Nuôi cấy tế bào

Các tế bào mỡ màu nâu được phân biệt với dòng tế bào tiền mỡ màu nâu bất tử của chuột được cung cấp bởi B. Spiegelman (Đại học Harvard) như đã mô tả trước đây¹⁹. Preadipocytes được duy trì và mở rộng ở mức hợp lưu thấp (<50%) trong môi trường tăng trưởng (môi trường Eagle sửa đổi của Dulbecco, glucose cao (Gibco), được bổ sung 20% ​​huyết thanh bò bào thai (Sigma-Aldrich), 20 mM HEPES (Sigma-Aldrich) và 100 U ml^-1 penicillin-streptomycin (Gibco)). Để biệt hóa, preadipocytes được rửa hai lần bằng dung dịch đệm phốt phát (PBS) (Gibco, pH 7.4, 1×), phân tách bằng TrypLE Express và gieo hạt ở mật độ khoảng 23,000 tế bào cm^-2 trong môi trường tăng trưởng. Môi trường được thay đổi sau 24 giờ thành môi trường biệt hóa (môi trường Eagle sửa đổi của Dulbecco, glucose cao, bổ sung 10% huyết thanh bò bào thai, insulin 20 nM, triiodothyronine 1 nM và 100 U ml^-1 penicillin–streptomycin) và tế bào được nuôi cấy trong 2 ngày. Sau đó, sự biệt hóa tế bào được tạo ra bằng cách bổ sung môi trường cảm ứng (môi trường biệt hóa được bổ sung 0.125 mM indomethacin, 0.5 μM dexamethasone và 0.5 mM isobutyl methylxanthine) trong 2 ngày, sau đó môi trường được đổi thành môi trường biệt hóa trong hai ngày nữa. Các tế bào mỡ biệt hóa được rửa một lần bằng môi trường đói (môi trường Eagle sửa đổi của Dulbecco, glucose thấp (Gibco), được bổ sung glucose đến nồng độ cuối cùng là 8 mM, albumin huyết thanh bò 0.5% (Sigma-Aldrich) và 100 U ml^-1 penicillin–streptomycin) và ủ trong 2 giờ trong môi trường đói trước khi xử lý bằng insulin NanoRods hoặc NanoRods được pha loãng trong môi trường đói trong thời gian được nêu trong văn bản chính. Sau khi điều trị, các tế bào được rửa một lần trong PBS và được thu hoạch để phân lập protein cho các tế bào miễn dịch hoặc RNA để biểu hiện gen. Để phân tích IR bằng DNA-PAINT, các tế bào tiền mỡ được biệt hóa như mô tả ở trên với những sửa đổi sau. Sau khi xử lý bằng môi trường cảm ứng, các tế bào được phân tách bằng TrypLE Express và gieo hạt vào môi trường biệt hóa trong giếng đáy thủy tinh μ-Slide 18 Well (ibidi). Sau 2 ngày, các tế bào được ủ trong môi trường đói trong 2 giờ, sau đó được xử lý bằng insulin 10 nM trong môi trường đói trong 10 phút. Trong các thí nghiệm đối chứng, việc bổ sung insulin đã bị bỏ qua. Trước khi điều trị, các tế bào mỡ biệt hóa được phân tích trực quan để đánh giá mật độ bề mặt tế bào và đánh giá mức độ biệt hóa của tế bào, sau đó phân bổ ngẫu nhiên vào nhóm điều trị và nhóm đối chứng.

Các tế bào được duy trì, mở rộng và biệt hóa trong môi trường ẩm có chứa 5% CO₂ ở 37°C.

DNA-SƠN IR

Các tế bào mỡ đã biệt hóa được cố định trong 12 phút ở nhiệt độ phòng (RT) bằng 4% paraformaldehyde được làm ấm trước trong PBS, rửa ba lần bằng PBS, chặn trong 90 phút ở RT bằng dung dịch chặn (3.0% huyết thanh bào thai bò/0.1% Triton X -100 trong PBS) và ủ với kháng thể kháng IR β của thỏ (Tín hiệu tế bào (4B8); pha loãng 1:300 trong dung dịch chặn) trong 2 ngày ở 4°C. Sau đó, các tế bào được rửa ba lần bằng PBS và được ủ bằng IgG (Massive Photonics) nanobody nano được pha loãng theo tỷ lệ 1:200 trong bộ đệm chặn (Massive Photonics) trong 1 giờ tại RT. Sau ba lần rửa bằng PBS, các tế bào được ủ với các hạt nano vàng 80nm (Sigma-Aldrich; độ pha loãng 1:5 trong đệm chặn) trong 10 phút. Các tế bào được rửa một lần bằng PBS và được ủ với các sợi có nhãn Cy5b 3 nM (Massive Photonics) được pha loãng trong bộ đệm hình ảnh (Massive Photonics).

Việc chụp ảnh được thực hiện trên kính hiển vi Ti-E của Nikon ECLIPSE với hệ thống Lấy nét hoàn hảo (Dụng cụ của Nikon), áp dụng cấu hình huỳnh quang phản xạ nội toàn phần loại mục tiêu bằng cách sử dụng mô-đun huỳnh quang phản xạ nội toàn phần hình tròn iLAS2 (Hệ thống Gataca) bằng phương pháp ngâm trong dầu Kế hoạch CFI khẩu độ 1.49 số Apo huỳnh quang phản xạ nội toàn phần ×100 vật kính (Dụng cụ của Nikon) được trang bị độ phóng đại Optovar phụ ×1.5 tương ứng với kích thước pixel cuối cùng là 87 nm. Laser được sử dụng là OBIS 561 nm LS 150 mW (Coherent) với hệ thống quang học mở rộng chùm tia đầu vào iLas tùy chỉnh (Cairn) được tối ưu hóa để giảm hình ảnh siêu phân giải trường. Chùm ánh sáng huỳnh quang trước tiên được truyền qua khối bộ lọc (89901, Công nghệ Chroma) chứa bộ lọc bốn băng tần kích thích, bộ lọc lưỡng sắc bốn băng tần và bộ lọc phát xạ bốn băng tần (ZET405/488/561/640x, ZET405/488/561/640bs và ZET405 /488/561/640m, Công nghệ sắc độ). Sau đó, ánh sáng huỳnh quang được lọc quang phổ bằng bộ lọc phát xạ (ET595/50m, Công nghệ Chroma) và chụp ảnh trên máy ảnh thiết bị ghép điện tích nhân điện tử iXon Ultra 888 (Andor). Phần mềm Micro-Manager v. 1.4 đã được sử dụng để thu được 12,000 khung hình với khung đọc 10 MHz, độ phơi sáng 130 ms và không có mức tăng nhân điện tử. Tổng cộng có mười ô từ ba thí nghiệm độc lập được chụp ảnh trong từng điều kiện (Ghi chú bổ sung và Hình bổ sung. 1).

Sản xuất và tinh chế INS-DNA

Insulin (Merck, 1 mg ml^-1) đã phản ứng với dibenzocyclooctyne-sulfo-N-hydroxysuccinimidyl este (DBCO-sulfo-NHS, Click Chemistry Tools; 690 µM) trong 100 mM Na₂CO₃ đệm (pH 11.5) trong 20 phút ở RT. Phản ứng sau đó được dừng lại trong 5 phút thông qua việc bổ sung bazơ Tris (Sigma-Aldrich, 100 mM). Dung dịch được rửa ba lần với 400 µl Na 100 mM₂CO₃ sử dụng bộ lọc ly tâm Amicon Ultra 0.5 ml có màng cắt 3 kDa (Merck). Ở mỗi bước rửa, các cột được quay trong 10 phút ở tốc độ 14,000×g. Sau bước rửa cuối cùng, insulin–DBCO (690 µM) được trộn với DNA biến đổi azide (Bộ sinh học, 35 µM; Bảng bổ trợ 3) trong 100 mM Na₂CO₃ và để phản ứng trong 3 giờ ở RT. Phản ứng được dập tắt bằng cách thêm NaN₃ (Sigma-Aldrich, 6.9 mM). Các mẫu được chạy trên gel polyacrylamide tự nhiên (6% 19:1 polyacrylamide trong 1× TAE, 20 phút, 200 V, đệm chạy TAE) và nhuộm bằng SYBR Gold (Thermo Fisher) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, để xác nhận INS- sự hình thành ADN. Hình ảnh được thực hiện bằng máy chụp ảnh gel ImageQuant LAS 4000. Quy trình liên hợp insulin–DBCO-sulfo-NHS đã được tối ưu hóa để thúc đẩy sự liên kết của ssDNA oligo với lysine-29 của chuỗi B (B29 lysine) so với các nhóm amin ở N đầu cuối của chuỗi insulin A và B. Giá trị pKa của amin B29 cao hơn giá trị pKa của hai amin trên N termini (11.2 so với 8.6 và 6.8). Ở độ pH cao, nhóm NHS của liên kết ngang được dự đoán sẽ phản ứng tốt hơn với nhóm amin cơ bản nhất, đó là amin lysine B29³². Do đó, các điều kiện phản ứng pH đã được tối ưu hóa để thúc đẩy một sản phẩm INS-DNA duy nhất.

Hỗn hợp phản ứng INS-DNA được tinh chế bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo C₁₈ cột (Agilent Poroshell 120 EC-C₁₈) trên công nghệ sinh học Amersham Pharmacia ÄKTA Ettan LC. Dung dịch đệm A (50 mM triethylamine acetate) và dung dịch đệm B (90% acetonitril và 10% dung dịch đệm A) đã được sử dụng trong cấu hình gradient, trong đó phần trăm của dung dịch đệm B đã tăng từ 30% lên 50% trong 20 phút. Các phân số được thu thập và quay trên máy cô đặc chân không (Thermo Scientific SpeedVac Savant DNA 120) trong 30 phút ở nhiệt độ cao để loại bỏ các thành phần dễ bay hơi của đệm sắc ký lỏng hiệu năng cao. Các đỉnh được chọn được trao đổi đệm vào PBS bằng bộ lọc ly tâm Amicon Ultra 0.5 ml với màng cắt 3 kDa (Merck), bằng cách quay ba lần trong 10 phút ở tốc độ 14,000×g và rửa mỗi lần với 400 µl PBS. Các mẫu gồm các phân đoạn đã tinh khiết được chạy trên gel polyacrylamide tự nhiên và nhuộm bằng SYBR Gold (Thermo Fisher) để hình dung INS-DNA đã tinh khiết. Độ tinh khiết cuối cùng của chất liên hợp được phân tích cho mỗi chế phẩm thông qua ba phương pháp: so sánh cường độ dải màu bạc (Pierce Silver Stain Kit) trên điện di gel natri dodecyl sulfate–polyacrylamide (Invitrogen, 4–12% Bolt gel) so với tiêu chuẩn insulin (Merck) , so sánh cường độ dải vàng SYBR trên điện di trên gel polyacrylamide tự nhiên với các tiêu chuẩn DNA (Công nghệ DNA tích hợp) và thông qua Bộ xét nghiệm Qubit ssDNA (Qubit 4 Fluorimeter, Invitrogen). Nồng độ cuối cùng của INS-DNA được tính toán dựa trên phép đo ssDNA của Qubit. INS-DNA tinh khiết được đông lạnh và bảo quản ở −20 ° C cho đến khi sử dụng tiếp.

Sản xuất NanoRods và NanoRods insulin

Các cấu trúc Origami đã được chuẩn bị bằng cách trộn DNA plasmid của giàn giáo (p7560, Tilibit, 10 nM) với các chuỗi chủ yếu thích hợp (Công nghệ DNA tích hợp, 100 nM) (Bảng bổ trợ 4–9) trong đệm gấp (5.0 mM Tris ở pH 8.5 (Sigma-Aldrich), 1.0 mM EDTA (Panreac AppliChem) và 12.5 mM MgCl₂ (Sigma-Aldrich)). Hỗn hợp này sau đó được đặt trong máy điều nhiệt (MJ Research PTC-225 gradient Thermal Cycler) và ủ bằng cách làm nóng đến 80.0 °C trong 5 phút, làm mát đến 60.0 °C ở tốc độ 1.0 °C mỗi phút trong 20 phút và sau đó làm lạnh từ từ đến 20.0 °C ở 0.5 °C mỗi phút. Các ghim thừa được loại bỏ bằng bộ lọc ly tâm Amicon Ultra 0.5 ml với màng cắt 100 kDa (Merck) bằng cách quay năm lần trong 2 phút ở tốc độ 14,000×g và rửa mỗi lần với 400 µl đệm gấp. Nồng độ của cấu trúc tinh khiết được xác định bằng cách đo độ hấp thụ DNA ở bước sóng 260 nm (Thermo Scientific NanoDrop 2000). Sau đó, INS-DNA tinh khiết được bổ sung với lượng vượt quá 3 lần cân bằng hóa học vào các vị trí liên kết sợi mở rộng có sẵn trên cấu trúc NanoRod và được ủ trong máy điều nhiệt bằng cách làm nóng đến 37.0°C trong 1 giờ, làm mát đến 22.0°C ở tốc độ 0.1°C mỗi phút, ủ ở 22.0°C trong 14 giờ và làm nguội xuống 4.0°C với tốc độ 0.1°C mỗi phút. INS-DNA không liên kết đã được loại bỏ bằng bộ lọc ly tâm Amicon Ultra 0.5 ml với màng cắt 100 kDa (Merck), quay năm lần trong 2 phút ở tốc độ 14,000 ×g và rửa mỗi lần với 400 µl PBS + 10 mM MgCl₂. Insulin NanoRods được bảo quản ở 4°C cho đến khi sử dụng tiếp.

Điện di gel agarose

Cấu trúc NanoRod được phân tích bằng cách chạy mẫu trên gel agarose trên đá trong 4 giờ ở 70 V. Gel được cấu tạo từ 2% agarose (Thermo Scientific TopVision Agarose) trong dung dịch đệm TBE 0.5× (Panreac AppliChem) cộng với 10 mM MgCl₂ (Sigma-Aldrich) và vết DNA an toàn 1× SYBR (Invitrogen). Hình ảnh được thực hiện bằng máy chụp ảnh gel ImageQuant LAS 4000.

Tán xạ ánh sáng năng động

Mẫu NanoRod và insulin NanoRod được chuẩn bị trong PBS + 10 mM MgCl₂, ống tiêm được lọc bằng màng 0.1 µm (Merck) và được phân tích trên thiết bị Zetasizer Ultra (Malvern Panalytical). Ba phép đo được thực hiện ở nhiệt độ 25°C trong pin có thể tích thấp (ZSU1002) và sau đó lấy trung bình.

mô phỏng oxDNA của NanoRod

Cấu trúc NR, NR-1, NR-2, NR-4, NR-7 và NR-15 được phân tích bằng mô hình hạt thô oxDNA (https://oxdna.org/). Cấu trúc NanoRod với các chuỗi DSDNA kéo dài từ các vị trí kết hợp insulin được tạo bằng vHelix và được chuyển đổi sang định dạng oxDNA bằng trang web tacoxDNA (http://tacoxdna.sissa.it/). Các kết cấu đã được đệ trình lên oxDNA.org máy chủ web để mô phỏng ở 37°C, với 1 là nồng độ muối, 1 × 10⁸ bước thời gian với quảng cáot giá trị 0.0001 và bước thư giãn sơ bộ với các tham số mặc định. Mô phỏng đã được trực quan hóa và video được tạo bằng công cụ oxView (https://oxdna.org/).

TEM nhuộm âm tính

NanoRods tinh khiết (10 nM) được phân phối trên lưới TEM đồng hỗ trợ carbon phóng điện phát sáng (TEM-CF200CU50, Thermo Fisher Khoa học) và ủ trong 60 giây trước khi loại bỏ dung dịch. Sau đó, các lưới này được nhuộm trong 10 giây với 5 µl uranyl formate 2% w/v, sau đó được loại bỏ. Quy trình nhuộm màu được lặp lại bảy lần và lưới TEM được làm khô trong không khí trong 30 phút trước khi chụp ảnh. Hình ảnh được thực hiện trên máy dò Talos 120C G2 (120 kV, Ceta-D) ở mức × 92,000 cho chế độ xem trường gần. Ảnh thô được xử lý bằng phần mềm ImageJ (v1.53).

AFM

Các cấu trúc NanoRod được tạo hình trên một đĩa mica được gắn chặt bằng keo epoxy vào giữa phiến kính hiển vi và được bao bọc bởi một vòng nhựa gắn vào phiến kính bằng Reprorubber. Các cấu trúc nano được pha loãng thành 1 nM trong dung dịch đệm TE-Mg (bazơ Tris 5 mM, EDTA 1 mM, MgCl 10 mM₂, pH 8.0) và 10 µl được bơm vào mica mới cắt. Sau 30 giây, 4 µl NiSO 5 mM₄ được thêm vào và ủ thêm 4.5 phút nữa. Sau đó, bề mặt được rửa bằng 1.0 ml dung dịch đệm TE-Mg đã lọc 0.1 µm, sau đó 1.5 ml dung dịch đệm TE-Mg đã lọc được thêm vào đĩa mica để chụp ảnh. Hình ảnh được thực hiện trong chất lỏng bằng kính hiển vi lực nguyên tử JPK Instruments NanoWizard 3 Ultra với công cụ đúc hẫng Bruker AC40 ở chế độ ac.

DNA-PAINT của cấu trúc nano insulin NanoRod

Các giếng đáy kính µ-Slide 18 giếng (ibidi) được làm sạch bằng isopropanol và làm khô bằng N₂. Các giếng được ủ với 1 mg ml^-1 Albumin huyết thanh bò biotin (Thermo Fisher) trong dung dịch đệm A (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl và 0.05% (v/v) Tween 20 ở pH 8.0) trong 5 phút ở RT, rửa ba lần bằng dung dịch đệm A và ủ với 0.5 mg ml^-1 neutravidin (Thermo Fisher) trong dung dịch đệm A trong 5 phút tại RT. Sau đó, giếng được rửa ba lần bằng dung dịch đệm A, sau đó rửa ba lần bằng dung dịch đệm B (5 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA và 0.05% (v/v) Tween 20 ở pH 8.0). Sau đó, các NanoRod 500 pM kết hợp bốn chuỗi DNA được dán nhãn biotin (Dữ liệu mở rộng Hình XNUMX). 2a), với INS-DNA chứa trình tự lắp ghép PAINT 9-nucleotide (DS1; Bảng bổ trợ 3), được thêm vào từng giếng trong 5 phút. Các giếng được rửa ba lần bằng dung dịch đệm B. Sau đó, 1 nM chuỗi hình ảnh Atto-647N (IS1; Bảng bổ trợ 10) trong dung dịch đệm B được bổ sung chất khử oxy (axit protocatechuic (Sigma), protocatechuate 3,4-dioxygenase (Sigma) và Trolox (Sigma)) được thêm vào từng giếng. Đối với SƠN trao đổi kép, ba trình tự lắp ghép (DS2; Bảng bổ trợ 10) đã được thêm vào cả hai đầu của NanoRods. Các mẫu được chuẩn bị như mô tả trước đây, các giếng được rửa mười lần bằng dung dịch đệm B giữa mỗi lần chụp ảnh. Mỗi lần thu thập hình ảnh được thực hiện với một chuỗi hình ảnh Atto-647N khác nhau (IS1 và IS2; Bảng bổ trợ 10). Phần mềm Micro-Manager đã được sử dụng để thu được 9,000 khung hình với khung đọc 10 MHz, độ phơi sáng 200 ms và không có mức tăng nhân điện tử (Ghi chú bổ sung và quả sung bổ sung. 2 và 3).

SPR

Một thiết bị Biacore T200 (Cytiva) đã được sử dụng để thực hiện các thí nghiệm XUÂN và dữ liệu được thu thập bằng phần mềm điều khiển hệ thống Biacore T200 v. 2.01. Biotatinated ECD-IR (Nordic BioSite) đã được cố định trên Chip cảm biến streptavidin SA (Cytiva). Bộ đệm HBS-P+ (Cytiva) được sử dụng làm bộ đệm đang chạy. Sau khi cố định ECD-IR, thời gian ổn định là 15 phút đã được đưa ra để đạt được đường cơ sở ổn định. NR-1, NR-2, NR-4, NR-7, NR-15, NR-8 và NR-8dsDNA được tiêm insulin ở nồng độ 11.4 nM trong dung dịch đệm đang chạy. Insulin và INS-DNA được tiêm ở nồng độ 55 nM, nồng độ tối thiểu để thu được đường cong liên kết có thể phân tích được. NR được tiêm dưới dạng đối chứng âm ở nồng độ bằng với nồng độ NanoRod cao nhất được sử dụng khi tiêm insulin NanoRod (NR-1 = 11.4 nM). Ngoài ra, NR-2, NR-4, NR-7 và NR-15 được tiêm cấu trúc nano ở nồng độ 5.7 nM (Hình dữ liệu mở rộng XNUMX). 4e) và NR-7^K-PEG cũng được tiêm insulin nồng độ 50 nM (Hình dữ liệu mở rộng. 9c). Việc tiêm từng mẫu được thực hiện bằng pha liên kết là 180 giây và pha phân ly là 300 giây. Hằng số cân bằng phân ly (K_D), hằng số tốc độ liên kết (k_on) và hằng số tốc độ phân ly (k_off) được xác định bằng phần mềm BIAevaluation 3.0. Các t_1/2 các giá trị xác định thời gian lưu trú được xác định bằng công thức ln2/k_off. Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, để so sánh sự liên kết của cấu trúc NR-7 giữa IR và IGF1R, các protein ECD-IR và ECD-IGF1R (Nordic BioSite) đã được cố định trên hai tế bào dòng khác nhau của chip cảm biến CM5 thông qua phản ứng ghép amin. Sự gắn kết của insulin và INS–DNA đã được kiểm tra bằng cách tiêm các nồng độ insulin khác nhau (6.2, 18.5, 55.6, 166.7 và 500.0 nM) vào đệm chạy (HBS-P+) ở chế độ động học một chu kỳ, sử dụng pha kết hợp của 140 giây và giai đoạn phân ly là 300 giây. Khả năng gắn kết của NR-7 đã được thử nghiệm bằng cách tiêm một nồng độ cấu trúc duy nhất (11.4 nM insulin) sử dụng pha liên kết là 180 giây và pha phân ly là 300 giây.

Gel Coomassie

Tại đây, 0.5 µg ECD-IR tái tổ hợp (Nordic BioSite) đã được treo lại trong dung dịch đệm mẫu Laemmli (Bio-Rad). Để khử các điều kiện, 2-mercaptoetanol được thêm vào nồng độ cuối cùng là 2.5%. Các mẫu được biến tính ở 80°C trong 10 phút, được phân giải bằng điện di trên gel natri dodecyl sulfate–polyacrylamide và nhuộm bằng vết protein an toàn GelCode Blue (Thermo Fisher Scientific).

Xét nghiệm dịch chuyển gel

NanoRods (NR và NR-7) ở 20 nM được ủ với miền ngoại bào tái tổ hợp 300 nM của IR người (Nordic BioSite) hoặc với PBS trong 30 phút ở 4 ° C. Sau đó, các mẫu được chạy trên gel agarose 2% và nhuộm bằng SYBR Safe.

Miễn dịch

Các tế bào được rửa bằng PBS, được lọc trong dung dịch đệm xét nghiệm ức chế miễn dịch phóng xạ (Sigma-Aldrich) có bổ sung cocktail ức chế protease và phosphatase (Thermo Fisher Scientific) và ủ trên đá và lắc trong 30 phút. Lysate được làm sạch bằng cách ly tâm (20,000 ×g trong 20 phút ở 4°C) và protein ly giải được định lượng bằng xét nghiệm protein Bradford (Bio-Rad). Các protein ly giải được nối lại trong dung dịch đệm mẫu Laemmli (Bio-Rad) chứa 2.5% 2-mercaptoetanol, biến tính ở 80 ° C trong 10 phút, được phân giải bằng điện di gel natri dodecyl sulfate-polyacrylamide và chuyển vào màng polyvinylidene fluoride. Màng được ủ 1 giờ trong dung dịch chặn (dung dịch muối Tris với 0.1% Tween 20 (TBST) và sữa khô không béo 5.0%), sau đó ủ qua đêm ở 4 ° C với kháng thể chính chống lại phospho-IR beta/IGF1R beta (CST 3024, 1:1,000), phospho-AKT-S473 (CST 4058, 1:1,000) hoặc GAPDH (Invitrogen PA1-987, 1:5,000). Sau ba lần rửa bằng TBST, màng được ủ với kháng thể thứ cấp liên hợp cải ngựa-peroxidase (Invitrogen, 31460, 1:5,000) trong 1 giờ tại RT. Việc phát hiện peroxidase cải ngựa được thực hiện bằng chất nền phát quang hóa học Immobileon Forte trên Hệ thống hình ảnh ChemiDoc (Bio-Rad). Đo mật độ dải được thực hiện bằng phần mềm ImageJ.

Đo tế bào dòng chảy

Các tế bào mỡ biệt hóa, thiếu huyết thanh đã được chuẩn bị như mô tả ở trên. Các tế bào mỡ sau đó được rửa hai lần bằng dung dịch muối cân bằng Hanks (HBSS) và phân ly trong dung dịch collagenase D (1.5 U ml^-1 collagenase D (Roche) và 10 mM CaCl₂ trong HBSS) trong 20 phút ở 37°C. Các tế bào được huyền phù lại trong HBSS, được lọc qua bộ lọc tế bào cân bằng HBSS 35 µm (BD Bioscatics), được ép viên ở tốc độ 300 ×g trong 5 phút và được treo lại trong dung dịch đệm nhuộm màu (1 × PBS và 1% albumin huyết thanh bò). Các tế bào chết được dán nhãn bằng Bộ thuốc nhuộm tế bào chết màu vàng có thể sửa chữa LIVE/DEAD (Thermo Fisher Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, và sau đó, huyền phù tế bào được ép viên ở tốc độ 300×.g trong 5 phút và được treo lại trong dung dịch đệm nhuộm màu. Ở đây ~100,000 tế bào đã được ủ với cấu trúc NanoRod có nhãn ATTO-10 647 nM trong thể tích cuối cùng là 100 µl trong 10 phút ở 37°C. Các tế bào được ủ mà không có cấu trúc NanoRod được sử dụng làm đối chứng chưa được xử lý. Sau đó, các tế bào được rửa hai lần bằng dung dịch đệm nhuộm màu bằng cách ly tâm ở tốc độ 300×.g trong 5 phút. Các phép đo tế bào học dòng chảy được thực hiện trên BD FACSCANTO II với phần mềm BD FACSDIVA phiên bản 9.0 (BD Bioscatics). Các tế bào mỡ sống ban đầu được xác định bằng cách chọn các tế bào trên FSC-A so với AmCyan-A, sau đó là chọn FSC-A so với FSC-H để phát hiện các tế bào đơn lẻ. Dữ liệu thu được được phân tích bằng phần mềm FlowJo 10.7.1 (BD Bioscatics). Giá trị trung bình hình học của cường độ huỳnh quang sau khi chuẩn hóa thành điều khiển chưa được xử lý đã được sử dụng để xác định mức độ ghi nhãn tế bào của NanoRods.

Chuẩn bị và giải trình tự thư viện RNA-seq

Tổng số RNA được phân lập từ các tế bào mỡ biệt hóa bằng cách sử dụng Quick-RNA Microprep Plus Kit (Zymo Research) và 500 ng RNA tinh khiết đã được sử dụng để chuẩn bị thư viện mRNA-seq bằng cách sử dụng TruSeq RNA Library Prep Kit v2 theo giao thức mẫu thấp của nhà sản xuất. Việc định lượng thư viện được thực hiện bằng hệ thống QuantiFluor dsDNA (Promega) theo giao thức đĩa đa giếng của nhà sản xuất trên máy đọc vi đĩa đa chế độ Varioskan LUX (Thermo Fisher). Kích thước và chất lượng thư viện được đánh giá bằng Bioanalyser 2100 và Bộ DNA có độ nhạy cao (Agilent). Các thư viện đã được biến tính và pha loãng bằng giao thức chuẩn hóa tiêu chuẩn NextSeq (Illumina) và trình tự được thực hiện bằng cách đọc một đầu (1 × 75 bp) với Bộ công cụ đầu ra cao NextSeq 500/550 v. 2.5 (75 chu kỳ) trên nền tảng NextSeq 550 ( Illumina).

Định lượng RNA-seq, phân tích DEG và GSEA

Trình tự đọc được ánh xạ dựa trên bản ghi tham chiếu của Cơ bắp trình tự phiên mã mã hóa protein (phát hành M29, GRCm39; https://www.gencodegenes.org/mouse/) và định lượng bằng Salmon 1.7.0 (ref. ³³). Bảng đếm được tạo bằng gói tximport³⁴ và danh sách DEG được lấy bằng gói DESeq2 (v. 1.34.0)³⁵, trong đó chỉ có các gen được điều chỉnh P các giá trị bằng hoặc dưới 0.001 và nhật ký₂giới hạn thay đổi lần ở mức ± 0.58 đã được xem xét để phân tích thêm. Bản đồ nhiệt và sơ đồ UpSet được tạo bằng ComplexHeatmap (v. 2.10.0)³⁶. GSEA cho các quá trình sinh học có cả thuật ngữ Gene Onology và con đường KEGG đã được thực hiện bằng cách sử dụng danh sách gen được xếp hạng làm đầu vào cho clusterProfiler (v. 4.2.2)³⁷ và tầm quan trọng của việc điều chỉnh tỷ lệ phát hiện sai P giá trị tương ứng dưới 0.10 và 0.05.

Vi tiêm Zebrafish và định lượng glucose tự do

NanoRod và insulin NanoRod được trộn với oligolysine-PEG (K₁₀-CỌC_5K, Alamanda Polymers) với tỷ lệ 1:1 giữa các amin của lysine trong K₁₀-CỌC_5K và photphat trong DNA³⁰và được ủ ở RT trong 30 phút trước khi tiêm vi mô 2 nl mẫu vào mỗi ấu trùng cá ngựa vằn. Các mẫu để tiêm được chuẩn bị ở nồng độ cuối cùng là 100 nM của cấu trúc đối với các mẫu NanoRod được phủ và ở nồng độ cuối cùng là 100 nM insulin đối với các mẫu NanoRod được phủ insulin (tương ứng với 100.0 và 14.3 nM của NanoRod đối với NR-1^K-PEG và NR-7^K-PEG, tương ứng). Tiêm 1 nl insulin người ở nồng độ 100 nM vào ấu trùng cá ngựa vằn đã được chứng minh là làm giảm nồng độ glucose tự do và những thay đổi phiên mã phù hợp với tín hiệu insulin³⁸. Do đó, chúng tôi đã tiêm 2 nl nồng độ insulin 100 nM vào các thử nghiệm của mình để đánh giá tác động qua trung gian insulin đối với mức glucose tự do. Vì tổng lượng máu của cá ngựa vằn 2 dpf là 60–89 nl (ref. ³⁹), nồng độ ước tính của insulin được tiêm trong các xét nghiệm của chúng tôi sẽ vào khoảng 2–3 nM. Trong các thử nghiệm này, chúng tôi cũng bị hạn chế về số lượng mẫu được tiêm, với mức tiêm cao hơn (3 và 4 nl) dẫn đến khả năng sống sót của ấu trùng kém.

Việc duy trì và lai cá ngựa vằn (D. rerio) được tiến hành tuân thủ luật pháp Thụy Điển về các quy định phúc lợi động vật được Stockholms djurförsöksetiska nämnd phê duyệt. Vì đối với các thí nghiệm cắt bỏ tế bào β và xét nghiệm glucose tự do chỉ sử dụng động vật dưới 5 ngày tuổi nên không cần có giấy phép đạo đức theo 2010/63/EU. Các dòng biến đổi gen của cá ngựa vằn được sử dụng đã được mô tả trước đây, cụ thể là, Tg(in:CFP–NTR)^s892 (tham khảo. ²⁷) Và Tg(in:Kaede)^s949 (tham khảo. ²⁸).

Việc cắt bỏ tế bào β được thực hiện ở trẻ XNUMX ngày tuổi Tg(in:CFP–NTR) Và Tg(in:CFP–NTR);Tg(in:Kaede) phôi bằng cách xử lý với 10 mM MTZ (Sigma-Aldrich) pha loãng trong 1% DMSO (VWR) trong dung dịch nước trứng (E3) bổ sung 0.2 mM 1-phenyl-2-thiourea (PTU, Acros Organics) trong 24 giờ. Sau khi cắt bỏ tế bào β, trẻ XNUMX ngày tuổi Tg(in:CFP–NTR) ấu trùng (72 hpf) được gây mê bằng tricaine 0.01% và tiêm 2 nl 1× PBS, insulin không biến tính hoặc NanoRod phủ NanoRod/insulin vào tĩnh mạch chính (ống Cuvier)⁴⁰. Phenol đỏ (Sigma-Aldrich) đến nồng độ cuối cùng là 0.1% đã được thêm vào các mẫu NanoRod PBS, insulin hoặc insulin được phủ để hỗ trợ hình dung quá trình vi tiêm và xác định ấu trùng được tiêm thành công. Ấu trùng cá ngựa vằn được phân ngẫu nhiên vào các nhóm điều trị. Mức glucose tự do được đo như mô tả ở nơi khác⁴¹ sử dụng bộ enzyme dựa trên huỳnh quang (BioVision). Các nhóm từ XNUMX đến XNUMX ấu trùng được tiêm được sử dụng cho mỗi điều kiện/lần lặp lại.

Hình ảnh đồng tiêu

Tg(in:CFP–NTR);Tg(in:Kaede) Ấu trùng được cắt bỏ được thu thập 24 giờ sau khi điều trị cắt bỏ, được gây mê và tiêm theo quy trình đã nêu trước đó và cố định trong dung dịch paraformaldehyd 4% trước khi phân tích số lượng tế bào β bằng hình ảnh đồng tiêu. Các hình ảnh đồng tiêu được thu được bằng kính hiển vi Leica TCS SP8 và phần mềm LAS X (v. 3.5.5.19976). Các đảo tụy nguyên phát của tế bào β bị cắt bỏ Tg(in:CFP–NTR);Tg(in:Kaede) ấu trùng được quét với vật kính ngâm trong nước × 40 và z ngăn xếp được phân tích bằng phần mềm Fiji (v1.53). Tất cả các hình ảnh hiển thị đều được lấy từ cùng một thử nghiệm và giá trị độ tương phản của chúng được điều chỉnh cho mục đích trực quan hóa. Việc định lượng tế bào β được thực hiện trên các hình ảnh gốc chưa sửa đổi.

Phân tích thống kê

Không có phương pháp thống kê nào được sử dụng để xác định trước cỡ mẫu, nhưng cỡ mẫu tương tự như cỡ mẫu được báo cáo trong các ấn phẩm trước đó^28,38,42. Các mẫu nuôi cấy tế bào và động vật được phân ngẫu nhiên vào nhóm đối chứng và nhóm điều trị. Việc thu thập và phân tích dữ liệu không được thực hiện mù quáng với các điều kiện của thí nghiệm. Các điểm dữ liệu riêng lẻ được vẽ cho hầu hết các biểu đồ. Cỡ mẫu (n) về số lần lặp lại sinh học thực nghiệm và các phương pháp thống kê được sử dụng được biểu thị trong chú thích hình tương ứng. Các bộ dữ liệu đã được kiểm tra phân phối Gaussian, sau đó là kiểm tra thống kê thích hợp. Phân tích thống kê và biểu diễn đồ họa của dữ liệu được xử lý bằng GraphPad Prism 9.4.0. Thử nghiệm Mann–Whitney hai đuôi được thực hiện để so sánh các đặc tính của cụm giữa tế bào đối chứng và tế bào được điều trị bằng insulin. Đối với việc định lượng Western blot, phân tích phương sai một chiều (ANOVA) sau đó là thử nghiệm so sánh nhiều lần của Dunnett đã được thực hiện. Để định lượng tế bào β, thử nghiệm Kruskal–Wallis sau đó là thử nghiệm so sánh nhiều lần của Dunn đã được thực hiện. Việc phân tích các giá trị glucose tự do được thực hiện bằng ANOVA một chiều với thử nghiệm so sánh nhiều lần của Tukey.

Tóm tắt báo cáo

Thông tin thêm về thiết kế nghiên cứu có sẵn trong Tóm tắt báo cáo danh mục đầu tư tự nhiên liên kết đến bài viết này.

• Phân phối nội dung và PR được hỗ trợ bởi SEO. Được khuếch đại ngay hôm nay.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. Trao quyền cho chính mình. Truy cập Tại đây.
• PlatoAiStream. Thông minh Web3. Kiến thức khuếch đại. Truy cập Tại đây.
• Trung tâmESG. Than đá, công nghệ sạch, Năng lượng, Môi trường Hệ mặt trời, Quản lý chất thải. Truy cập Tại đây.
• PlatoSức khỏe. Tình báo thử nghiệm lâm sàng và công nghệ sinh học. Truy cập Tại đây.
• nguồn: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01507-y