Chuẩn bị vật liệu và đặc tính

Dung dịch nước GO được pha loãng trong nước khử ion để thu được 0.15 mg ml^-1 dung dịch và lọc chân không qua màng nitrocellulose có lỗ chân lông 0.025 m, tạo thành màng mỏng GO. Sau đó, màng mỏng được chuyển sang chất nền đích bằng cách chuyển ướt trong nước khử ion và ủ nhiệt tiếp ở 100 °C trong 2 phút. Ngăn xếp chất nền màng GO được khử thủy nhiệt ở 134 °C trong nồi hấp tiêu chuẩn trong 3 h để tạo thành EGNITE. Chất nền cơ bản cho tất cả các nghiên cứu đặc tính của EGNITE là hình vuông (1 × 1 cm²) của Si/SiO₂ (400 mm/1 mm).

XPS

Các phép đo XPS được thực hiện bằng máy phân tích Phoibos 150 (SPECS) trong điều kiện chân không cực cao (áp suất cơ bản, 5 × 10^-10 mbar) với nguồn tia X đơn sắc Al Kα (1,486.74 eV). Phổ tổng quan thu được với năng lượng truyền qua là 50 eV và kích thước bước là 1 eV và phổ có độ phân giải cao thu được với năng lượng truyền qua là 20 eV và kích thước bước là 0.05 eV. Độ phân giải tổng thể trong các điều kiện cuối cùng đó là 0.58 eV, được xác định bằng cách đo toàn bộ chiều rộng ở mức tối đa một nửa của Ag 3d5/2 đỉnh bạc phun. Phân tích XPS cho thấy sự giảm mạnh sau khi xử lý thủy nhiệt đỉnh C–O (liên kết với các nhóm epoxit), nhưng có sự đóng góp nhỏ của C–OH, C=O và C(O)OH do hydroxyl, cacbonyl và cacboxyl còn lại sau khi giảm. Sự giải mã của O1s đỉnh xác nhận hành vi như vậy. Đóng góp chính cho C1s Tuy nhiên, tín hiệu sau khi giảm thủy nhiệt đến từ sp² quỹ đạo lai C–C^34,57.

Nhiễu xạ tia X

Đo nhiễu xạ tia X (θ-2θ scan) được thực hiện trong Máy đo nhiễu xạ nghiên cứu vật liệu (Malvern PANalytical). Máy đo nhiễu xạ này có dạng nằm ngang ω-2θ máy đo góc (bán kính 320 mm) ở dạng hình học bốn vòng tròn và làm việc với ống tia X bằng gốm với cực dương Cu Kα (λ = 1.540598 Å). Máy dò được sử dụng là Pixcel, một máy dò tia X nhanh dựa trên công nghệ Medipix2.

Quang phổ Raman

Các phép đo quang phổ Raman được thực hiện bằng máy quang phổ Witec được trang bị vạch kích thích laser 488 nm. Đối với các phép đo, phổ Raman thu được bằng cách sử dụng vật kính 50 × và cách tử 600 rãnh trên mỗi nm; công suất laser được giữ ở mức dưới 1.5  mW để tránh làm nóng mẫu.

TEM

Một lamella chùm tia ion tập trung đã được chuẩn bị bằng Helios NanoLab DualBeam (LMA-INA) để nghiên cứu cắt ngang của mẫu EGNITE. Các phân tích cấu trúc được thực hiện bằng phương pháp TEM sử dụng kính hiển vi Tecnai F20 hoạt động ở 200 kV, bao gồm HRTEM và kỹ thuật STEM trường tối hình khuyên góc cao. Thí nghiệm STEM-EELS được thực hiện trong kính hiển vi Tecnai F20 hoạt động ở 200 KeV, với khẩu độ 5 mm, chiều dài camera 30 mm, góc hội tụ 12.7 mrad và góc thu 87.6 mrad. Vì chúng tôi sử dụng 0.5 eV trên mỗi pixel và 250 eV làm năng lượng ban đầu trong quá trình thu nhận tổn thất lõi, nên chúng tôi đã không thu được cạnh Si K như mong đợi ở 1,839 eV, cạnh Pt M ở 2,122 eV và cạnh Au M ở 2,206 eV. Thành phần nguyên tử C–O tương đối đã thu được bằng cách tập trung sự chú ý của chúng ta vào lớp GO đã khử và giả sử rằng các cạnh được phân tích (C và O trong trường hợp của chúng ta) có tổng bằng 100%. Giả định này có giá trị trong trường hợp của chúng tôi như được chứng minh trong Thông tin bổ sung bản đồ. Mặt cắt ngang chênh lệch năng lượng được tính toán bằng mô hình Hartree–Slater và nền sử dụng mô hình công suất thấp.

Tinh dân điện

Các phép đo độ dẫn điện được thực hiện bằng máy đo nguồn Keithley 2400 ở cấu hình hai điểm. Các mẫu được đo bao gồm các màng EGNITE có kích thước 1 × 1 cm² trên đỉnh SiO₂ chất nền.

Phân tích dữ liệu

Dữ liệu nhiễu xạ tia X, Raman và XPS được phân tích bằng gói Python 3.7 (Numpy, Pandas, Scipy, Xrdtools, Lmfit, Rampy, Peakutils, Matplotlib). Khoảng cách giữa các mặt phẳng được tính từ phép đo nhiễu xạ tia X theo định luật Snell. Khi dữ liệu được chuyển vào miền không gian, mức tối đa của các đỉnh sẽ được trang bị. Khoảng cách tương ứng cho giá trị trung bình của khoảng cách giữa các mặt phẳng. Độ lệch so với các giá trị trung bình đó được tính toán từ toàn bộ chiều rộng ở mức tối đa một nửa của các phụ kiện Lorentzian của các đỉnh trên miền không gian. Các phép đo phổ XPS và Raman được phân tích bằng cách ghép các đỉnh tích chập vào các vị trí dự kiến ​​cho các đặc điểm tương ứng. Các giá trị độ dẫn điện của GO và EGNITE thu được bằng cách lắp I–V các đường cong được đo trong phép đo độ dẫn điện theo định luật Ohm. Dữ liệu là n = 1 cho mỗi lần đo.

Chế tạo mảng linh hoạt

Việc chế tạo các thiết bị được thể hiện trong Hình bổ sung. 4. Thiết bị được chế tạo trên Si/SiO 4 inch₂ Tấm wafer (400 μm/1 μm). Đầu tiên, lớp PI dày 10 µm (PI-2611, HD MicroSystems) được quay phủ trên tấm bán dẫn và nung trong môi trường giàu nitơ ở nhiệt độ 350 °C trong 30 phút. Các dấu vết kim loại được tạo khuôn bằng phương pháp in thạch bản quang học của chất quang dẫn đảo ngược hình ảnh (AZ5214, Microchemicals). Sự bay hơi chùm tia điện tử được sử dụng để lắng đọng 20 nm titan và 200 vàng và thực hiện quá trình nâng lên. Chúng tôi đã sử dụng màng EGNITE có độ dày khoảng 1 μm để cân bằng giữa hiệu suất điện hóa và tính linh hoạt của mảng. Sau khi chuyển màng GO, nhôm được làm bay hơi chùm tia điện tử và các khu vực phía trên các vi điện cực trong tương lai được xác định bằng cách sử dụng chất quang dẫn âm (nLOF 2070, Microchemicals) và nhấc ra. Tiếp theo, màng GO được khắc ở mọi nơi ngoại trừ các vi điện cực trong tương lai bằng cách sử dụng phương pháp khắc ion phản ứng oxy (RIE) trong 5 phút ở 500  W và các cột nhôm bảo vệ được khắc bằng dung dịch axit photphoric và nitric loãng. Sau đó, lớp PI-3 dày 2611µm được lắng lên tấm bán dẫn và nướng như mô tả trước đây. Sau đó, các lỗ PI-2611 trên vi điện cực được xác định bằng cách sử dụng chất quang dẫn dày dương (AZ9260, Microchemicals) hoạt động như một mặt nạ cho RIE oxy tiếp theo. Sau đó, các thiết bị này được tạo mẫu trên lớp PI, một lần nữa sử dụng chất quang dẫn AZ9260 và RIE. Lớp quang điện sau đó được loại bỏ trong axeton và tấm bán dẫn được làm sạch bằng cồn isopropyl và sấy khô. Cuối cùng, các thiết bị được bóc ra khỏi tấm bán dẫn và sẵn sàng để được đặt vào các túi khử trùng để được xử lý thủy nhiệt ở nhiệt độ 134 °C trong nồi hấp tiêu chuẩn trong 3 h.

Đặc tính điện hóa vi điện cực

Đặc tính điện hóa của các vi điện cực được thực hiện với bộ chiết áp Metrohm Autolab PGSTAT128N trong 1× PBS (Sigma-Aldrich, P4417) chứa dung dịch đệm 10 mM photphat, 137 mM NaCl và 2.7 mM KCl ở pH 7.4 và sử dụng cấu hình ba điện cực. Một điện cực Ag/AgCl (FlexRef, WPI) được sử dụng làm điện cực tham chiếu và dây bạch kim (Alfa Aesar, 45093) được sử dụng làm điện cực đối.

Trước khi đánh giá hiệu suất, các điện cực được phát xung 10,000 xung cân bằng điện tích (1 ms, 15 µA). Sự tiếp xúc của các điện cực với các giao thức xung liên tục được thực hiện bằng 100 chu kỳ vôn kế tuần hoàn (−0.9 đến +0.8 V) ở 50 mV s^-1, 20 lần lặp lại 5,000 xung (1  ms) và xác định lại điện thế mạch hở.

Phân tích dữ liệu

Dữ liệu đặc tính điện hóa được phân tích bằng gói Python 3.7 (Numpy, Pandas, Scipy, Pyeis, Lmfit, Matplotlib). Dữ liệu quang phổ trở kháng được gắn vào một mô hình điện tương đương bao gồm điện trở (R) nối tiếp với phần tử có pha không đổi (CPE). Từ đó, giá trị CPE được tính gần đúng bằng điện dung và chia cho diện tích hình học của vi điện cực để thu được giá trị tương đương cho điện dung bề mặt của EGNITE. Điện dung lưu trữ điện tích vi điện cực (CSC) được tính toán từ các phép đo vôn kế tuần hoàn bằng cách tích hợp chế độ catốt và anốt của dòng điện đo được và chuẩn hóa theo tốc độ quét. Điện dung lưu trữ điện tích catốt và anốt (cCSC và aCSC) ở tốc độ quét 100 mV của EGNITE là 45.9 ± 2.4 và 34.6 ± 2.8 mC cm^-2, tương ứng (n = 3). Theo báo cáo cho các vật liệu khác⁵⁸, các CSC thu được phụ thuộc vào tốc độ quét (Hình bổ sung. 5). Để đánh giá sự hiện diện của các phản ứng khử oxy, chúng tôi đã đo dạng sóng CV dưới chất điện phân được tẩy nitơ⁵⁹ và không quan sát thấy sự khác biệt đáng kể về dạng sóng (Hình bổ sung. 6). Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi không giải quyết đầy đủ tác động của các phản ứng khử oxy đến khả năng phun điện tích của EGNITE và cần phải thực hiện thêm công việc để điều tra vấn đề này một cách chính xác. Khả năng phun điện tích vi điện cực (CIC) được thiết lập bằng cách xác định biên độ xung hiện tại tạo ra sự chênh lệch điện áp (sau khi loại bỏ độ sụt ohm) phù hợp với cửa sổ nước điện hóa điện cực (−0.9 V đối với catốt và +0.8 V đối với anốt so với Ag/AgCl ) (Hình bổ sung. 17)⁶⁰.

Phân tích thống kê

Dữ liệu có giá trị trung bình ± sd, n = 18 đối với EIS và n = 3 đối với phép đo điện thế thời gian. Dữ liệu về bản đồ độ lệch điện áp điện dung catốt là giá trị trung bình của độ lệch điện áp điện dung catốt cho một sự kiện đối với mỗi dạng xung của n = 3 điện cực.

Đánh giá độ ổn định cơ học

siêu âm sonication

Mảng điện cực EGNITE được đặt bên trong cốc chứa đầy nước trong bể nước siêu âm (Elmasonic P 180H). Sonication được áp dụng ở tần số 37 kHz trong 15 phút ở 200 W, và tiếp theo là thêm 15 min siêu âm ở 37 kHz với công suất tăng lên 300 W. Hình ảnh của các điện cực được thu được trước và sau các bước siêu âm.

Kiểm tra uốn

Cấu hình uốn (Hình. 2k) gồm ba thanh hình trụ; phần giữa (đường kính, 700 µm) được hạ xuống, tạo ra góc uốn 131°. Ba mảng vi điện cực linh hoạt được sử dụng cho thử nghiệm uốn. Mỗi mảng chứa 18 vi điện cực có đường kính 50 µm. Hai mảng được đo sau 10 và 20 chu kỳ trong khi một thiết bị chỉ được đo trong 10 chu kỳ vì nó bị hỏng trong quá trình xử lý sau khi đo. Chu trình thử nghiệm uốn bao gồm ứng dụng có tải dài 10 giây cộng với 10 giây không tải. Các thiết bị được xác định đặc tính điện hóa (EIS và CV) trước và sau 10 và 20 chu kỳ uốn.

Ghi lại thần kinh vỏ não

Cấy vỏ ngoài

Tất cả các quy trình thí nghiệm được thực hiện theo khuyến nghị của Hội đồng Cộng đồng Châu Âu và luật pháp của Pháp về chăm sóc và sử dụng động vật thí nghiệm. Các giao thức đã được phê duyệt bởi ủy ban đạo đức Grenoble (ComEth) và được Bộ Pháp ủy quyền (số 04815.02). Chuột nhắt Sprague–Dawley (đực, 4 tháng tuổi, nặng ~600 g) được gây mê tiêm bắp bằng ketamine (50 mg mỗi kg (trọng lượng cơ thể)) và xylazine (10 mg mỗi kg (trọng lượng cơ thể)), sau đó cố định vào giá đỡ ổn định. Việc loại bỏ hộp sọ thái dương sẽ làm lộ ra vỏ não thính giác. Vật liệu dura được bảo quản để tránh làm hỏng mô vỏ não. Một lỗ được khoan ở đỉnh để lắp điện cực tham chiếu và một lỗ thứ hai, cách lỗ thứ nhất 7 mm về phía trước, để lắp điện cực nối đất. Các điện cực là các chân dày 0.5 mm được sử dụng cho ổ cắm mạch tích hợp. Chúng được đặt để tiếp xúc điện với màng cứng và cố định vào hộp sọ bằng xi măng nha khoa. Sau đó, chúng tôi gắn dải băng vi điện cực bề mặt lên vỏ thính giác như trong Hình XNUMX. 3b. Các mẫu tĩnh mạch xác định vỏ não thính giác, ở khu vực 41 trên bản đồ não chuột của Krieg. Các tín hiệu vỏ não được khuếch đại đồng thời với mức tăng 1,000 và được số hóa ở tốc độ lấy mẫu 33  kHz. Một chiếc loa cách tai chuột 20cm, đối diện với phần vỏ não lộ ra ngoài, sẽ phát ra các kích thích âm thanh. Các kích thích được truyền đi được theo dõi bởi micrô 0.25 inch (Brüel & Kjaer, 4939) đặt gần tai và được thể hiện ở mức áp suất âm thanh (dB SPL re 20 μPa). Chúng tôi kiểm tra các phản hồi có độ trễ trung bình ở đỉnh dương (âm lên) được tạo ra bằng cách nhấp chuột xen kẽ ở mức 80 dB SPL và kích thích cụm âm ở mức 70 dB SPL với tần số từ 5 đến 40 kHz, thời gian tăng và giảm là 5 ms và khoảng thời gian 200 ms.

Phân tích dữ liệu

Dữ liệu điện sinh lý được phân tích bằng các gói Python 3.7 (Numpy, Pandas, Scipy, Neo, Elephant, Sklearn Matplotlib) và thư viện tùy chỉnh PhyREC (https://github.com/aguimera/PhyREC). r.m.s. các giá trị được tính toán bằng cửa sổ trượt 20 ms ở tần số trên 200 Hz. Biểu đồ phổ được tính toán cho phạm vi từ 70  Hz đến 1.1  kHz. PSD được tính toán trên 60 giây ghi liên tục. Đối với một dãy điện cực nhất định, hai PSD đã được tính toán: in vivo (IV) và sau khi chết (PM). SNR được biểu thị bằng dB (20 × ln(r.m.s.(IV)/r.m.s.(PM))) và được nội suy cho 20 điểm cách nhau theo logarit trong khoảng từ 10 Hz đến 1 kHz.

Phân tích thống kê

Dữ liệu thần kinh vỏ não được trình bày trong hình. 3 được lấy từ các phép đo riêng lẻ trên một con vật. Trong bộ lễ phục. 3c, dữ liệu từ 64 điện cực được trình bày. Trong bộ lễ phục. 3d, dữ liệu từ hai điện cực được chọn sẽ được trình bày. Trong bộ lễ phục. 3f, PSD và SNR được tính toán từ 64 điện cực EGNITE và được hiển thị dưới dạng trung bình  ± s.d. Trong hình bổ sung. 12c, d dữ liệu trung bình được trình bày cho 192 điện cực EGNITE từ n = 3 thí nghiệm và 60 điện cực bạch kim từ n = 1 thí nghiệm.

Ghi thần kinh nội sọ

Cấy ghép nội sọ

Động vật được gây mê bằng hỗn hợp ketamine/xylazine (75:1, 0.35 ml/28 g ip) và trạng thái này được duy trì bằng mặt nạ hít cung cấp 1.5% isoflurane. Một số vi vít được đặt vào hộp sọ để ổn định bộ phận cấy ghép, và vi vít nằm trên đỉnh tiểu não được sử dụng làm nền chung. Đầu dò được cấy vào vỏ não trước trán (tọa độ: AP, 1.5 mm; ML, ±0.5 mm; DV, −1.7 mm từ bregma). Việc cấy ghép được thực hiện bằng cách phủ maltose vào đầu dò (xem quy trình bên dưới) để tạo độ cứng tạm thời cho đầu dò và tạo điều kiện thuận lợi cho việc chèn đầu dò. Đầu dò được bịt kín bằng xi măng nha khoa. Đầu nối TDT-ZifClip được sử dụng để kết nối đầu dò với hệ thống điện sinh lý thông qua một sợi cáp thu nhỏ. Sau phẫu thuật, chuột trải qua thời gian phục hồi 1 tuần được điều trị bằng thuốc giảm đau (buprenorphine) và chống viêm (meloxicam). Hoạt động thần kinh được ghi lại bằng hệ thống Open Ephys đa kênh ở tốc độ lấy mẫu 30  kHz với bộ khuếch đại Intan RHD2132. Các thí nghiệm về nhiệm vụ thính giác được tiến hành trong một hộp cách âm, có hai loa bên trong sử dụng các giao thức dựa trên công việc được mô tả trước đó.⁶¹. Kích thích âm thanh bao gồm một tiếng ồn trắng dài 15 ms, lặp lại 100 lần (chu kỳ), mỗi lần cách nhau 5   giây (khoảng thời gian kích thích). Trong quá trình thực hiện nhiệm vụ, con vật có thể di chuyển tự do.

Giao thức làm cứng Maltose

Dung dịch maltose được đun nóng đến điểm chuyển tiếp thủy tinh (T_g), trong khoảng từ 130 đến 160°C, sử dụng bếp điện hoặc lò vi sóng. Khi maltose trở nên nhớt, mặt sau của đầu dò chỉ tiếp xúc với maltose. Khi maltose nguội đi, nó làm cứng và làm cứng đầu dò.

Phân tích dữ liệu

Tín hiệu thần kinh từ mỗi điện cực được lọc ngoại tuyến để trích xuất SUA và LFP. SUA được ước tính bằng cách lọc tín hiệu trong khoảng từ 450 đến 6,000  Hz và các đột biến từ từng nơ-ron riêng lẻ được sắp xếp bằng cách sử dụng phân tích thành phần chính với Bộ sắp xếp ngoại tuyến v.4 (Plexon). Để thu được LFP, các tín hiệu đã được giảm tần số xuống 1  kHz, loại bỏ xu hướng và lọc khía để loại bỏ các thành phần nhiễu đường nhiễu (50  Hz và các sóng hài của nó) bằng các tập lệnh được viết tùy chỉnh bằng Python. AEP SNR được tính bằng tỷ lệ giữa biên độ N1 cực đại và sd trong khoảng thời gian 20 ms trước khi có kích thích.

Phân tích thống kê

Dữ liệu hiển thị trong hình. 3h, tôi là trung bình ± s.d., n = 30 là số lần thử trung bình. Dữ liệu được ghi từ cùng một điện cực được hiển thị ở các ngày thứ 30, 60 và 90. Dữ liệu từ một con vật được trình bày.

Tương thích sinh học vùng thượng vị mãn tính

Phẫu thuật cấy ghép thiết bị

Tổng cộng có 27 con chuột đực Sprague–Dawley trưởng thành đã được sử dụng cho nghiên cứu này (Charles River). Động vật được nuôi ở nhiệt độ môi trường xung quanh là 21 ± 2 °C và độ ẩm 40–50%, trong chu kỳ 12 h sáng/12 h tối. Chuột được nhốt theo nhóm và được cung cấp miễn phí chế độ ăn và nước uống trong suốt thời gian thử nghiệm. Các quy trình thí nghiệm được thực hiện theo Đạo luật Phúc lợi Động vật (1998), dưới sự chấp thuận của Bộ Nội vụ Vương quốc Anh và cơ quan đánh giá đạo đức phúc lợi động vật địa phương (AWERB). Động vật được gây mê bằng isoflurane (2–3%) trong suốt thời gian phẫu thuật và độ sâu gây mê được theo dõi bằng xét nghiệm phản xạ véo ngón chân. Động vật được đặt trong khung lập thể (Kopf, 900LS), nằm phía trên chăn nhiệt để duy trì nhiệt độ cơ thể. Một lỗ mở sọ (~5 mm ×4 mm) được tạo ra cách đường giữa 1 mm bằng cách sử dụng mũi khoan nha khoa với mũi khoan có gờ 0.9 mm, màng cứng được loại bỏ và thiết bị vùng thượng vị được đặt trên bề mặt vỏ não. Lỗ mở sọ được bịt kín bằng Kwik-sil, sau đó dùng xi măng nha khoa để cố định và khâu da lại. Tiêm dưới da nước muối (1 ml mỗi kg (trọng lượng cơ thể)) và buprenorphine (0.03 mg mỗi kg (trọng lượng cơ thể)) để thay thế chất lỏng bị mất và giảm đau sau phẫu thuật, đồng thời ngừng gây mê.

Thu thập và xử lý mô

Động vật bị tiêu diệt ở thời điểm 2, 6 hoặc 12 tuần sau khi cấy bằng phương pháp thích hợp đối với loại phân tích được thực hiện.

Mô học và hóa mô miễn dịch

Vào lúc 2, 6 hoặc 12 tuần sau khi cấy ghép, chuột bị tiêu diệt bằng phương pháp truyền dịch tim bằng heparinized (10 U ml^-1, Sigma-Aldrich) PBS, tiếp theo là 4% paraformaldehyde (PFA, Sigma-Aldrich) trong PBS. Não được cố định sau trong 4% PFA trong 24 giờ, sau đó được chuyển sang 30% sucrose trong PBS trong ít nhất 48 giờ trước khi đông lạnh trong isopentane. Sau đó, não được bảo quản ở -80 °C cho đến khi được đông lạnh ở nhiệt độ 25 m. Sau đó, mô được nhuộm để phân tử bộ điều hợp liên kết canxi ion hóa 1 (Iba-1) để xác định mức độ kích hoạt vi mô. Tóm lại, các phần mô được chặn bằng huyết thanh dê 5% trong PBS với Triton-X 0.1% trong 1  giờ trước khi ủ qua đêm ở 4 °C bằng kháng thể chính kháng Iba-1 (1:1,000, 019-19741; Wako). Sau đó, các phần được nhuộm bằng kháng thể thứ cấp, thuốc chống thỏ Alexa Fluor 594 (1:400, A-11012; Thermo Fisher) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Các phiến kính được gắn với các nắp đậy bằng vật liệu gắn chống phai màu Prolong Gold với 4,6-diamidino-2-phenylindole (Thermo Fisher). Đầu dò bao phủ diện tích 3 × 3.7 mm² trên bề mặt vỏ não; các phần mô được chọn để nhuộm bao phủ vùng này có chiều dài 3.2 mm. Các slide được chụp ảnh bằng máy quét slide kính hiển vi 3DHistech Pannoramic-250 ở tốc độ 20 × và hình ảnh được phân tích bằng CaseViewer v.2.4 (3DHistech). Để đánh giá khả năng kích hoạt microglia, một vùng 3.2 mm được bao phủ, với một hình ảnh được phân tích cứ sau 100 m. Hình ảnh được chụp ở độ phóng đại 8.5 ×, mô tả chi tiết một phần của vị trí đầu dò vỏ não, cách đường giữa não 3 mm, bao gồm khu vực ngay dưới vị trí đầu dò.

Đang xử lý hình ảnh

Dữ liệu kính hiển vi được xử lý hình ảnh bằng thuật toán mô tả đặc điểm kiểu hình microglia (Hình bổ sung. 13). Kích hoạt vi mô được phân tích bằng CellProfiler* tùy chỉnh (Broad Institute, v.3.1.9 từ https://cellprofiler.org/) đường ống. Đầu tiên, mô-đun EnhanceOrSuppressFeatures được sử dụng để tăng cường các cấu trúc dạng sợi như tế bào thần kinh bằng cách áp dụng phương pháp tăng cường hình ống. Từ các hình ảnh nâng cao, các ô được phân đoạn bằng mô-đun BecomePrimaryObjects. Các phép đo sơ bộ của các ô cho thấy phạm vi đường kính vật thể thích hợp là 3–40 pixel. Các vật thể nằm ngoài phạm vi đường kính này hoặc chạm vào mép ảnh sẽ bị loại bỏ. Các ô được phân đoạn bằng chiến lược ngưỡng thích ứng Otsu hai lớp với kích thước cửa sổ thích ứng là 50 pixel. Các đối tượng được xác định bởi mô-đun BecomePrimaryObjects được nhập vào mô-đun MeasureObjectSizeShape để tính toán các thuộc tính cần thiết cho việc phân loại ô. Trong mô-đun ClassifyObjects, danh mục làm cơ sở phân loại được chỉ định là Hình dạng vùng và Mức độ được chọn làm phép đo tương ứng. Các tế bào được phân loại là 'được kích hoạt' hoặc 'không được kích hoạt' dựa trên thuộc tính Extent của chúng, là tỷ lệ giữa khu vực bị ô chiếm giữ và khu vực bị chiếm bởi hộp giới hạn của nó. Cách tiếp cận phân loại này được hợp lý hóa bởi thực tế là microglia được kích hoạt có thân tế bào lớn và không có quá trình nào, do đó chiếm tỷ lệ hộp giới hạn lớn hơn nhiều so với các đối tác không được kích hoạt. Cuối cùng, các mô-đun Tính toán và Xuất sang Bảng tính được sử dụng để tính toán và đưa ra số liệu thống kê mong muốn.

Phân tích thống kê

Bộ dữ liệu được n = 3 cho mỗi loại thiết bị (bộ cấy chỉ PI (PI); PI với vàng được chế tạo vi mô lộ ra (vàng); và PI với vàng được chế tạo vi mô và EGNITE (EGNITE) tại mọi thời điểm) ngoại trừ vàng 6 tuần là n = 2 đối với dữ liệu ELISA. Các bán cầu đối diện được kết hợp tại mỗi thời điểm để cung cấp n = 9 lúc 2 và 12 tuần sau cấy ghép và n = 8 lúc 6 tuần sau khi cấy ghép. Phân tích dữ liệu được thực hiện bằng phần mềm GraphPad Prism v.8. Phân tích thống kê được hoàn thành bằng cách sử dụng phân tích phương sai hai chiều (ANOVA) với thử nghiệm so sánh nhiều lần của Tukey khi thích hợp; P < 0.05 được coi là có ý nghĩa.

ELISA

Sau thời gian cấy ghép, động vật đã bị chấm dứt do trật khớp cổ tử cung. Mô não được chiết xuất từ ​​​​cả bán cầu não phải và trái, đông lạnh trong nitơ lỏng và bảo quản ở -80 °C cho đến khi sử dụng tiếp. Mô được ly giải bằng cách sử dụng dung dịch đệm ly giải NP-40 (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, 1% chất thay thế Nonidet P40, Fluka, điều chỉnh pH thành 7.4) có chứa chất ức chế protease và phosphatase (Halt Protease và Phosphatase Inhibitor Cocktail, Thermo Fisher), tiếp theo là sự phá vỡ cơ học của mô (TissueLyser LT, Qiagen). Sau đó, các mẫu được ly tâm trong 10 phút với tốc độ 5,000 vòng / phút và phần nổi phía trên được bảo quản ở 4 ° C cho đến khi sử dụng tiếp. Bảng điều khiển viêm chuột LEGENDplex (số danh mục 740401, BioLegend), một bộ ELISA ghép kênh dựa trên hạt, đã được chạy để định lượng các cytokine sau; IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-18, IL-33, CXCL1 (KC), CCL2 (MCP-1), kích thích đại thực bào-bạch cầu hạt yếu tố, interferon-γ và yếu tố hoại tử khối u. Bộ này được chạy theo hướng dẫn của nhà sản xuất, với protein được nạp ở thể tích cố định 15 µl. Sau khi ủ với chất nổi phía trên, các hạt được chạy trên máy đếm tế bào dòng chảy BD FACSVerse và dữ liệu được phân tích bằng phần mềm phân tích dữ liệu LEGENDplex.

Kích thích thần kinh

Cấy ghép nội mô

Tất cả các thí nghiệm trên động vật đã được phê duyệt bởi Ủy ban đạo đức của Đại học Autònoma de Barcelona theo Chỉ thị của Hội đồng Cộng đồng Châu Âu 2010/63/EU. Động vật được nuôi ở nhiệt độ 22 ± 2 °C trong chu kỳ 12 h sáng/12 h tối với thức ăn và nước uống có sẵn miễn phí. Dây thần kinh hông của chuột cái Sprague–Dawley được gây mê (250–300 g, ~18 tuần tuổi) đã được phẫu thuật lộ ra ngoài và các điện cực TIME được cấy ngang qua dây thần kinh tọa với sự trợ giúp của một cây kim thẳng gắn vào sợi vòng 10-0⁴⁶. Quá trình này được theo dõi dưới kính hiển vi mổ xẻ để đảm bảo vị trí chính xác của các vị trí hoạt động bên trong các bó dây thần kinh (Hình 2). 4b). Trong các thí nghiệm, nhiệt độ cơ thể động vật được duy trì bằng đệm sưởi.

Kích thích thần kinh được thực hiện bằng cách áp dụng các chuỗi xung dòng điện hai pha có thời lượng cố định 100 µs mỗi pha và tăng biên độ từ 0 đến 150 µA trong các bước 1 hoặc 3 µA ở tần số 3 Hz trong 33 s (Bộ kích thích DS4, Digitimer) thông qua EGNITE khác nhau các vi điện cực. Đồng thời, CMAP được ghi lại từ các cơ GM, TA và PL bằng cách sử dụng các điện cực kim nhỏ (dài 13mm, đường kính 0.4mm, điện cực kim thép không gỉ A-03-14BEP, Bionic) đặt trong mỗi cơ⁶². Điện cực hoạt động được đặt trên bụng cơ và điện cực tham chiếu ở ngang mức gân. Các bản ghi điện cơ được khuếch đại (×100 đối với GM và TA, ×1,000 đối với bộ khuếch đại PL; P511AC, Grass), lọc thông dải (3 Hz đến 3 kHz) và số hóa bằng hệ thống ghi PowerLab (PowerLab16SP, ADInstruments) ở tần số 20 kHz.

Phân tích dữ liệu

Biên độ của mỗi CMAP được đo từ đường cơ sở đến đỉnh âm cực đại. Các phép đo cực đại điện áp đã được chuẩn hóa thành biên độ CMAP tối đa thu được cho từng cơ trong thí nghiệm. Chỉ số chọn lọc (SI) được tính cho từng vị trí hoạt động theo tỷ lệ giữa biên độ CMAP chuẩn hóa cho một cơ, CMAP_ivà tổng biên độ CMAP đã chuẩn hóa ở ba cơ, theo công thức SI_i = nWCPA_i/∑nWCPA_j, ở biên độ dòng kích thích tối thiểu tạo ra phản ứng cơ có liên quan đến chức năng tối thiểu (được định nghĩa là biên độ CMAP ít nhất 5% đối với một trong các cơ so với biên độ CMAP tối đa của cơ đó đã được xác định trước đó). Sau đó, các vị trí hoạt động có SI cao nhất cho mỗi cơ trong số ba cơ được chọn làm SI cho mỗi cơ trong một thí nghiệm nhất định.

Tương thích sinh học nội thần kinh mãn tính

Theo một thủ tục được báo cáo trước đó^50,63, dây thần kinh hông của chuột cái Sprague–Dawley được gây mê (250-300 g, ~18 tuần tuổi) đã được phơi nhiễm và các thiết bị tương thích sinh học in vivo có và không có EGNITE được cấy dọc vào nhánh chày của dây thần kinh tọa (n = 6–8 mỗi nhóm). Tóm lại, dây thần kinh được đâm vào ở điểm chia ba bằng kim thẳng gắn vào sợi vòng 10-0 (STC-6, Ethicon); sợi chỉ kéo đầu hình mũi tên của dải điện cực bị uốn cong. Đầu được cắt để lấy đi sợi chỉ và các đầu của mỗi cánh tay hơi cong để tránh rút thiết bị. Bộ cấy theo chiều dọc được chọn vì nó cho phép nghiên cứu tốt hơn về phản ứng của vật thể lạ bên trong dây thần kinh⁵⁰.

Đánh giá chức năng thần kinh và động vật

Động vật được đánh giá trong quá trình theo dõi sau cấy ghép bằng các phương pháp dẫn truyền thần kinh, đo đại số và kiểm tra khả năng vận động của đường đi bộ⁶². Đối với các xét nghiệm dẫn truyền, dây thần kinh hông của bàn chân được cấy ghép và bàn chân đối diện được kích thích bằng các điện cực kim ở rãnh hông và CMAP của cơ PL được ghi lại như trên. Độ trễ và biên độ của CMAP đã được đo. Đối với thử nghiệm đo đại số, chuột được đặt trên bệ lưới thép và kích thích cơ học không độc hại được áp dụng bằng đầu kim loại được kết nối với máy đo đại số Von Frey điện tử (Bioseb). Ngưỡng cảm thụ đau (lực tính bằng gam khi động vật rút chân) của bàn chân được cấy ghép so với bàn chân đối diện đã được đo. Đối với bài kiểm tra đường đi bộ, bề mặt lòng bàn chân sau được sơn bằng mực đen và mỗi con chuột được để đi dọc theo một hành lang. Các dấu chân đã được thu thập và chỉ số chức năng thần kinh tọa được tính toán⁶².

Mô học

Sau 2 hoặc 8 tuần, động vật được tưới máu bằng PFA (4%) và dây thần kinh hông được thu hoạch, cố định sau, bảo quản lạnh và xử lý để phân tích mô học. Để đánh giá FBR, dây thần kinh tọa được cắt thành các mặt cắt ngang dày 15 μm bằng máy lạnh (Leica CM190). Các mẫu được nhuộm bằng kháng thể chính dành cho các sợi trục có bao myelin (anti-RT97 để dán nhãn Neurofil 200K, 1:200; Developmental Studies Hybridoma Bank) và đại thực bào (anti-Iba-1, 1:500; Wako). Sau đó, các phần được ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng với kháng thể thứ cấp chống chuột Alexa Fluor 488 và thuốc chống chuột Alexa Fluor 555 (1:200, Invitrogen). Các phần đại diện từ phần trung tâm của mô cấy trong dây thần kinh chày đã được chọn, hình ảnh được chụp bằng kính hiển vi phát quang (Eclipse Ni, Nikon) gắn với máy ảnh kỹ thuật số (DS-Ri2, Nikon) và phân tích hình ảnh được thực hiện bằng phần mềm ImageJ (Viện Quốc gia) sức khỏe). Lượng tế bào dương tính với Iba-1 trong toàn bộ khu vực của dây thần kinh chày đã được định lượng và độ dày của bao mô được đo bằng khoảng cách trung bình của mỗi bên của bộ phận cấy ghép đến các sợi trục gần nhất.

Phân tích thống kê

Để phân tích thống kê dữ liệu, chúng tôi đã sử dụng ANOVA một hoặc hai chiều, sau đó là bài kiểm tra hậu kỳ Bonferroni để tìm sự khác biệt giữa các nhóm hoặc thời gian. Phần mềm GraphPad Prism được sử dụng để biểu diễn và phân tích đồ họa. Ý nghĩa thống kê được xem xét khi P <0.05.

Tóm tắt báo cáo

Thông tin thêm về thiết kế nghiên cứu có sẵn trong Tóm tắt báo cáo danh mục đầu tư tự nhiên liên kết đến bài viết này.

• Phân phối nội dung và PR được hỗ trợ bởi SEO. Được khuếch đại ngay hôm nay.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. Trao quyền cho chính mình. Truy cập Tại đây.
• PlatoAiStream. Thông minh Web3. Kiến thức khuếch đại. Truy cập Tại đây.
• Trung tâmESG. Than đá, công nghệ sạch, Năng lượng, Môi trường Hệ mặt trời, Quản lý chất thải. Truy cập Tại đây.
• PlatoSức khỏe. Tình báo thử nghiệm lâm sàng và công nghệ sinh học. Truy cập Tại đây.
• nguồn: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01570-5