y thuộc Đại học Bang Bắc Carolina (NCSU, Raleigh, NC). Một số trong số chúng đã được sử dụng làm vật chủ hoặc làm vật hiến tặng cho các tế bào. Các ca phẫu thuật, khám nghiệm tử thi và thu thập tất cả các chất lỏng và mô sinh học đã được thực hiện tại các cơ sở này.

Vật chủ của lợn được sử dụng để ghép là hỗn hợp của sáu giống khác nhau: con lai sáu đường bao gồm Yorkshires, Large Whites, Landraces (từ lợn nái), Durocs, Spots và Pietrans (từ lợn đực). Nền tảng di truyền rất không đồng nhất này là mong muốn ở chỗ nó tương đồng với cấu trúc di truyền không đồng nhất của quần thể người⁶⁵. Vật chủ đều là giống cái, ~ 6 tuần tuổi và ~ 15 kg.

Protein huỳnh quang màu xanh lá cây (GFP)⁺ lợn chuyển gen hiến tặng được thành lập mang gen chuyển H2B histone-eGFP. GFP⁺ vật hiến tặng thu được bằng cách nhân giống lợn đực H2B-GFP biến đổi gen với lợn nái hậu bị kiểu hoang dã bằng cách thụ tinh nhân tạo tiêu chuẩn⁶⁶. Mô hình được phát triển thông qua sửa chữa định hướng tương đồng qua trung gian CRISPR-Cas9 (HDR) của IRES-pH2B-eGFP vào locus-actin (ACTB) nội sinh. Các động vật chuyển gen cho thấy sự biểu hiện phổ biến của pH2B-eGFP trong tất cả các mô. Sự kết hợp của GFP với H2B dẫn đến việc bản địa hóa điểm đánh dấu GFP thành nucleosome và cho phép hình dung hạt nhân rõ ràng cũng như nghiên cứu về động lực học nhiễm sắc thể. Dòng sáng lập đã được phân tích rộng rãi và phổ biến, và biểu hiện cục bộ hóa hạt nhân đã được xác nhận. Ngoài ra, việc nhân giống đã chứng minh sự truyền H2B-GFP sang thế hệ tiếp theo. Tất cả các động vật đều khỏe mạnh và đa thai đã được thiết lập với thế hệ con cháu thể hiện tỷ lệ Mendel dự kiến ​​cho việc truyền pH2B-eGFP. Những con đực được xác định kiểu gen khi mới sinh và những con dương tính với gen chuyển đã được làm chết nhân đạo để thu thập mô và phân lập tế bào của người hiến tặng.

Kiểu gen của động vật lợn đã được thực hiện. Đối với mỗi động vật cho và động vật nhận, locus kháng nguyên bạch cầu lợn lớp I (SLA-I) và lớp II (SLA-II) đã được khuếch đại phản ứng chuỗi polymerase (PCR) bằng cách sử dụng các đoạn mồi được thiết kế để khuếch đại các alen đã biết ở các vùng này dựa trên PCR -chiến lược primer cụ thể theo trình tự¹⁸. Hệ thống bao gồm 47 bộ mồi SLA-I phân biệt khuếch đại các locus SLA-1, SLA-2 và SLA-3 và 47 bộ mồi SLA-II phân biệt khuếch đại các locus DRB1, DQB1 và ​​DQA.⁶⁷. Các bộ mồi này đã được phát triển để phân biệt các alen theo các nhóm chia sẻ các họa tiết trình tự tương tự và đã được hiển thị một cách dễ dàng và rõ ràng để phát hiện các alen SLA-I và SLA-II đã biết. Khi được sử dụng cùng nhau, các bộ mồi này đã cung cấp một kiểu mẫu đơn bội cho từng động vật được thử nghiệm một cách hiệu quả, do đó cung cấp một xét nghiệm để xác nhận dễ dàng một kiểu mẫu đơn bội khớp hoặc không khớp ở động vật cho và nhận.

Các cuộc phẫu thuật trên lợn được thực hiện bằng cách gây mê bằng cách sử dụng kết hợp ketamine/xylazine (2–3 mg/kg trọng lượng mỗi loại) tiêm IV hoặc 20 mg/kg ketamine cộng với 2 g/kg xylazine IM và được duy trì bằng isoflurane trong oxy được quản lý thông qua một đơn vị gây mê khí mạch kín. Trong các mảnh ghép trên gan và các quy trình phẫu thuật tổng quát, những con lợn được đặt ở tư thế nằm ngửa và phần bụng được cắt từ xyphoid đến mu. Da được chuẩn bị vô trùng với các dung dịch tẩy tế bào chết và cồn xen kẽ. Sau khi bước vào phòng phẫu thuật, việc chuẩn bị da được lặp lại bằng kỹ thuật vô trùng và khu vực này được phủ dung dịch iốt tại chỗ trước khi dán màn phẫu thuật vô trùng. Các bác sĩ phẫu thuật đã sử dụng một kỹ thuật vô trùng thích hợp. Một vết rạch giữa bụng được thực hiện qua da, qua các mô dưới da và Linea alba, bắt đầu từ quá trình xiphoid và kéo dài về phía đuôi 8–12 cm. Bộ phận gan trái được bộc lộ, và một miếng ghép 3 × 4.5 cm được áp dụng cho bề mặt bụng của gan và chứa hydrogel hyaluronan 1X (~60 Pa) với các chất hữu cơ BTSC nhúng và đặt trên lớp nền chứa hydrogel hyaluronan 10X (~ 760 Pa); miếng dán được đặt tiếp xúc trực tiếp với bề mặt của bao gan. Miếng ghép được khâu vào gan bằng 4–6 mũi khâu đơn giản, ngắt quãng bằng 4–0 polypropylene. Bề mặt tiếp xúc của mảnh ghép sau đó được xử lý bằng 2 ml hyaluronan hydrogel 2X (~200–300 Pa), mức độ cứng đủ lỏng để cho phép sơn hoặc phủ lên bên ngoài mảnh ghép; nó phục vụ hơn nữa để giảm thiểu sự kết dính từ các mô lân cận. Sau khi đặt mảnh ghép phẫu thuật, Linea alba đã được đóng lại bằng một mũi khâu liên tục đơn giản sử dụng 0-PDS. Các dòng đã bị chặn với 2 mg/kg bupivacain 0.5%, IM. Các mô và da dưới da được đóng lại bằng chỉ khâu liên tục 2–0 PDS và 3–0 Monocryl tương ứng. Chất kết dính mô được đặt trên bề mặt da.

Đối với các mảnh ghép trên tuyến tụy, quy trình phẫu thuật cho lợn sử dụng mảnh ghép có kích thước bất kỳ phù hợp với kích thước của tuyến tụy. Để bộc lộ tuyến tụy, các mũi khâu được đặt ở phần tá tràng xuống. Mảnh ghép được đặt vào đầu tụy và liền kề với tá tràng bằng hydrogel hyaluronan mềm (~60 Pa) có chứa các chất hữu cơ tiếp xúc trực tiếp với tuyến tụy và với hydrogel hyaluronan cứng hơn (~760 Pa) bên trong lớp tơ. ủng hộ. Chúng tôi sử dụng chỉ khâu ở bốn góc (4–0 Prolene); hai mũi khâu góc đầu tiên được đặt ở phần tá tràng xuống; 2 cái còn lại được đặt trong mạc treo và tránh nhu mô tụy (để giảm thiểu bất kỳ xu hướng tự phân hủy nào của tuyến tụy). Bề mặt huyết thanh của mảnh ghép sau đó được phủ bằng hydrogel 2X hyaluronan (~200–300 Pa) để giảm thiểu độ bám dính. Bụng được đóng lại bằng chỉ khâu tự tiêu liên tục (PDS) ở các lớp đường, lớp dưới da và lớp dưới da. Chất kết dính mô đã được sử dụng trên da để tránh khâu da.

Việc ức chế miễn dịch là cần thiết vì việc cấy ghép từ lợn biến đổi gen sang người nhận kiểu hoang dã là dị hợp. Các giao thức ức chế miễn dịch được sử dụng là những giao thức được thiết lập bởi những người khác^68,69. Tất cả lợn được uống thuốc ức chế miễn dịch, Tacrolimus (0.5 mg/kg) và Mycophenolate (500 mg) hai lần mỗi ngày, bắt đầu 24 giờ trước khi phẫu thuật. Các loại thuốc được đưa ra liên tục trong toàn bộ thời gian thử nghiệm. Những thứ này có thể được đưa cho động vật một cách dễ dàng nếu trộn với thức ăn yêu thích của chúng.

Việc phân lập các mô bình thường được thực hiện từ heo con mới sinh và heo lớn hơn, 12 tuần tuổi. Lợn con sơ sinh nặng ~10 lbs; những con lợn lớn hơn, 12 tuần tuổi, nặng ~50–60 lbs. Những con lợn đã bị hy sinh bằng cách thâm nhập vào cái chết êm dịu trong điều kiện nuôi nhốt, sau đó là sự mất máu ở cổ. Phương pháp này đáp ứng các hướng dẫn khuyến nghị của Hiệp hội Y tế Thú y Hoa Kỳ về trợ tử cho lợn⁶⁵. Một danh sách các nhà tài trợ được sử dụng cho các mô mật từ lợn con hoặc lợn trưởng thành được đưa ra trong Bảng bổ sung 4.

Tất cả môi trường được lọc vô trùng (bộ lọc 0.22 µm) và giữ trong bóng tối ở 4°C trước khi sử dụng. Môi trường cơ bản và huyết thanh bò bào thai (FBS) được mua từ GIBCO/Invitrogen. Tất cả các yếu tố tăng trưởng đã được mua từ Hệ thống R&D. Tất cả các thuốc thử khác, ngoại trừ những thuốc thử đã lưu ý, được lấy từ Sigma.

Dung dịch đệm rửa tế bào bao gồm 500 ml môi trường cơ bản (ví dụ: RPMI 1640; Gibco # 11875-093) được bổ sung 0.5 g albumin huyết thanh (Sigma, # A8896-5G, không chứa axit béo), 10^-9 M selen và 5 ml thuốc kháng sinh (Gibco #35240-062, AAS). Nó được sử dụng để rửa các mô và tế bào trong quá trình chế biến.

Dung dịch đệm collagenase bao gồm 100 ml dung dịch rửa tế bào được bổ sung collagenase (Sigma # C5138) với nồng độ cuối cùng là 600 U/ml (R1451 25 mg) đối với mô cây mật (ống dẫn) và 300 U/ml (12.5 mg) đối với các cơ quan ( ví dụ như gan).

Kubota's Medium, một môi trường hoàn toàn xác định, không có huyết thanh được thiết kế ban đầu cho nguyên bào gan⁷⁰, và sau đó thấy thành công trong việc duy trì tế bào gốc cây mật, tế bào gốc gan, tế bào gốc tuyến tụy và tế bào tiền thân (và sau đó thấy thành công nói chung đối với tất cả tế bào gốc/tế bào gốc nội bì được đánh giá), được sử dụng để chuẩn bị huyền phù tế bào, chất hữu cơ, và hydrogel hyaluronan. Môi trường này bao gồm bất kỳ môi trường cơ bản nào (ở đây là RPMI 1640) không có đồng, canxi thấp (0.3 mM), selen 1 nM, albumin huyết thanh 0.1% (tinh khiết, không có axit béo; phần V), nicotinamide 4.5 mM, 0.1 nM kẽm sulfat heptahydrat, 5 µg/ml transferrin/Fe, 5 µg/ml insulin, 10 µg/ml lipoprotein tỷ trọng cao và hỗn hợp axit béo tự do tinh khiết được tạo phức với albumin tinh khiết cao, không chứa axit béo . Hỗn hợp axit béo tự do bao gồm axit palmitic, axit palmitoleic, axit stearic, axit oleic, axit linoleic và axit linolenic. Môi trường của Kubota có sẵn trên thị trường từ PhoenixSongs Sinh học (Branford, CT).

Hyaluronans (HA) được sử dụng bao gồm các dạng HA chuỗi dài, hòa tan (Danh mục Sigma #52747) và được sử dụng để ổn định môi trường nuôi cấy dạng hữu cơ và bảo quản lạnh huyền phù tế bào^71,72. Những chất được sử dụng để tạo ra hydrogel, HA biến đổi thiol, được lấy từ Glycosan Bioscatics, trước đây là công ty con của Lineage Cell Therapeutics (Alameda, CA), và hiện được cung cấp ở dạng cấp độ phi lâm sàng từ Advanced Biomatrix (Carlsbad, CA) và ở dạng cấp độ lâm sàng từ Sentrex Animal Care (Salt Lake City, UT) (G. Prestwich, thông tin liên lạc cá nhân). Các thành phần của các HA biến đổi thiol này được tạo ra bằng quy trình lên men vi khuẩn độc quyền bằng cách sử dụng Bacillus subtilis với tư cách là chủ nhà trong quy trình ISO 9001:2000 (www.biopolymer.novozymes.com/). Các thành phần được sản xuất bởi Novozymes dưới tên thương mại là HyaCare®, và 100% không chứa nguyên liệu có nguồn gốc động vật và dung môi hữu cơ còn sót lại. Không có thành phần có nguồn gốc động vật nào được sử dụng trong quá trình sản xuất; có hàm lượng protein rất thấp và không có nội độc tố. Việc sản xuất tuân theo các tiêu chuẩn do Dược điển Châu Âu quy định. Hydrogel HA được điều chế bằng cách sử dụng Glycosil (HyStem® HAs, ESI BIO-CG313), HA biến đổi thiol có thể được kích hoạt để tạo thành các cầu nối disulfua khi có mặt oxy hoặc bằng cách tạo liên kết thio-ete bằng cách sử dụng polyetylen glycol diacrylate (PEGDA ). Glycosil® được hoàn nguyên dưới dạng dung dịch 1% HA đã được lọc trong dung dịch muối đệm phốt phát 1% (PBS) bằng cách sử dụng nước đã khử khí, hoặc trong trường hợp của chúng tôi là trong Môi trường Kubota không có huyết thanh. Sau khi hoàn nguyên, nó vẫn ở dạng lỏng trong vài giờ nhưng có thể trải qua một số quá trình tạo gel nếu tiếp xúc với oxy. Quá trình tạo gel chính xác hơn xảy ra mà không thay đổi nhiệt độ hoặc pH nếu Glycosil được xử lý bằng chất liên kết chéo như PEGDA khiến quá trình tạo gel xảy ra trong vòng vài phút^73,74,75,76.

Mức độ liên kết chéo là yếu tố chính góp phần vào mức độ cứng (độ nhớt) hoặc độ cứng và có thể được kiểm soát bằng cách điều chỉnh tỷ lệ của các hyaluronan biến tính thiol với PEGDA⁷⁶. Trong các nghiên cứu trước đây, các quần thể tế bào gốc gan đã được thử nghiệm trong hydrogel HA với các mức độ cứng khác nhau và được phát hiện là vẫn tồn tại dưới dạng tế bào gốc, cả về mặt kháng nguyên và chức năng (ví dụ: về khả năng di chuyển và biểu hiện của các gen liên quan đến tế bào gốc chẳng hạn như gen đa năng và ma trận metallicoproteinase), chỉ khi mức độ cứng nhắc nhỏ hơn ~100 Pa⁷⁶. Chúng tôi đã sử dụng phát hiện này để thiết kế các mảnh ghép có lớp mềm (~100 Pa trở xuống) để nhúng các chất hữu cơ của BTSC và với các lớp hydrogel hyaluronan cứng hơn (~700 Pa) ở lớp nền để tạo thành rào cản di chuyển theo các hướng khác hơn mô đích cũng như những mô có mức độ cứng trung bình (~200–300 Pa) để giảm thiểu độ bám dính.

Các đặc tính lưu biến quy mô vĩ mô của hydrogel hyaluronan được xác định bằng cách sử dụng máy đo lưu biến hình nón và tấm kiểm soát ứng suất (Dụng cụ TA, AR-G2, đường kính hình nón 40 mm, góc 1°). Gel tích cực polyme hóa trên máy đo lưu biến trong khi dao động ở tần số 1 rad/s và biên độ ứng suất 0.6 Pa với mô đun được theo dõi liên tục để truy vấn mức độ hoàn thành đầy đủ của các phản ứng liên kết ngang. Sau khi được cân bằng, các hydrogel được quét tần số dao động (biên độ ứng suất: 0.6 Pa, dải tần: 0.01–100 Hz).

Việc chuẩn bị các tế bào được thực hiện từ mô cây mật ngoài gan (túi mật, ống thông thường, ống gan) thu được từ lợn [hoặc từ mô người]. Đối với các mô được sử dụng để tạo ra các chất hữu cơ của các tế bào bình thường, các mô được đập bằng một cái vồ bằng thép không gỉ, đã khử trùng để loại bỏ các tế bào nhu mô, cẩn thận giữ mối liên kết của các ống dẫn mật trong và ngoài gan. Cây mật sau đó được rửa bằng dung dịch đệm “rửa tế bào” bao gồm môi trường cơ bản vô trùng, không có huyết thanh được bổ sung kháng sinh, albumin huyết thanh 0.1% và selen 1 nM (10^-9 M). Sau đó, nó được phân tách cơ học bằng dao mổ chéo, và các tập hợp này được phân tán bằng enzym thành huyền phù tế bào trong RPMI-1640 được bổ sung 0.1% albumin huyết thanh bò (BSA) [hoặc đối với mô người, albumin huyết thanh người, HAS], 1 nM selen, 300 U/ml collagenase loại IV, 0.3 mg/ml deoxyribonuclease (DNAse) và kháng sinh. Quá trình phân hủy được thực hiện ở 32 ° C với sự khuấy trộn thường xuyên trong 30–60 phút. Hầu hết các mô yêu cầu hai vòng tiêu hóa, sau đó ly tâm ở 1100 vòng / phút ở 4 ° C. Các viên tế bào đã được kết hợp và treo lại trong quá trình rửa tế bào. Huyền phù tế bào được ly tâm ở 30 ×g trong 5 phút ở 4°C để loại bỏ hồng cầu. Các viên tế bào một lần nữa được tái tạo huyền phù trong quá trình rửa tế bào và được lọc qua bộ lọc tế bào nylon 40 µm (Becton Dickenson Falcon #352340) với quá trình rửa tế bào mới. Số lượng tế bào đã được xác định và khả năng tồn tại được đánh giá bằng Trypan Blue. Khả năng tồn tại của tế bào trên 90–95% được quan sát thường xuyên.

Sự hình thành các chất hữu cơ được thực hiện từ huyền phù tế bào được thêm vào các đĩa nuôi cấy tế bào đáy phẳng, nhiều giếng (Corning #353043) trong môi trường Kubota không có huyết thanh và được ủ trong ~ một giờ ở 37°C để tạo điều kiện thuận lợi cho sự gắn kết của các tế bào trung mô trưởng thành (ví dụ: mô đệm trưởng thành , tế bào hình sao trưởng thành). Các tế bào trung mô trưởng thành được gắn vào các đĩa trong vòng ~ 15 phút mặc dù môi trường không có huyết thanh. Các tế bào chưa trưởng thành còn lại ở trạng thái lơ lửng và được chuyển sang một đĩa khác và được ủ lại trong tối đa một giờ. Điều này được lặp đi lặp lại nhiều lần để đảm bảo sự cạn kiệt của một phần đáng kể các tế bào trung mô trưởng thành. Sau khi cạn kiệt các tế bào trung mô trưởng thành, các tế bào nổi còn lại được gieo vào ~ 2 × 10⁵ tế bào trên mỗi giếng trong môi trường Kubota không có huyết thanh trong các đĩa đính kèm siêu nhẹ của Corning (Corning #3471) và được ủ qua đêm ở 37°C trong CO₂ lồng ấp. Các cơ quan bao gồm các tế bào gốc của cây mật (BTSC) hợp tác với các tế bào trung mô giai đoạn đầu của dòng dõi (ELMSC) được hình thành qua đêm. Các ELMSC được tìm thấy nhờ sự biểu hiện của các kháng nguyên bề mặt cụ thể của chúng là các nguyên bào mạch (CD117⁺, CD31^-, VEGFr⁺) và tiền thân của endothelia (CD31⁺, VEGFr⁺) và để xếp ô hình sao (ICAM-1⁺, CD146⁺). Các đặc tính mở rộng hơn của các ELSMC này đã được thực hiện và các phát hiện đã được công bố trước đây^77,78. Nuôi cấy dạng hữu cơ tồn tại nhiều tuần trong môi trường Kubota, đặc biệt nếu môi trường được bổ sung (0.1%) các dạng hyaluronan (Sigma) hòa tan.

Các tế bào cũng có thể được bảo quản lạnh như mô tả dưới đây. Từ mỗi gam mô cây mật lợn, chúng tôi thu được ~1.5 × 10⁷ tế bào. Chúng tôi đã sử dụng ~3–6 × 10⁵ các tế bào trên mỗi giếng của đĩa 6 giếng, cực thấp và được ủ trong môi trường Kubota không có huyết thanh. Trung bình, các tế bào tạo ra 6000–20,000 cơ quan nhỏ (~50–100 tế bào/cơ quan/giếng). Đối với các mảnh ghép, chúng tôi đã sử dụng ít nhất 100,000 organoids (>10⁷ tế bào). Tùy thuộc vào kích thước của lớp nền, chúng tôi có thể tăng số lượng organoids trong các mảnh ghép lên đến> 10⁸ các chất hữu cơ (tức là ~10⁹ tổng số tế bào) hoặc nhiều hơn được nhúng trong ~1 ml hydrogel hyaluronan mềm trên lớp nền 3 cm × 4.5 cm.

Bảo quản lạnh thân cây/tế bào tiền thân được thực hiện thành công nhất bằng cách bảo quản lạnh các tế bào bị cô lập hoặc các tập hợp tế bào nhỏ đã được xử lý theo quy trình cắt lọc để giảm thiểu số lượng tế bào trung mô trưởng thành. Người ta có thể bảo quản lạnh hỗn hợp thân/tế bào tiền thân và các tế bào trung mô giai đoạn đầu của dòng dõi trong Cryostor10, một chất đệm bảo quản lạnh đẳng trương có chứa các yếu tố chống đông, dextran và DMSO (Bioliife, Seattle, WA). Khả năng tồn tại của các tế bào được cải thiện hơn nữa khi bổ sung 0.1% HA (Sigma #52747)^71,72. Khả năng tồn tại cao nhất của các chất hữu cơ là khi được điều chế từ huyền phù tế bào mới rã đông, được bảo quản lạnh; khả năng tồn tại thấp hơn đã được quan sát với các chất hữu cơ được hình thành đầy đủ, được bảo quản lạnh. Quá trình bảo quản lạnh được thực hiện bằng CryoMed™ Controlled-Rate Freezers. Khả năng tồn tại khi tan băng lớn hơn 90% đối với những chất được bảo quản lạnh dưới dạng huyền phù tế bào và sau đó, khi tan băng, được sử dụng để tạo thành các chất hữu cơ^71,72.

Ghép mảnh là phương pháp mới được thiết lập nhanh chóng để ghép số lượng lớn (ví dụ: >10⁸th) các chất hữu cơ vào các cơ quan rắn và để các chất hữu cơ tích hợp hoàn toàn bên trong các cơ quan trong vòng một tuần và trưởng thành thành các tế bào trưởng thành trong một tuần nữa. Các chi tiết khác về logic, chiến lược và phương pháp để ghép các chất hữu cơ vào các cơ quan rắn được đưa ra trong các ấn phẩm trước đây của chúng tôi^54,55. Các mảnh ghép được hình thành bằng cách sử dụng lớp nền, Contour Seri-silk (Sofregen, Medford, MA), trên đó được đặt các chất hữu cơ gốc/tổ tiên được nhúng trong hydrogel hyaluronan mềm (~50–100 Pa). Những thứ này đã được chuẩn bị sẵn sàng trước thời hạn và được duy trì trong đĩa nuôi cấy trong tủ ấm qua đêm. Việc không thành công với những nỗ lực bảo quản lạnh các chất hữu cơ trong hydrogel mềm có nghĩa là việc nhúng các chất hữu cơ vào hydrogel mềm phải được thực hiện ngay trước khi phẫu thuật để gắn các mảnh ghép.

Cập nhật: Chúng tôi được biết rằng Contour Seri-silk không còn có sẵn từ nhà sản xuất. Vật liệu nền dựa trên amnion, chẳng hạn như vật liệu từ Vivex Biologics (Miami, FL), sẽ cung cấp chất thay thế thích hợp và là vật liệu cấy ghép được FDA chấp thuận cho các mục đích lâm sàng hoặc phi lâm sàng. Những thứ này sẽ cung cấp hỗ trợ cơ học đầy đủ cho các mảnh ghép và được giả thuyết là có tác dụng trung tính hợp lý đối với các chất hữu cơ của người hiến tặng; điều này rất quan trọng để đảm bảo rằng các chất hữu cơ giữ lại các đặc điểm tế bào gốc của chúng, cho phép chúng biểu hiện các metallicoproteinase ma trận (MMP) cần thiết cho quá trình cấy ghép và di cư⁵⁴. Việc sử dụng lâm sàng các chất nền có nguồn gốc từ màng ối như vậy đã được thảo luận bởi những người khác trong một bài đánh giá gần đây⁷⁹. Người ta cho rằng hydrogel hyaluronan cứng hơn (~700 Pa) sẽ không cần thiết do chất nền hóa học phức tạp trong màng ối sẽ đóng vai trò là rào cản. Tuy nhiên, người ta đưa ra giả thuyết rằng sau khi buộc vào vị trí mục tiêu, hàng rào ma trận màng ối vẫn có thể yêu cầu phủ hyaluronan ở cả hai mặt và hyaluronan được điều chế bằng Môi trường Kubota không có huyết thanh và ở mức độ cứng trung bình (~200–300 Pa ). Lớp phủ ở mặt thanh mạc tại thời điểm phẫu thuật sẽ giảm thiểu sự bám dính vào các mô lân cận.

Đối với các quy trình khám nghiệm tử thi, tất cả các động vật đều được tiêu hủy một cách nhân đạo tại thời điểm được chỉ định bằng cách gây mê bằng Ketamine/Xylazine và gây mê bằng isofluorane, sau đó là tiêm tĩnh mạch một liều natri pentobarbital gây chết người. Sau khi xác nhận cái chết, thân thịt được mổ xẻ cẩn thận, và các cơ quan mục tiêu được loại bỏ, và đặt trong Kubota's Medium được làm lạnh để vận chuyển đến phòng thí nghiệm. Ngoài gan, phổi, tim, thận và lá lách cũng được thu thập và cố định trong 10% formalin trung tính.

Mô học được thực hiện trên các phần mô mới được mổ xẻ từ lợn hoặc các mảnh ghép trên gan hoặc tuyến tụy đã được cố định bằng 4% paraformaldehyde (PFA) và sau đó được nhúng parafin. Các phần năm micron đã được cắt và nhuộm bằng hematoxylin-eosin để phân tích mô học thông thường. Các mô thu được từ lợn sơ sinh cũng được chuẩn bị dưới dạng mẫu (gan, tuyến tụy, cây mật và tá tràng) trong các khối parafin lớn để tạo điều kiện phân tích các kết nối trong cây mật và hệ thống ống tụy.

Hóa mô miễn dịch (IHC) đã được sử dụng để phân tích các dấu hiệu và đặc điểm khác nhau. Đối với nhuộm huỳnh quang miễn dịch, các phần đông lạnh 5 μm hoặc tế bào nuôi cấy đã được cố định với 4% paraformaldehyde (PFA) trong 20 phút ở nhiệt độ phòng, rửa sạch bằng PBS, chặn bằng huyết thanh dê 10% trong PBS trong 2 giờ và rửa sạch. Các tế bào cố định được ủ với các kháng thể sơ cấp ở 4°C trong 14 giờ, rửa sạch, ủ trong 1 giờ với các kháng thể thứ cấp đặc hiệu cho kiểu mẫu được đánh dấu, rửa sạch và nhuộm màu với 4´,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) để hình dung nhân tế bào và được xem bằng kính hiển vi đảo ngược Leica DMIRB (Leica, Houston, TX) hoặc Zeiss ApoTome Axiovert 200 M (Carl Zeiss Inc, Thornwood, NY).

Đối với IHC, các mô được cố định trong 4% PFA qua đêm và được bảo quản trong 70% ethanol. Chúng được nhúng trong parafin và cắt thành các phần 5 μm. Sau khi khử paraffin, quá trình thu hồi kháng nguyên được thực hiện với dung dịch đệm natri citrate (pH 6.0) hoặc dung dịch đệm axit ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (pH 8.0) trong nồi hấp trong 20 phút. Peroxidase nội sinh đã bị chặn bằng cách ủ trong 15 phút trong 3% H₂O₂. Các phần được ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng với bộ dụng cụ nhuộm peroxidase ImmPRESS và chất nền 3,3'-diaminobenzidine (Phòng thí nghiệm Vector). Các phần được chống lại bằng hematoxylin. Các kháng thể được sử dụng được liệt kê trong Bảng bổ trợ 1.

Việc tinh chế quần thể tế bào cho các nghiên cứu di truyền rất quan trọng đối với các phân tích khác nhau. Độ tinh khiết của các quần thể phụ được phân lập được quyết định bởi sự kết hợp của các chiến lược để phân lập các tế bào. Các tế bào gan trưởng thành được phân lập mới từ gan lợn sơ sinh so với gan của trẻ sơ sinh, trẻ em và người trưởng thành bằng cách tiêu hóa collagenase tiêu chuẩn và phân đoạn percoll⁸⁰. Các phần tế bào gan trưởng thành bị cô lập (những phần có đường kính trung bình trên 17 µm) được rửa trong RPMI1640 được bổ sung 2% huyết thanh để làm bất hoạt các enzym được sử dụng để phân lập tế bào; sau đó được xử lý bằng nhiều vòng rửa bằng môi trường RPMI 1640 không có huyết thanh; và cuối cùng, đóng băng nhanh chóng bằng cách sử dụng nitơ lỏng. Các tế bào không được nuôi cấy.

Các tiểu quần thể của thân cây/tế bào tiền thân, cả người và lợn, được điều chế từ các tế bào mới phân lập từ cây đường mật của thai nhi hoặc trẻ sơ sinh (tế bào gốc cây mật), từ gan của thai nhi hoặc trẻ sơ sinh (tế bào gốc gan và nguyên bào gan), hoặc của thai nhi hoặc trẻ sơ sinh. tuyến tụy (tế bào gốc tuyến tụy và tiền thân ống); được tinh chế bằng sự kết hợp của chọn lọc miễn dịch đối với các kháng nguyên bề mặt, cho phép phân lập các quần thể tế bào riêng biệt^39,41,50,54. bảng phụ 5 tóm tắt các dấu hiệu của các quần thể phụ đã được mô tả rộng rãi, đặc biệt là trong các nghiên cứu trước đây^{31,32,33,38,39,40,41,42,43,49,50}.

Các tế bào được chọn lọc miễn dịch đã lơ lửng trong Môi trường Kubota không có huyết thanh⁸¹, được thiết kế cho các tế bào gốc nội bì và được cấy vào các đĩa nuôi cấy có độ bám dính thấp trong 6–12 giờ cho phép hình thành các chất hữu cơ. Các cơ quan hình thành trong 6–12 giờ đó bao gồm các tế bào gốc nội mô hợp tác với các tế bào trung mô giai đoạn đầu của dòng dõi: nguyên bào mạch và tiền thân của tế bào nội mô và tế bào hình sao (lưu ý: các tế bào trung mô trưởng thành được giảm thiểu bởi quá trình chọn lọc miễn dịch như được biểu thị bằng sự cạn kiệt của các tế bào kháng nguyên bề mặt cho các tế bào trung mô và tạo máu trưởng thành).

Phân tích trình tự RNA và biểu hiện gen bao gồm RNA được tinh chế bằng cách sử dụng Qiagen RNeasy Kit từ gan, tuyến tụy, túi mật và mô cây mật trưởng thành của lợn (hoặc người) và từ huyền phù tế bào phân lập của tế bào gan (AHeps), tế bào gốc gan (HpSCs), tế bào gốc cây mật (BTSCs), mỗi tế bào từ ba người hiến tặng khác nhau cho tế bào người và năm người hiến tặng khác nhau cho tế bào lợn (Bảng bổ trợ 6 và 7). Các phân tích kiểm soát chất lượng và thu thập dữ liệu RNA-seq đã được mô tả cụ thể trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi⁵². Đường ống LIMMA (phiên bản 3.50.1) đã được sử dụng để xác định các gen được biểu hiện khác nhau (DEG). Hồ sơ biểu hiện gen được so sánh bằng cách sử dụng các phân tích tương quan của Pearson và Spearman. Phân tích thành phần chính (PCA) và phân cụm theo cấp bậc đã được thực hiện trong R (phiên bản R 4.1.0).

Phiên mã ngược định lượng và phản ứng chuỗi polymerase được thực hiện bằng cách sử dụng RNA tổng số từ các tế bào. Tổng RNA được chiết xuất từ ​​​​các tế bào bằng Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). CDNA chuỗi đầu tiên được tổng hợp bằng cách sử dụng bộ tổng hợp cDNA chuỗi 1 của Prime script (Takara, Otsu, Nhật Bản) đã được sử dụng làm khuôn mẫu để khuếch đại PCR. Các phân tích định lượng về mức độ mRNA được thực hiện bằng Faststart Universal Probe Master (R oche Diagnostics, Mannheim, Đức) với Hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). Các đoạn mồi được thiết kế với Trung tâm thiết kế thử nghiệm thư viện thăm dò toàn cầu (Khoa học ứng dụng Roche). Trình tự mồi được liệt kê trong Bảng bổ trợ 4a. Các đoạn mồi được ủ ở 50 ° C trong 2 phút và 95 ° C trong 10 phút, sau đó là 40 chu kỳ 95 ° C (15 giây) và 60 ° C (1 phút). Biểu hiện của glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) thường được sử dụng làm chất chuẩn.

Phân tích thống kê

Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các mẫu được tính toán bằng cách sử dụng 2 đuôi của Sinh viên t-test và kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ± SD. P các giá trị <0.05 được coi là có ý nghĩa thống kê.

Tóm tắt báo cáo

Thông tin thêm về thiết kế nghiên cứu có sẵn trong Tóm tắt báo cáo danh mục đầu tư tự nhiên liên kết đến bài viết này.

• Phân phối nội dung và PR được hỗ trợ bởi SEO. Được khuếch đại ngay hôm nay.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. Trao quyền cho chính mình. Truy cập Tại đây.
• PlatoAiStream. Thông minh Web3. Kiến thức khuếch đại. Truy cập Tại đây.
• Trung tâmESG. Ô tô / Xe điện, Than đá, công nghệ sạch, Năng lượng, Môi trường Hệ mặt trời, Quản lý chất thải. Truy cập Tại đây.
• BlockOffsets. Hiện đại hóa quyền sở hữu bù đắp môi trường. Truy cập Tại đây.
• nguồn: https://www.nature.com/articles/s41536-023-00303-5