Chuẩn mực đạo đức

Tất cả các dòng iPSC trước đây đều có nguồn gốc từ nguyên bào sợi sinh thiết da, sau khi có sự đồng ý có chữ ký, được thu thập dưới sự phê duyệt về mặt đạo đức do Ủy ban Đạo đức Nghiên cứu Nam Wales (WA/12/0186) và Ủy ban Đạo đức Nghiên cứu Nam Trung Bộ Berkshire (REC10/H0505/71) cấp trong Cơ sở Tế bào gốc James Martin, Đại học Oxford, theo các quy trình được tiêu chuẩn hóa. Các dòng iPSC đều đã được xuất bản trước đó (xem bên dưới và Bảng bổ trợ 1).

văn hóa iPSC

Ba dòng iPSC có nguồn gốc từ ba bệnh nhân ALS khác nhau mang HRE trong C9orf72 và dưới dạng đối chứng, một dòng đồng phân, được tạo trước đây thông qua chỉnh sửa bộ gen CRISPR/Cas9 bằng cách sử dụng sửa chữa theo hướng tương đồng¹⁸và bốn dòng iPSC kiểm soát sức khỏe phù hợp với giới tính và độ tuổi đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Tất cả các dòng iPSC trước đây đã được xuất bản và mô tả rộng rãi (để biết chi tiết về nhân khẩu học và đặc tính, xem Bảng bổ trợ 1). iPSC được nuôi cấy trong mTeSR™1 (85850, Công nghệ StemCell) trên Geltrex™ (A1413302, ThermoFisher) với những thay đổi môi trường hàng ngày. Các tế bào được dẫn truyền bằng EDTA (0.5 mM), được nhân rộng để tạo ra nguồn tế bào đông lạnh, ổn định cho nghiên cứu (được bảo quản lạnh trong 50% mTeSR™1, 30% huyết thanh bào thai bào thai tế bào gốc phôi (16141002, Merck), 10% KnockOut™ DMEM ( 10829018, ThermoFisher), 10% DMSO (D2650, Merck)) với tối đa 3 lần truyền tiếp theo trong quá trình thử nghiệm và được xét nghiệm âm tính với mycoplasma bằng MycoAlert^TM Bộ phát hiện Mycoplasma (Lonza).

Sự khác biệt của tế bào thần kinh vận động có nguồn gốc iPSC

iPSC được phân biệt với MN bằng giao thức đã được công bố trước đó³⁹. Tóm lại, cảm ứng thần kinh được thực hiện bằng cách sử dụng DMEM-F12/Neurobasal 50:50 bổ sung N2 (1X), B27 (1X), 2-Mercaptoetanol (1X), Kháng sinh-Kháng nấm (1X, tất cả ThermoFisher), Axit ascoricic (0.5 μM) , Hợp chất C (1 μM, cả Merck) và Chir99021 (3 μM, Hệ thống R&D). Sau hai ngày nuôi cấy, Axit Retinoic (1 μM, Merck) và Chất chủ vận làm mịn (500 nM, Hệ thống R&D) đã được thêm vào. Sau 2 ngày nữa, Hợp chất C và Chir99021 đã bị loại bỏ. Vào ngày in vitro (DIV)18, các tế bào được mạ lại trên polyethylenimine (PEI, 0.07%, Merck) và Geltrex™ (ThermoFisher) hoặc PDL (Sigma-Aldrich)/ Laminin (Hệ thống R&D)/ Fibronectin (Corning) trong môi trường được bổ sung thêm BDNF (10 ng/mL), GDNF (10 ng/mL), Laminin (0.5 μg/mL, tất cả ThermoFisher) và DAPT (10 μM, Hệ thống R&D). Ba ngày sau, môi trường được thay đổi thành môi trường microglia như được mô tả dưới đây và MN được nuôi cấy cùng với microglia hoặc được duy trì trong chế độ độc canh. Một nửa thay đổi trung bình được thực hiện cứ sau 2 ngày4.

Sự khác biệt của tiền chất microglia có nguồn gốc từ iPSC

iPSC được phân biệt với tiền chất đại thực bào/microglia như được mô tả trước đây^15,40. Tóm lại, sự hình thành thể phôi (EB) được tạo ra bằng cách gieo iPSC vào các giếng Aggrewell 800 (STEMCELL Technologies) trong mTeSR™1 được bổ sung BMP4 (50 ng/mL), VEGF (50 ng/mL, cả Peprotech) và SCF (20 ng/mL, Miltenyi Biotec). Sau bốn đến bảy ngày với ¾ thay đổi trung bình hàng ngày, EB được chuyển sang bình T175 và được biệt hóa trong X-VIVO15 (Lonza), được bổ sung Interleukin-3 (25 ng/mL, Hệ thống R&D), MCS-F (100 ng/mL ), GlutaMAX (1X, cả ThermoFisher) và 2-Mercaptoetanol (1X). Môi trường tươi đã được thêm vào hàng tuần. Sau khoảng hai tháng, các tiền chất được thu hoạch bằng cách thu thập phần nổi phía trên, đưa qua máy lọc tế bào (40 μM, Falcon/Greiner) và được biệt hóa thành microglia trong phương pháp độc canh hoặc đồng nuôi cấy như mô tả dưới đây.

Sự khác biệt của microglia có nguồn gốc từ iPSC

Tiền chất microglia được mạ trên PEI (0.07%) và Geltrex™ hoặc PDL/Laminin/Fibronectin bằng môi trường microglia đặc trưng trước đây của chúng tôi¹⁷ bao gồm Advanced DMEM-F12 (ThermoFisher), GlutaMAX (1X), N2 (1X), Antibiotic-Antimycotic (1X), 2-Mercaptoetanol (1X), Interleukin-34 (100 ng/mL, Peprotech/BioLegend), BDNF ( 10 ng/mL), GDNF (10 ng/mL) và Laminin (0.5 μg/mL). Microglia được biệt hóa trong khoảng 14 ngày, với một nửa thay đổi trung bình cứ sau 2–4 ngày và được thu thập để chiết xuất RNA/protein hoặc được sử dụng để xét nghiệm.

Đồng nuôi cấy tế bào thần kinh vận động và microglia có nguồn gốc từ iPSC

Đồng môi trường được tạo ra như mô tả trước khi sử dụng dòng HC-2b (Bảng bổ trợ 1) để tạo ra MN¹⁷. Tóm lại, ba ngày sau lần mạ lại cuối cùng của các MN khác biệt (DIV21), tiền chất microglia đã được thu hoạch. MN được rửa sạch bằng PBS và tiền chất microglia được treo lại trong môi trường microglia được thêm vào từng giếng theo tỷ lệ 1: 1 với MN. Đồng môi trường được duy trì trong ít nhất 14 ngày, với một nửa thay đổi môi trường cứ sau 2–4 ngày. Trong các thí nghiệm chọn lọc, sự tiếp xúc trực tiếp của hai loại tế bào đã được ngăn chặn bằng cách cấy microglia vào các miếng cấy nuôi cấy mô (kích thước lỗ 0.4 µm, 83.3932.040, Sarstedt).

Tạo ra microglia bằng phương pháp điều trị bằng chất ức chế LPS và MMP9

Đối với môi trường độc canh vi mô, tất cả môi trường đều được hút và LPS (100 ng/mL, L4391, Merck) trong môi trường vi mô được thêm vào trong 48 giờ. Các giếng đối chứng chỉ nhận được môi trường microglia tươi. Trong các điều kiện chọn lọc, các phương pháp điều trị LPS lặp đi lặp lại được thực hiện vào ngày 0, 2 và 4. Đối với đồng nuôi cấy, các phương pháp xử lý LPS được bắt đầu trên DIV25 và thực hiện trong 10 ngày. Một nửa môi trường được hút và thay thế bằng LPS trong môi trường microglia (nồng độ cuối cùng: 100 ng/mL), với một nửa môi trường thay đổi bổ sung bằng môi trường microglia chứa LPS trên DIV29 và 33. Trong các thí nghiệm bổ sung, phương pháp xử lý LPS đã được bắt đầu trên DIV25 và được thực hiện trong 20 ngày, với một nửa phương tiện thay đổi mỗi ngày. BDNF và GDNF đã được loại bỏ khỏi môi trường nuôi cấy cho các thí nghiệm này. Để ức chế MMP9, các mẫu cấy được xử lý đồng thời bằng LPS (100 ng/mL) và chất ức chế MMP9 I (MMP9i, 3 μM, 444278, Merck) hoặc DMSO ở nồng độ bằng nhau (0.3%) khi kiểm soát phương tiện.

Mồi microglia với TNF/IL1B

Tất cả môi trường được hút từ môi trường độc canh vi mô và TNF (50 ng/mL) và IL1B (20 ng/mL, cả Peprotech) trong môi trường vi mô được thêm vào trong 48 giờ. Các giếng đối chứng chỉ nhận được môi trường microglia tươi.

Điều trị MN bằng chất ức chế rhMMP9 và MMP9

MN được xử lý bằng MMP9 hoạt động tái tổ hợp của con người (rhMMP9, 30 ng/mL, PF024-5UG, Merck) và MMP9i (3 μM, 444278, Merck) hoặc DMSO ở nồng độ bằng nhau (0.3%) khi kiểm soát phương tiện. Các phương pháp điều trị được thực hiện trên DIV21 và DIV25, và khả năng sống sót của MN được xác định bằng xét nghiệm MTS trên DIV29.

Hình ảnh trực tiếp của quá trình thực bào và định lượng

Các quá trình nuôi cấy vi mô thần kinh đệm không được kích thích và mồi LPS (100 ng/mL trong 48 giờ) được nhuộm bằng Hoechst trong Giải pháp hình ảnh tế bào sống (1:10,000, ThermoFisher) trong 10 phút. pHrodo™ Red Zymosan Bioparticles™ (P35364, ThermoFisher) trong Giải pháp chụp ảnh tế bào sống (50 µg/mL) được thêm vào từng giếng và hình ảnh được thu được sau 150 phút bằng Hệ thống chụp ảnh tế bào lõi EVOS™ XL (ThermoFisher) được trang bị 10 x khách quan. Trong các điều kiện được chọn, các tế bào được xử lý bổ sung bằng chất ức chế thực bào/phân hủy Cytochalasin D (10 M, C2618, Merck), Bafilomycin A1 (1 μM, 1334, Hệ thống R&D) hoặc DMSO (phương tiện), với thời gian tiền xử lý là 1 giờ. Việc định lượng được thực hiện tự động bằng cách sử dụng macro phân tích ở Fiji và diện tích các hạt thực bào trên mỗi tế bào thu được bằng cách chia diện tích của các hạt thực bào đã nội hóa cho số lượng microglia dương tính với Hoechst.

Điện sinh lý kẹp

Điện sinh lý kẹp toàn bộ tế bào đã được thực hiện như mô tả trước đây¹⁷. Các MN đối chứng khỏe mạnh trên DIV 42–46 trong môi trường nuôi cấy đồng thời với đối chứng khỏe mạnh hoặc microglia có nguồn gốc từ bệnh nhân C9orf72-ALS được duy trì trong dung dịch ngoại bào chứa 167 mM NaCl, 2.4 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 10 mM glucose, 10 mM HEPES và 2 mM CaCl₂ điều chỉnh về độ pH 7.4 và 300 mOsm. Các điện cực có điện trở đầu từ 7 đến 12 MΩ được sản xuất từ ​​thủy tinh borosilicate (đường kính trong 0.86 mm; đường kính ngoài 1.5 mm). Một dung dịch nội bào được thêm vào điện cực chứa 140 mM K-Gluconate, 6 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM MgATP, 0.5 mM Na₃GTP, được điều chỉnh về pH 7.3 và 290 mOsm. Việc thu thập dữ liệu được thực hiện bằng bộ khuếch đại Multiclamp 700B, digidata 1550 A và phần mềm kẹpEx 6. Loạt kháng chiến (R_s) được duy trì ở mức <30 MΩ. Dòng điện kênh kiểm soát điện áp được đo trên kẹp điện áp trong đó các tế bào thần kinh được tạo xung trước trong 250 ms với xung −140 mV và điện áp bước 10 mV được áp dụng từ −70 mV đến +70 mV. Điện thế hoạt động cảm ứng (AP) đã được ghi lại trên kẹp hiện tại, tế bào thần kinh được giữ ở −70 mV và 15 bước hiện tại là 10 pA được áp dụng từ −10 pA đến 130 pA. Dòng điện kênh bị kiểm soát điện áp và các đặc tính của điện thế hoạt động cảm ứng (rheobase, AP tối đa, AP trên rheobase) đã được định lượng bằng cách sử dụng Kẹpfit 10.3 (bộ phần mềm pCLAMP, Thiết bị phân tử). Số AP tối đa được định lượng bằng cách xác định số lượng AP được quét bằng chuyến tàu dài nhất. Thời lượng và biên độ AP được định lượng trong Matlab R2022a (MathWorks) bằng cách sử dụng điện thế hoạt động đầu tiên được ghi lại từ mỗi nơ-ron.

Bản ghi MEA

Tổng cộng, đã thu được 2–15 phút ghi lại hoạt động thần kinh cho quá trình nuôi cấy trong các tấm mảng đa điện cực (MEA) 48 giếng (M768-tMEA-48B, Axion BioSystems) bằng hệ thống Maestro (Axion Biosystems). Phân tích được thực hiện bằng phần mềm AXIS v2.5.2 (Axion BioSystems) với SD > 5.5 làm ngưỡng phát hiện. Tốc độ bắn trung bình trên mỗi giếng được tính bằng cách lấy trung bình tất cả các điện cực đang hoạt động (>1 gai/phút) trên mỗi giếng.

Phân lập RNA và RT-qPCR

RNA được chiết xuất bằng bộ RNAeasy Mini Plus (Qiagen) và lượng RNA tương đương (100 ng) được sao chép ngược thành cDNA bằng cách sử dụng Bộ phiên mã ngược cDNA công suất cao (ThermoFisher). PCR thời gian thực định lượng được thực hiện với Fast SYBR™ Green Master Mix (ThermoFisher) bằng Hệ thống PCR LightCycler® 480 (Roche) và các đoạn mồi (ThermoFisher) được liệt kê trong Bảng bổ sung 3. Tất cả các bộ dụng cụ đã được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Định lượng biểu hiện gen nếp gấp tương đối được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp 2^–∆∆Ct phương pháp chuẩn hóa thành TBP gen tham chiếu (TBP Ct phạm vi 0.5) và biểu hiện gen trung bình của microglia đối chứng cho mỗi thí nghiệm.

trình tự RNA

Ba dòng đối chứng khỏe mạnh và ba dòng iPSC có nguồn gốc từ bệnh nhân C9orf72-ALS được phân biệt thành microglia, với ba điểm khác biệt độc lập trên mỗi dòng. RNA được chiết xuất như mô tả ở trên. Tất cả các mẫu RNA hiển thị giá trị RIN ít nhất là 8.5. Việc chuẩn bị mẫu và phân tích tin sinh học sau đó được thực hiện như mô tả trước đây¹⁷. Tóm lại, các mẫu đã được chuẩn hóa thành 100 ng trước khi chuẩn bị thư viện. Việc làm giàu bản phiên mã polyadenylat hóa và chuẩn bị thư viện cụ thể cho chuỗi đã được hoàn thành bằng cách sử dụng bộ mRNA NEBNext Ultra II (NEB) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trình tự kết thúc được ghép nối (độ dài đọc: 150 cặp cơ sở) đã được thực hiện bằng nền tảng NovaSeq6000 (bộ thuốc thử Illumina, NovaSeq 6000 S2/S4, v1.5, 300 chu kỳ), tạo ra số lần đọc thô tối thiểu 30 M lần đọc trên mỗi mẫu . Các lần đọc kết thúc được ánh xạ tới bộ gen tham chiếu GRCh38.p13 của con người (https://www.gencodegenes.org) sử dụng HisAT2 v2.2.1⁴¹. Bảng đếm được lấy bằng FeatureCounts v2.0.1⁴². Việc chuẩn hóa số lượng và phân tích biểu thức vi phân được thực hiện bằng DESeq2 v1.28.1⁴³ trong RStudio 1.4.1103, bao gồm giới tính sinh học trong mô hình và phương pháp Stewamini-Hochberg để hiệu chỉnh nhiều thử nghiệm. Ba điểm khác biệt khác nhau cho mỗi điều kiện được thu gọn thành một điểm dữ liệu trừ khi có chỉ định khác trong đó bản sao giới tính sinh học và sự khác biệt được đưa vào mô hình. Phân tích dữ liệu thăm dò được thực hiện sau khi chuyển đổi ổn định phương sai của bảng đếm, sử dụng phân tích thành phần chính. Nhật ký₂ thay đổi lần (log₂ fc) việc co ngót được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp 'bình thường'. Gen với | nhật ký₂ fc| > 0.5 và được điều chỉnh p-value <0.05, 3.16.1 được xác định là các gen biểu hiện khác nhau (DEG). Dữ liệu được diễn giải bằng các chú thích từ cơ sở dữ liệu Gene Onology bằng clusterProfiler vXNUMX⁴⁴. Chúng tôi đã phân tích việc làm giàu con đường bằng cách thực hiện phân tích biểu diễn quá mức (ORA) cho tất cả các DEG và phân tích làm giàu bộ gen (GSEA) trên toàn bộ bản phiên mã được xếp hạng theo nhật ký₂fc, sử dụng cài đặt tiêu chuẩn trong clusterProfiler cho ORA và GSEA (đã điều chỉnh p-value < 0.05 bằng phương pháp Stewamini-Hochberg).

Miễn dịch huỳnh quang

Các tế bào nuôi cấy trên lá kính phủ được cố định trước bằng 2% paraformaldehyde (PFA) trong PBS trong 2 phút ở nhiệt độ phòng (RT) và sau đó cố định bằng 4% PFA trong PBS trong 15 phút nữa tại RT. Sau khi thẩm thấu và ngăn chặn bằng huyết thanh lừa 5% và Triton X-0.2 100, 1% trong PBS trong XNUMX giờ tại RT, các lớp phủ được ủ với các kháng thể chính được liệt kê trong Bảng bổ sung 2, pha loãng trong huyết thanh lừa 1% và Triton X-0.1 100% trong PBS, ở 4°C ON. Sau ba lần rửa bằng PBS-0.1% Triton X-100, mỗi lần rửa 5 phút, các lá kính đậy được ủ với kháng thể huỳnh quang thứ cấp tương ứng Alexa Fluor® 488/568/647 chống chuột/thỏ/dê/chuột lang (tất cả 1:1000, ThermoFisher hoặc Abcam). Sau đó, lớp phủ được rửa hai lần bằng PBS-0.1% Triton X-100, mỗi lần 5 phút và ủ với DAPI (1 µg/mL, Sigma-Aldrich) trong PBS trong 10 phút. Sau bước rửa thêm 5 phút với PBS-0.1% Triton X-100, các lá kính đậy được gắn lên các phiến kính hiển vi bằng cách sử dụng Chất gắn chống phai màu Kim cương, Vàng hoặc Thủy tinh ProLong™ (ThermoFisher). Kính hiển vi đồng tiêu được thực hiện bằng kính hiển vi LSM 710, LSM 880 (cả Zeiss) hoặc Fluoview FV1000 (Olympus).

Phân tích sự phân nhánh vi mô

Bốn đến năm hình ảnh ngăn xếp z (khoảng z: 1 μm) của các trường hình ảnh được chọn ngẫu nhiên được chụp ở độ phóng đại 60 lần cho mỗi lớp phủ và các phép chiếu cường độ tối đa được tạo ra ở Fiji. Để phân tích sự phân nhánh của microglia dương tính IBA1 trong độc canh và nuôi cấy đồng thời, khối lượng tế bào, chỉ số phân nhánh, chiều dài nhánh trung bình và số điểm nhánh được xác định tự động bằng cách sử dụng 3DMorph như được mô tả ở nơi khác¹⁹.

Định lượng sai định vị TDP-43 trong microglia

Bốn đến năm hình ảnh xếp chồng z của các trường thị giác được chọn ngẫu nhiên được chụp ở độ phóng đại 60 lần cho mỗi lớp phủ và các phép chiếu cường độ tối đa được tạo ra ở Fiji. Các giá trị cường độ trung bình của TDP-43 trong nhân và tế bào chất được xác định theo kiểu mù, với tín hiệu DAPI và IBA1 được sử dụng để xác định ranh giới hạt nhân và tế bào chất tương ứng. Sau đó, tỷ lệ tế bào chất và TDP-43 hạt nhân đã được tính toán.

Định lượng biểu hiện dấu hiệu microglia trong độc canh microglia

Ba hình ảnh xếp chồng z của các trường thị giác được chọn ngẫu nhiên được chụp ở độ phóng đại 40 lần cho mỗi lớp phủ và các phép chiếu cường độ tối đa được tạo ra ở Fiji. Số lượng hạt nhân dương tính với DAPI và IBA1⁺/DAPI⁺ và TMEM119⁺/DAPI⁺ các ô được tự động định lượng trên mỗi trường xem cho từng dòng bằng macro.

Định lượng số lượng và tỷ lệ microglia và tế bào thần kinh vận động trong cùng nuôi cấy

Ba đến năm hình ảnh xếp chồng z của các trường thị giác được chọn ngẫu nhiên được chụp ở độ phóng đại 10 lần hoặc 40 lần cho mỗi lớp phủ và các phép chiếu cường độ tối đa được tạo ra ở Fiji. Đối với microglia, sử dụng macro, ngưỡng tự động đã được áp dụng trên kênh IBA1 để tạo mặt nạ và số lượng tế bào vi mô được xác định cho từng trường xem bằng cách đếm số lượng hạt nhân dương tính với DAPI trong mặt nạ IBA1 bằng cách sử dụng 'phân tích chức năng của các hạt Đối với MN, ngưỡng tự động được áp dụng trên kênh TUJ1 để tạo mặt nạ và số lượng nơ-ron được xác định cho từng trường xem bằng cách đếm số lượng hạt nhân dương tính với DAPI trong mặt nạ TUJ1 bằng chức năng 'hạt phân tích'. Để tính tỷ lệ microglia:MN, số lượng tế bào vi mô được chia cho số MN. Để đánh giá tỷ lệ sống sót của MN sau khi tiếp xúc với LPS trong thời gian dài, số MN tuyệt đối đã được chuẩn hóa thành giá trị trung bình của các vạch kiểm soát để xác định tỷ lệ sống sót tương đối của MN bằng cách tính đến các hiệu ứng lô giữa các lần phân biệt sau khi nuôi cấy dài hạn.

Định lượng biểu hiện dấu hiệu apoptotic trong đồng văn hóa

Năm hình ảnh ngăn xếp z của các trường thị giác được chọn ngẫu nhiên được chụp ở độ phóng đại 40 lần cho mỗi lớp phủ. Dự báo cường độ tối đa đã được tạo ra. Bằng cách sử dụng macro, ngưỡng tự động được áp dụng trên kênh TUJ1 để tạo mặt nạ và biểu thức của dấu hiệu apoptotic CC3 trong tế bào thần kinh được xác định cho từng trường xem bằng cách định lượng vùng tín hiệu CC3 trong mặt nạ TUJ1 bằng cách sử dụng 'phân tích chức năng của các hạt Để tính đến các hiệu ứng hàng loạt giữa các khác biệt, sự thay đổi lần lượt trong biểu thức được tạo ra bằng cách chuẩn hóa các phép đo tuyệt đối thành giá trị trung bình của các đường điều khiển.

Định lượng sự phát triển của nơ-ron thần kinh trong đồng văn hóa

Bốn đến năm ngăn xếp z của các trường xem được chọn ngẫu nhiên hiển thị các tế bào thần kinh nhưng tránh các tế bào thần kinh thần kinh thu được ở độ phóng đại 60 lần cho mỗi lớp phủ. Dự báo cường độ tối đa được tạo ra ở Fiji. Bằng cách sử dụng macro, ngưỡng tự động được áp dụng cho nhuộm TUJ1 và sự phát triển của nơ-ron thần kinh cho từng trường xem được xác định bằng cách đo diện tích của các nơ-ron dương tính với TUJ1 trên mỗi trường xem bằng chức năng 'phân tích hạt' ở Fiji.

Phân tích biểu hiện synolinehysin tế bào thần kinh

Bốn đến năm hình ảnh ngăn xếp z của các trường hình ảnh được chọn ngẫu nhiên được chụp ở độ phóng đại 60 lần cho mỗi lớp phủ. Dự báo cường độ tối đa được tạo ra ở Fiji. Bằng cách sử dụng macro, ngưỡng tự động được áp dụng cho nhuộm synolinehysin để phân tích các cấu trúc giống như dấu chấm, đồng thời số lượng và diện tích của các hạt synolinehysin được xác định cho từng trường xem bằng chức năng 'phân tích hạt' ở Fiji.

kính soi ARN

Các tiêu điểm RNA được phát hiện bằng cách sử dụng Xét nghiệm RNAscope Multiplex Fluorescent v2 (323100, ACD) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, microglia iPSC cố định với 4% PFA được khử nước tuần tự ở nồng độ 50%, 70% và 100% ethanol trong mỗi lần 1 phút và được bảo quản ở −20 ° C. Sau khi bù nước bằng ethanol 100%, 70% và 50%, các tế bào được ủ với 0.1% Tween-20 trong PBS, hydro peroxide và Protease III (tỷ lệ pha loãng 1:15) trong 10 phút mỗi lần, với rửa PBS ở giữa. Đầu dò nhắm mục tiêu (G₄C₂)_n và C₄G₂)_n các bản mở rộng (ACD, 884351-C2 và 884361-C2) đã được thêm vào các nắp đậy riêng biệt và được ủ trong 2 giờ, sau đó là các bước khuếch đại và phát triển theo giao thức chuẩn. ICC tuần tự được thực hiện bằng cách ủ với kháng thể chính chống lại IBA1 (1:200, 019-19741, Wako Fujifilm) trong 2 giờ tại RT và sau đó theo quy trình miễn dịch huỳnh quang được nêu chi tiết ở trên.

Định lượng sự hình thành các tiêu điểm RNA trong microglia

Năm hình ảnh ngăn xếp z của các trường thị giác được chọn ngẫu nhiên được chụp ở độ phóng đại 40x hoặc 63x cho mỗi lớp phủ và các phép chiếu cường độ tối đa được tạo ra ở Fiji. Số lượng tế bào dương tính với tiêu điểm và số lượng tiêu điểm trên mỗi nhân tiêu điểm dương tính được xác định bằng cách đếm thủ công.

Xét nghiệm khả năng tồn tại của MTS

Trong các thử nghiệm chọn lọc, khả năng tồn tại của MN được xác định bằng cách sử dụng Xét nghiệm tăng sinh tế bào CellTiter 96® AQueous One Solution (MTS, G3580, Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Việc đọc đĩa được thực hiện sau 90–120 phút ủ với thuốc thử xét nghiệm.

Đo lường sự giải phóng cytokine/chemokine và sợi thần kinh

Chất nổi trên bề mặt nuôi cấy được thu thập và kéo xuống ở 1200 xg và 4 ° C trong 10 phút. Các mẫu gộp được phân tích bằng Mảng Proteome Profiler Human XL Cytokine (ARY022B) hoặc Mảng ức chế Protease/Protease (ARY025, cả hai Hệ thống R&D) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tín hiệu được hiển thị trên ChemiDoc^TM Hệ thống hình ảnh MP (Bio-Rad) và được phân tích bằng ImageStudioLite v5.2.5 (LI-COR). Ngoài ra, Human DPP4 (DC260B), MMP9 (DMP900), CXCL10 Quantikine ELISAs (DIP100) và Active MMP9 Fluorokine E Kit (F9M00, tất cả các Hệ thống R&D) đều được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sự giải phóng chuỗi ánh sáng sợi thần kinh (NfL) của con người được đo bằng xét nghiệm Meso Scal Discovery (MSD) (K1517XR-2) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Chiết xuất protein

Các tế bào được rửa bằng PBS và 100–200 μL dung dịch đệm RIPA lạnh (ThermoFisher) được bổ sung đầy đủ^TM cocktail ức chế protease và PhosSTOP^TM chất ức chế phosphatase (cả Merck) đã được thêm vào từng giếng. 10 xung 1 giây với chày điều khiển bằng động cơ được áp dụng cho mỗi mẫu để đồng nhất hóa chất ly giải. Sau khi ủ trên đá trong 30 phút, mẫu được ly tâm ở tốc độ 12,000 vòng/phút và 4^oC trong 15 phút và chất nổi phía trên được bảo quản ở −80 ° C. Việc định lượng nồng độ protein được thực hiện bằng máy Pierce^TM Bộ xét nghiệm Protein Axit Bicinchoninic (ThermoFisher) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, các mẫu protein được chuẩn bị ở nồng độ xác định (0.3–1.0 μg/μL) bằng cách pha loãng trong nước cất, NuPAGE^TM tải bộ đệm và NuPAGE^TM chất khử mẫu (cả ThermoFisher). Tiếp theo là ủ ở 95°C trong 5 phút để làm biến tính và khử mẫu.

Western blot

5–20 μg mỗi mẫu và Thang protein phạm vi rộng nhiều màu Spectra hoặc Thang protein uy tín PageRuler™ (cả ThermoFisher) đã được tải lên NuPAGE đúc sẵn^TM Gel gradient Bis-Tris 4–12% (ThermoFisher). Các mẫu được phân tách bằng phương pháp điện di trên gel natri dodecyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE) bằng NuPAGE^TM Bộ đệm chạy MES (ThermoFisher) ở 50–130 V. Sau đó, protein được chuyển đến màng nitrocellulose ở 20–25 V trong 7 phút bằng hệ thống thấm khô iBlot 2 (cả ThermoFisher). Sau khi ngăn chặn bằng 5% sữa hoặc BSA trong TBS/0.1% Tween-20 (TBS-T, ThermoFisher) tại RT trong một giờ, màng được ủ với các kháng thể chính được liệt kê trong Bảng bổ sung 4 pha loãng trong sữa 3% hoặc BSA trong TBS-T ở 4°C qua đêm. Màng được rửa ba lần bằng TBS-T trong 7 phút và sau đó được ủ với kháng thể thứ cấp kết hợp peroxidase (HRP) cải ngựa tương ứng ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Các kháng thể thứ cấp được kết hợp với HRP sau đây (tất cả 1:5000) đã được sử dụng: HRP chống chuột (NA931V), HRP chống chuột lừa (NA934V, cả GE Healthcare), HRP chống chuột lừa (PA1-28664, ThermoFisher) . Màng lại được rửa ba lần bằng TBS-T trong 7 phút và sau đó được ủ trong một phút bằng dung dịch phát quang hóa tăng cường (Millipore). ChemiDoc^TM Hệ thống hình ảnh MP đã được sử dụng để hiển thị tín hiệu. Cường độ băng tần được định lượng bằng cách sử dụng Fiji v1.53q⁴⁵ và được chuẩn hóa thành các gen giữ nhà β-actin hoặc GAPDH và biểu hiện trung bình của các biện pháp kiểm soát cho từng thí nghiệm. Sau khi phát triển, màng được rửa bằng TBS-T hai lần trong 5 phút, sau đó ủ 10 phút với Restore^TM Bộ đệm tước PLUS (ThermoFisher). Sau hai lần rửa bổ sung 5 phút bằng TBS-T, các màng bị chặn và được ủ với các kháng thể chính mới như mô tả ở trên.

Phân tích biểu thức Poly(GA)/(GP)

Các tế bào được ly giải trong bộ đệm RIPA (Sigma-Aldrich) được bổ sung 2× hoàn chỉnh Mini, cocktail ức chế protease không chứa EDTA (Merck) và 2% SDS (ThermoFisher) và được đồng nhất hóa bằng phương pháp siêu âm. Sau khi ly tâm ở tốc độ 17,000 × g ở 16 ° C trong 20 phút, hàm lượng protein của chất nổi phía trên được xác định như mô tả trong Phương pháp bổ sung. Các mẫu được điều chỉnh về cùng nồng độ (0.6–1.0 mg/mL) và xét nghiệm miễn dịch MSD được thực hiện ở dạng đơn phức bằng cách sử dụng đĩa SECTOR 96 giếng (MSD) để định lượng biểu hiện Poly(GA)/(GP), như đã mô tả trước đây²⁰. Nói tóm lại, các đĩa được phủ bằng kháng thể kháng poly(GP) hoặc kháng poly(GA) không nhãn. Sau khi ngăn chặn, các mẫu được nạp ở mức 45 µg protein vào mỗi giếng đối với xét nghiệm miễn dịch poly(GP) và ở mức 27 µg protein đối với xét nghiệm miễn dịch poly(GA). Các kháng thể kháng poly (GP) và kháng poly (GA) được đánh dấu biotin đã được sử dụng làm máy dò, tiếp theo là streptavidin được gắn thẻ sulfo (Meso Scal Discovery, R32AD). Các đĩa được đọc bằng bộ đệm đọc MSD (Meso Scal Discovery, R92TC) bằng cách sử dụng MSD Sector Imager 2400. Tín hiệu tương ứng với cường độ ánh sáng phát ra khi kích thích điện hóa của đĩa xét nghiệm. Trước khi phân tích, số đọc trung bình từ máy hiệu chuẩn không chứa peptit sẽ bị trừ khỏi mỗi lần đọc. Tín hiệu tiêu cực được đặt thành '0'.

Thống kê và khả năng tái sản xuất

Không có phương pháp thống kê nào được sử dụng để xác định trước cỡ mẫu. Các nhà điều tra đã bị mù quáng trong việc phân bổ trong quá trình phân tích nếu thiết kế thử nghiệm cho phép. Các phân tích thống kê được thực hiện bằng GraphPad Prism 9. Không có dữ liệu nào bị loại khỏi phân tích. Dữ liệu từ nhiều dòng và sự khác biệt được gộp lại để so sánh hiệu quả tổng thể của C9orf72 HRE so với kiểm soát. Việc so sánh hai nhóm được thực hiện bằng các thử nghiệm t không ghép đôi hai đuôi và so sánh nhiều nhóm bằng ANOVA một chiều hoặc hai chiều với các thử nghiệm hậu hoc thích hợp như được chỉ ra trong truyền thuyết hình. Số lượng thí nghiệm và dòng độc lập được chỉ định trong mỗi chú thích hình. Dữ liệu được trình bày dưới dạng điểm dữ liệu duy nhất và có nghĩa là ± SEM. Sự khác biệt được coi là đáng kể khi P < 0.05 (*P <0.05; **P <0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; ns: không đáng kể). Các ô hình hộp hiển thị đường trung vị (đường giữa), phần tư trên và phần tư dưới (giới hạn hộp), phạm vi liên vùng 1.5x (râu) và các giá trị ngoại lệ (điểm). GraphPad Prism 9 hoặc RStudio 1.4.1103 đã được sử dụng để vẽ dữ liệu. Việc lắp ráp các hình cuối cùng được thực hiện bằng Adobe Illustrator 25.4.1.

Tóm tắt báo cáo

Thông tin thêm về thiết kế nghiên cứu có sẵn trong Tóm tắt báo cáo danh mục đầu tư tự nhiên liên kết đến bài viết này.

• Phân phối nội dung và PR được hỗ trợ bởi SEO. Được khuếch đại ngay hôm nay.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. Trao quyền cho chính mình. Truy cập Tại đây.
• PlatoAiStream. Thông minh Web3. Kiến thức khuếch đại. Truy cập Tại đây.
• Trung tâmESG. Than đá, công nghệ sạch, Năng lượng, Môi trường Hệ mặt trời, Quản lý chất thải. Truy cập Tại đây.
• PlatoSức khỏe. Tình báo thử nghiệm lâm sàng và công nghệ sinh học. Truy cập Tại đây.
• nguồn: https://www.nature.com/articles/s41467-023-41603-0