Lấy mẫu bệnh phẩm

Các mẫu bệnh phẩm được thu thập bằng cách dùng tăm bông ngoáy họng (gạc lau hầu họng) của bệnh nhân, như đã mô tả trước đây²⁶. Các mẫu được thu thập từ những bệnh nhân có bệnh cảnh lâm sàng giống COVID-19 và được thử nghiệm bằng qRT-PCR sau khi chiết tách axit nucleic. Tóm lại, sau khi thu thập, các miếng gạc được đặt vào một ống mẫu có dán nhãn chứa dung dịch đệm ly giải (4 M guanidine thiocyanate, 25 mM Tris–HCl, 0.5% β-mercaptoethanol và MS2 RNA (200 ng μl^-1; Roche)). Ống được khuấy nhẹ để đảm bảo sự phân bố đều của dung dịch đệm ly giải. Các bước an toàn đã được mô tả trước đây và được thực hiện trong phòng thí nghiệm CL2 được chứng nhận²⁶.

Chiết xuất axit nucleic

Tổng axit nucleic được chiết xuất bằng cách sử dụng các hệ thống dựa trên cột quay và được sử dụng bằng xét nghiệm qRT-PCR tiêu chuẩn hóa²⁶. Điều khiển khuếch đại bên trong (MS2 (~6 × 10⁴ PFU ml^-1) trên 10 ml dung dịch đệm ly giải) đã được thêm vào dung dịch đệm ly giải nạp thêm (25 µl trên 10 ml dung dịch đệm ly giải). Mẫu được rửa giải trong 100 µl nước không có nuclease (nfH₂Ô; Invitrogen) và để yên trong 1 phút trước khi ly tâm trong 1 phút ở 21,130×g (15,000 vòng/phút) trong tủ vi lọc để bàn. Các mẫu rửa giải được trực tiếp xử lý qRT-PCR. Các chất chiết xuất axit nucleic còn lại được bảo quản ở −80 °C và tiếp tục được sử dụng cho cảm biến nanopore nanobait.

qRT-PCR cho SARS-CoV-2

Phát hiện SARS-CoV-2 đã được thực hiện như mô tả trước đây²⁶. Mỗi phản ứng, hỗn hợp chính chứa 12.5 µl hỗn hợp phản ứng một bước 2× Luna Universal Probe, 0.5 µl mồi chuyển tiếp 20 µM Wu (5′-ATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGA-3), 0.5 µl mồi ngược 20 µM Wu (5′ -GCAGTTGTGGCATCTCCTGATGAG-3′), 0.3 µl của 10 µM MGB Probe 3 fluorescein (5′-ATGCTTAGAATTATGGCCTCAC-3′), 0.5 µl của 10 µM mồi chuyển tiếp kiểm soát nội bộ cho MS2 RNA, 0.5 µl của 10 µM mồi đảo ngược kiểm soát nội bộ cho MS2 RNA, 0.3 µl đầu dò bên trong 10 µM (MS2 ROX), 1 µl Hỗn hợp Enzyme Luna WarmStart RT và 3.9 µl nfH₂O. Sau đó, 20 µl hỗn hợp chính được chia vào từng giếng của đĩa 96 giếng và sau đó được kết hợp với 5 µl của mỗi dịch chiết. Kiểm soát chiết xuất và khuếch đại bên trong MS2 trải qua giao thức chiết xuất đầy đủ được đưa vào làm đối chứng chiết xuất âm tính trong tối thiểu hai giếng trên tấm qRT-PCR. Để xác định khả năng nhiễm bẩn trong quy trình qRT-PCR, 5 µl nfH₂O được đưa vào làm đối chứng âm tính qRT-PCR. Sau đó, 5 µl plasmid mẫu SARS-CoV-2 tăng vọt được đưa vào một giếng duy nhất làm đối chứng dương tính với qRT-PCR. Sau khi thêm 5 µl của mỗi mẫu vào giếng được chỉ định, đĩa được niêm phong bằng một miếng nhựa trong suốt về mặt quang học. Tấm được ly tâm trong 1 phút ở 2,000 ×g (1,000 vòng/phút) ở 4°C, sau đó đưa vào máy qRT-PCR (QuantStudio, Thermo Fisher Khoa học) và quá trình này được tham số hóa. Đã thu được tín hiệu cho fluorescein (FAM) và carboxyrhodamine (ROX). ROX được sử dụng để phát hiện kiểm soát MS2 bên trong và fluorescein được sử dụng để phát hiện RNA của SARS-CoV-2. Thử nghiệm được thực hiện trong 2 phút ở 25°C, 15 phút ở 50°C (đối với enzyme phiên mã ngược), 2 phút ở 90°C, trước 45 chu kỳ ở 95°C trong 3 giây sau đó là 60°C trong 30 giây . Kết quả được xác định bằng cách xác nhận các biện pháp kiểm soát dương tính chính xác (khuếch đại plasmid), kiểm soát chiết xuất và khuếch đại của tất cả các mẫu (kênh ROX), không khuếch đại trong các biện pháp kiểm soát âm tính và giá trị trung bình nhất quán của các biện pháp kiểm soát. Khả năng dương tính với SARS-CoV-2 được xác nhận bằng cách khuếch đại trong kênh huỳnh quang với đường cong sigmoidal thích hợp với giá trị CT ≤36. Các giá trị CT của đầu dò MS2 và MGB 3 được duy trì để theo dõi chất lượng và độ tái lập của xét nghiệm⁴⁴.

Cắt RNase H có thể lập trình cho mồi nano

Đối với cảm biến lỗ nano, các biện pháp kiểm soát ARN của SARS-CoV-2, chiết xuất axit nucleic (mẫu bệnh phẩm) hoặc ARN của vi rút MS2 được sử dụng thêm để phát hiện bằng mồi nano. Đầu tiên, chúng tôi trộn oligo dẫn hướng với mẫu và đun nóng đến 70°C trong 5 phút. RNase H (5,000 đơn vị mỗi ml; NEB) đã được thêm vào, trộn đều và đun nóng trong 20 phút ở 37°C để cho phép enzym cắt RNA trong DNA: lai RNA giúp giải phóng RNA đích một cách hiệu quả. RNase H bị bất hoạt nhiệt bằng cách ủ ở 65 ° C trong 10 phút. Các oligo dẫn hướng đã được xác thực để không hình thành các cấu trúc nội phân tử, đồng nhất hoặc dị vòng bằng phần mềm NUPACK⁴⁵. Đối với phép đo với mục tiêu vắng mặt, cùng một giao thức bao gồm cả oligos hướng dẫn đã được sử dụng. Các phép đo kiểm soát cho thấy không có sự dịch chuyển và do đó, chúng tôi có thể loại trừ bất kỳ liên kết chéo đáng kể nào khỏi các oligo dẫn hướng.

Thuộc tính trình tự mục tiêu virus cho nanobait

Độ dài của mục tiêu, độ dài móng chân và hàm lượng GC đã được chọn để đảm bảo sự lai tạo tối ưu²¹. Đối với các thiết kế mồi nano DNA, các trình tự đích đã được chọn nằm trong các vùng được bảo tồn của bộ gen virus và có hàm lượng GC từ 40–60% để tạo thành song công 20 bp ổn định. Chiều dài phần móng được chọn là dài 6 nt và có hàm lượng GC từ 40–60%. Chúng tôi đã thử nghiệm tất cả các trình tự để tìm các tương tác nội phân tử hoặc các chất đồng hóa có độ ổn định cao không mong muốn tiềm ẩn bằng cách sử dụng phần mềm NUPACK (ứng dụng web 2020)⁴⁵. Sau đó, chúng tôi đã thực hiện kiểm tra phản ứng chéo giữa nhiều trang web được sử dụng trong mỗi thử nghiệm⁴⁵.

Chuẩn bị hoa DNA cho nanobait

Chúng tôi đã thiết kế một bông hoa DNA làm nhãn khác để phát hiện ARN của SARS-CoV-2 từ các mẫu của bệnh nhân. Ba bông hoa DNA dành riêng cho từng mục tiêu SARS-CoV-2 (điểm nối bảy chiều, 7WJa, 7WJb và 7WJc) đã được chuẩn bị riêng biệt. Lấy 7WJc làm ví dụ, chuỗi DNA 4 μM J1, J2, J3 và J4c (Bảng bổ trợ 1) được trộn với nhau trong dung dịch đệm TM (10 mM Tris–HCl, 10 mM MgCl₂, pH 8.0) và làm nóng đến 90°C trong 5 phút, sau đó làm lạnh xuống 65°C trong 15 phút, 45°C trong 15 phút, 37°C trong 20 phút, 25°C trong 20 phút và cuối cùng là 4° C trong 20 phút. Sợi J4c được thay thế bởi J4b để chuẩn bị cho 7WJb. Đối với 7WJa, để tránh hiện tượng tự cuộn lại ở vị trí 43 trên mồi nano, J1, J2, J3 J4a và C43 được trộn với nhau trước khi ủ.

Tự lắp ráp DNA nanobait

Mồi nano DNA được lắp ráp bằng cách trộn DNA chuỗi đơn M13 tuyến tính hóa (M13mp18, 7,249 nt, Guild Bioscatics, 100 nM) với các oligonucleotide bổ sung ngắn¹² (một số trong số đó chứa các cấu trúc tham chiếu và các chuỗi bắt giữ) và bằng cách thêm các chuỗi bổ sung một phần đã được đánh dấu biotin 3′ cho phản ứng dịch chuyển chuỗi qua trung gian ngón chân. DNA M13 được tuyến tính hóa (dài 7,228 nt) được bổ sung bởi các oligonucleotide, do đó tạo ra một mồi nano sợi đôi có biệt danh với phần nhô ra bốn đầu deoxythymidine hai đầu ngăn chặn quá trình đa nhân hóa¹². Hỗn hợp chứa 20 nM DNA M13 được tuyến tính hóa, 60 nM oligonucleotide (gấp ba lần so với DNA M13), các chuỗi 3′ đánh dấu biotin ở nồng độ 180 nM, 10 mM MgCl₂ và 1× TE (10 mM Tris–HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0). Nó được trộn bằng pipet và quay xuống trước khi làm nóng đến 70 ° C trong 30 giây và làm nguội trong 45 phút đến nhiệt độ môi trường. Các oligonucleotide dư thừa được loại bỏ bằng bộ lọc ly tâm Amicon Ultra 0.5 ml với ngưỡng 100 kDa bằng dung dịch đệm rửa (10.0 mM Tris–HCl pH 8.0, 0.5 mM MgCl₂). Nếu hoa DNA được sử dụng làm nhãn, thì các chuỗi bổ sung một phần mang nó được ủ trong 10 mM MgCl₂ trong 2 giờ ở nhiệt độ môi trường và sau đó, quá trình lọc Amicon được thực hiện như mô tả ở trên. Tính không đối xứng của thiết kế mồi nano cho phép xác định rõ ràng các vị trí liên kết. Mồi nano được lưu trữ cho đến khi được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo trong điều kiện 4–10 °C trong 0.5 mM MgCl₂, 10.0 mM Tris–HCl, pH 8.0. Thiết kế mồi nano được kiểm tra bằng cách đọc lỗ nano trước mỗi phép đo.

Nanopore readout DNA nanobait

Mồi nano được trộn với một mẫu (chiết xuất axit nucleic hoặc các mục tiêu virus đã được tinh chế với lượng vượt quá gấp 10 lần) trong XNUMX mM MgCl₂ và 100mM NaCl. Hỗn hợp (5 μl) được ủ ở nhiệt độ phòng (~ 10 phút) cho đến khi chuẩn bị cho phép đo nanopore. Sự khác biệt về thành phần trình tự mục tiêu và các đặc tính vật lý của nó có thể dẫn đến sự thay đổi trong quá trình lai tạo và do đó, hiệu quả dịch chuyển của các vị trí cảm biến²¹. Chúng tôi đã sử dụng htRNA (100 ng μl^-1; Invitrogen) làm nền khi được chỉ định, để chỉ ra rằng không có tín hiệu không đặc hiệu nào do RNA tự nhiên của con người gây ra. Đối với phép đo lỗ nano, mẫu được pha loãng thành mồi nano <0.5 nM (đối với các mục tiêu virus đã tinh chế) hoặc 4.7 μl mẫu bệnh nhân cắt RNase-H được trộn với 0.3 μl streptavidin đơn trị (SAe1D3)¹⁸ (1 μM), 5 μl LiCl (4.0 M) và 5.0 μl LiCl (8.0 M). Chúng tôi đã chế tạo các hạt nano 14 ± 3nm (trung bình ± độ lệch chuẩn)¹² sử dụng các mao quản thủy tinh thạch anh có đường kính ngoài 0.5 mm và đường kính trong 0.2 mm (Dụng cụ Sutter) bằng máy kéo hỗ trợ laser P-2000 (Dụng cụ Sutter). Hỗn hợp này được hút bằng pipet trong chip polydimethylsiloxane có lỗ nano và tất cả các phép đo được thực hiện ở điện áp không đổi 600 mV. Chi tiết đo lường Nanopore được hiển thị trong Bảng bổ trợ 30.

Phân tích dữ liệu nanopore thời gian thực

Phân tích dữ liệu Nanopore được giải thích chi tiết trong Phần bổ sung 14. Tóm lại, các sự kiện mồi nano được lọc ra khỏi dấu vết dòng ion thô, sau đó vùng phát hiện được xác định và thông tin về sự hiện diện của gai tại mỗi vị trí cụ thể được trích xuất. Hiệu suất dịch chuyển được vẽ trên đồ thị được tính là hiệu suất dịch chuyển cho một phép đo được trừ vào điều khiển không có mục tiêu cho mỗi vị trí (50 sự kiện mồi nano cho mỗi trong số ba bản ghi lỗ nano), trừ khi có quy định khác:

Chúng tôi đã xác minh rằng mạng thần kinh tích chập QuipuNet²⁷ có khả năng phân tích thời gian thực dữ liệu nanopore theo quy trình được mô tả. Trước đây, chúng tôi đã chứng minh rằng với khoảng mười sự kiện, chúng tôi đạt độ tin cậy 99% trong việc phát hiện tích cực các cấu trúc DNA được thiết kế của chúng tôi⁴⁶.

hình ảnh AFM

Hình ảnh mồi nano AFM (Nanosurf Mobile S) được thực hiện trong không khí ở chế độ không tiếp xúc. Các cấu trúc mồi nano được pha loãng thành 1 ng μl^-1 trong 1 mM MgCl₂ và 10 μl được thêm vào mica mới tách, ủ trong 1 phút, rửa sạch bằng nước Milli-Q đã lọc và sau đó thổi khô bằng nitơ. Trước khi quét, tấm mica được dán vào bệ mẫu AFM bằng băng dính hai mặt. Phân tích và trực quan hóa hình ảnh được thực hiện bằng Gwyddion (phiên bản 2.60).

Phân tích thống kê

Đối với tất cả các phép đo, khoảng tin cậy 99.9% cho hiệu suất dịch chuyển đã được tính toán. Ý nghĩa thống kê giữa hai trang web không có và có mục tiêu đã được kiểm tra bằng cách sử dụng hai mặt của Sinh viên t-kiểm tra.

Tóm tắt báo cáo

Thông tin thêm về thiết kế nghiên cứu có sẵn trong Tóm tắt báo cáo danh mục đầu tư tự nhiên liên kết đến bài viết này.

• Phân phối nội dung và PR được hỗ trợ bởi SEO. Được khuếch đại ngay hôm nay.
• Platoblockchain. Web3 Metaverse Intelligence. Khuếch đại kiến ​​thức. Truy cập Tại đây.
• nguồn: https://www.nature.com/articles/s41565-022-01287-x