Biểu hiện của chất vận chuyển axit dicarboxylic và loại bỏ các con đường sản phẩm phụ

Việc giới thiệu trước đây về con đường rTCA vào I. phương Đông (chủng SA) (Hình. 1B) cho phép sản xuất SA với hiệu giá 11.6 g/L trong quá trình lên men trong bình lắc¹³. Để cải thiện hơn nữa hiệu giá, chúng tôi đã cố gắng thể hiện một phương tiện vận chuyển cho SA. MAE1 từ quả bưởi Schizosaccharomyces (SpMAE1) được coi là chất vận chuyển axit dicarboxylic hiệu quả nhất để xuất khẩu SA¹⁸. Codon được tối ưu hóa SpMAE1 được tích hợp vào bộ gen của chủng SA tạo thành chủng SA/MAE1. Các chủng SA và SA/MAE1 được đánh giá khả năng sản xuất SA bằng cách lên men bình lắc trong môi trường tối thiểu (SC-URA) với 50 g/L glucose trong điều kiện hạn chế oxy. Sự giới thiệu của SpMAE1 cải thiện đáng kể hiệu giá SA từ 6.8 g/L lên 24.1 g/L (Hình XNUMX). 2, Hình bổ sung. 1A, và Hình bổ sung. 1B).

Thanh lỗi, trung bình ± SD (n  = 3 mẫu độc lập về mặt sinh học). *p < 0.05, **p  < 0.01, ***p  < 0.001, ns không đáng kể, tính bằng hai đuôi không ghép đôi t-Bài kiểm tra. Dữ liệu nguồn được cung cấp dưới dạng tệp Dữ liệu nguồn.

Hình ảnh kích thước đầy đủ

Ethanol là sản phẩm phụ chính và tích lũy ở mức 9.5 g/L trong quá trình lên men của chủng SA/MAE1. Ethanol được hình thành do phản ứng được xúc tác bởi rượu dehydrogenase (ADH), enzyme này sử dụng NADH để khử acetaldehyde thành ethanol. Do việc sản xuất SA bằng con đường rTCA cần có NADH, nên việc loại bỏ con đường hình thành ethanol có thể cải thiện việc sản xuất SA. Hơn nữa, mặc dù glycerol tích lũy ít hơn 1 g/L và không phải là sản phẩm phụ chính được quan sát thấy trong quá trình lên men của chủng SA/MAE1, nhưng con đường hình thành glycerol được xúc tác bởi glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPD) có thể có khả năng cạnh tranh với con đường rTCA để tạo ra cacbon và NADH. Như vậy, cả hai PDC (pyruvate decarboxylase) và GPD đã bị xóa ở chủng SA/MAE1, tạo thành chủng SA/MAE1/pdc∆/gpd∆. Trong khi xóa PDC để ngăn chặn sự hình thành ethanol về mặt lý thuyết nên cải thiện hiệu giá SA do sự gia tăng sẵn có của cả pyruvate và NADH, quá trình lên men của chủng SA/MAE1/pdc∆/gpd∆ bất ngờ dẫn đến hiệu giá SA tương tự là 24.6 g/L và tích lũy là 19.8 g/L pyruvate trong điều kiện hạn chế oxy (Hình XNUMX). 2 và Hình bổ sung. 1C).

Gần đây, một mô hình quy mô bộ gen đã được xây dựng cho I. phương Đôngvà tất cả các hoạt động ADH được dự đoán sẽ tập trung ở ty thể¹⁹. Vì vậy, việc loại bỏ việc sản xuất ethanol thông qua PDC việc xóa sẽ không tăng cường tính khả dụng của NADH tế bào, dẫn đến không tăng hiệu giá SA. Về cân bằng NADH trong tế bào, quá trình đường phân tạo ra 2 mol pyruvat và 2 mol NADH từ 1 mol glucose, trong khi đó để chuyển 1 mol pyruvate thành 1 mol axit succinic cần 2 mol NADH. Do đó, mặc dù chu trình TCA khử có hiệu suất lý thuyết cao nhất nhưng hiệu suất thực tế của SA trong nấm men chỉ bị giới hạn ở mức 1 mol/mol glucose. Chúng tôi đã tiến hành ¹³Phân tích thông lượng trao đổi chất C (MFA) và xác minh rằng con đường rTCA sử dụng hiệu quả hầu hết NADH tế bào được tạo ra bởi quá trình glycolysis để sản xuất SA và bài tiết pyruvate chiếm một nửa số pyruvate được tạo ra từ bước cuối cùng của quá trình glycolysis (Hình bổ sung. 2). Chúng tôi cũng biểu thị một bản sao bổ sung của con đường rTCA hoặc gen riêng lẻ của con đường này ở chủng SA/MAE1/pdc∆/gpd∆ để điều chỉnh thêm dòng cacbon giữa pyruvate và SA, nhưng không có thay đổi đáng kể về hiệu giá SA hoặc sự tích lũy pyruvate (Hình bổ sung. 3). Do đó, việc thiếu nguồn cung cấp NADH trong bào tương là trở ngại chính cho việc sản xuất SA thông qua con đường rTCA.

Đồng lên men glucose và glycerol để sản xuất SA

Vì chỉ riêng glucose không tạo ra đủ NADH tế bào để sản xuất SA nên các nguồn carbon khác có thể được xem xét để đạt được hiệu giá và năng suất cao hơn. Glycerol có mức độ khử cao hơn và do đó có thể tạo ra nhiều chất khử tương đương NADH hơn so với glucose^20,21. Do chủng SA/MAE1/pdc∆/gpd∆ biểu hiện các khiếm khuyết tăng trưởng trong môi trường SC-URA với glycerol là nguồn carbon duy nhất, nên chúng tôi đã tìm cách thực hiện quá trình lên men của chủng này bằng môi trường SC-URA với 50 g/L glucose và 20 g /L glycerol. Trước đây, việc sử dụng glucose và glycerol làm nguồn carbon kép đã được chứng minh là giúp tăng cường quá trình chuyển đổi oxaloacetate thành malate thông qua việc tăng cung cấp NADH từ glycerol trong cơ chế kỹ thuật. M. succiniciproducens⁶. Như thể hiện trong Hình bổ sung. 4A, các tế bào có thể tiêu thụ cả hai chất nền để sản xuất SA trong điều kiện hạn chế oxy; tuy nhiên, mức tiêu thụ glycerol chậm và hiệu giá SA được cải thiện chỉ còn 30.5 g/L sau 7 ngày lên men. Sau đó, chúng tôi thực hiện quá trình lên men trong điều kiện hiếu khí, cho rằng quá trình chuyển hóa glycerol có thể bị hạn chế ở điều kiện hạn chế oxy. Trong điều kiện hiếu khí, cả glucose và glycerol đều được tiêu thụ nhanh hơn, cho phép tạo ra 38.6 g/L SA (Hình XNUMX). 2 và Hình bổ sung. 4B). Chúng tôi cũng đã thử nghiệm quá trình lên men của chủng SA/MAE1/pdc∆/gpd∆ trên môi trường SC-URA với 50 g/L glucose trong điều kiện hiếu khí. Điều thú vị là, trong khi con đường rTCA là con đường lên men và việc sục khí cao hơn có thể truyền nhiều dòng carbon hơn vào chu trình TCA để hô hấp hiếu khí, chúng tôi đã quan sát thấy rằng các điều kiện hiếu khí dẫn đến hiệu giá tương tự so với điều kiện hạn chế oxy và các tế bào có thể tiêu thụ glucose. nhanh hơn, dẫn đến năng suất cao hơn (Hình bổ sung. 4C).

Xóa một nhà nhập khẩu axit dicarboxylic và NADH dehydrogenase bên ngoài

Việc xóa thêm gen sau đó đã được cố gắng để tăng sản xuất SA. Gần đây, các chất vận chuyển carboxylate họ JEN PkJEN2-1 và PkJEN2-2 ở Pichia kudriavzevii được đặc trưng là có liên quan đến sự hấp thu axit dicarboxylic vào bên trong^22,23. PkJEN2-1 và PkJEN2-2 được chú thích là g3473 và g3068 trong I. phương Đông, tương ứng. g3473 đã bị xóa khỏi chủng SA/MAE1/pdc∆/gpd∆, dẫn đến chủng g3473∆. Quá trình lên men của chủng này trong môi trường SC-URA với 50 g/L glucose và 20 g/L glycerol đã cải thiện hiệu giá SA lên 42.0 g/L (Hình XNUMX). 2 và Hình bổ sung. 5A), cho thấy rằng việc ngăn chặn SA xâm nhập lại vào tế bào là có lợi. g3068 tiếp tục bị loại ở chủng g3473∆; tuy nhiên, chúng tôi quan sát thấy rằng sự gián đoạn của cả hai chất vận chuyển JEN2 đã làm giảm hiệu giá SA xuống 34.5 g/L và do đó không có lợi (Hình bổ sung. 5B). Kết quả này không nhất quán với báo cáo trước đó rằng việc xóa cả hai phương tiện vận chuyển JEN trong P. kudriavzevii CY902 dẫn đến hiệu giá SA cao hơn so với việc xóa một gen, điều này có thể là do các nền tảng di truyền khác nhau. P. kudriavzevii CY902 được thiết kế để tạo ra SA bằng cách sử dụng con đường oxy hóa TCA (oTCA) bằng cách xóa gen tiểu đơn vị phức hợp succinate dehydrogenase SDH5, trong khi sản xuất SA trong thiết kế của chúng tôi I. phương Đông SD108 đã đạt được bằng cách sử dụng con đường rTCA. Hơn nữa, dựa trên MFA, một lượng nhỏ NADH tế bào đã bị oxy hóa bởi NADH dehydrogenase (NDE) của ty thể bên ngoài, vận chuyển các electron từ NADH tế bào đến chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể (Hình bổ sung. 2). kinh nghiệm cận tử được nhắm mục tiêu làm gián đoạn chủng g3473∆, dẫn đến chủng g3473∆/nde∆. So với chủng g3473∆, kinh nghiệm cận tử việc xóa tiếp tục cải thiện hiệu giá SA lên 46.4 g/L, cho thấy việc loại bỏ kinh nghiệm cận tử tăng nhóm NADH tế bào để sản xuất SA (Hình XNUMX). 2 và Hình bổ sung. 5C). Tuy nhiên, sự gián đoạn của kinh nghiệm cận tử giảm tỷ lệ tiêu thụ glucose; do đó, mặc dù có hiệu giá cao hơn, chủng g3473∆/nde∆ có năng suất tương tự như chủng g3473∆ (Hình XNUMX). 2).

Cải thiện mức tiêu thụ glycerol

Việc tiêu thụ glycerol chậm cho thấy quá trình chuyển hóa glycerol nội sinh có thể không hoạt động mạnh. Trước đây, sự biểu hiện quá mức của glycerol dehydrogenase (GDH) từ Pichia angusta và dihydroxyacetone kinase nội sinh (DAK) đã thiết lập một con đường tiêu thụ glycerol sản xuất NADH trong S.cerevisiae²⁴. Vì vậy, chúng tôi đã tìm cách sử dụng một chiến lược tương tự để cải thiện mức tiêu thụ glycerol trong I. phương Đông. Codon được tối ưu hóa PaGDH và nội sinh DAK được biểu hiện quá mức ở chủng g3473∆ và g3473∆/nde∆, dẫn đến các chủng lần lượt là g3473∆/PaGDH-DAK và g3473∆/nde∆/PaGDH-DAK. Quá trình lên men của các chủng này trong môi trường SC-URA với 50 g/L glucose và 20 g/L glycerol không dẫn đến hiệu giá SA cao hơn; g3473∆/PaGDH-DAK và g3473∆/nde∆/PaGDH-DAK tạo ra SA ở hiệu giá lần lượt là 41.9 g/L và 46.5 g/L, tương tự như hiệu giá đạt được bởi các chủng bố mẹ không có sự biểu hiện quá mức của PaGDH và DAK (Sung. 2, Hình bổ sung. 6A, và Hình bổ sung. 6B). Tuy nhiên, sự biểu hiện quá mức của PaGDH và DAK có lợi cho cả tỷ lệ sử dụng glucose và glycerol. Năng suất tăng từ 0.29 lên 0.44 g/L/h ở chủng g3473∆/PaGDH-DAK và từ 0.28 đến 0.32 g/L/h ở chủng g3473∆/nde∆/PaGDH-DAK (Hình XNUMX). 2 và Hình bổ sung. 6C).

Chủng g3473∆/PaGDH-DAK có thể tạo ra 25.4 g/L SA trong quá trình lên men sử dụng 50 g/L glucose, trong khi có thể thu được 41.9 g/L SA từ 50 g/L glucose và 20 g/L glycerol (Bổ sung Quả sung. 7A). Vì hiệu giá SA 41.9 g/L cũng có thể đạt được chỉ bằng cách sử dụng nhiều glucose ban đầu hơn trong quá trình lên men chỉ sử dụng glucose, nên người ta có thể đặt câu hỏi về lợi ích của việc sử dụng glucose và glycerol làm nguồn carbon kép. Trên cơ sở tương đương carbon, 1 gam glucose tương đương với 1 gam glycerol. Sử dụng 50 g/L glucose và 20 g/L glycerol cho phép tạo ra SA tương đương 0.60 g/g glucose, cao hơn hiệu suất 0.51 g/g glucose từ quá trình lên men chỉ sử dụng 50 g/L glucose (Hình bổ sung). . 7B). Hơn nữa, từ 70 g/L glucose, nồng độ tương đương 50 g/L glucose và 20 g/L glycerol, chủng g3473∆/PaGDH-DAK có thể tạo SA với hiệu giá chỉ 35.6 g/L và hiệu suất 0.50. g/g glucose (Hình bổ sung. 7). Do đó, việc sử dụng hỗn hợp glucose và glycerol làm nguồn carbon cho phép sản xuất SA ở hiệu giá cao hơn và năng suất cao hơn so với việc sử dụng lượng glucose tương đương. Chúng tôi cũng so sánh khả năng sản xuất SA ở chủng g3473∆/PaGDH-DAK sử dụng 50 g/L glucose và các nồng độ glycerol khác nhau là 10 g/L, 20 g/L và 30 g/L (Hình bổ sung. 8). Đúng như dự đoán, hiệu giá SA tăng khi lượng glycerol ban đầu tăng; do đó, việc so sánh giữa các hiệu giá là không có ý nghĩa. Ngoài ra, hiệu suất thấp nhất khi sử dụng 10 g/L glycerol. Không có sự khác biệt đáng kể về năng suất khi sử dụng 20 g/L và 30 g/L glycerol; tuy nhiên, năng suất đạt cao nhất khi sử dụng 20 g/L glycerol. Vì vậy, chúng tôi coi 20 g/L glycerol là nồng độ tối ưu để sử dụng cùng với 50 g/L glucose để sản xuất SA.

Chúng tôi cũng đã cố gắng làm giảm sự ức chế dị hóa của glucose đối với việc tiêu thụ glycerol thông qua việc loại bỏ hexokinase, được chứng minh là làm giảm tốc độ phosphoryl hóa glucose và cho phép đồng sử dụng glucose và xyloza trong S.cerevisiae²⁵. Thông qua phân tích BLAST, ba gen hexokinase tiềm năng (g1398, g2945 và g3837) đã được xác định và chỉ việc xóa g3837 trong chủng g3473∆/PaGDH-DAK cho phép tiêu thụ đồng thời cả glucose và glycerol (Hình bổ sung. 9). Mặc dù có thể đạt được các hiệu giá SA tương tự nhưng việc xóa g3837 đã làm giảm tỷ lệ tiêu thụ glucose và glycerol, dẫn đến năng suất không tăng.

Lên men theo mẻ và mở rộng quy mô

Sau quá trình lên men trong bình lắc, chúng tôi đã thực hiện quá trình lên men theo mẻ để tăng hiệu giá của SA và để đánh giá hiệu suất của chủng được thiết kế của chúng tôi trong sản xuất quy mô lớn. Để khai thác khả năng chịu đựng vượt trội với độ pH thấp của I. phương Đông, chúng tôi đã chọn thực hiện quá trình lên men theo mẻ ở pH 3. Ở độ pH này, khoảng 90% loài SA được proton hóa hoàn toàn SA, trong khi 10% loài còn lại là hydro succinate²⁶. Đầu tiên chúng tôi thử nghiệm hiệu suất của chủng g3473∆/PaGDH-DAK, được chọn thay vì g3473∆/nde∆/PaGDH-DAK do năng suất cao hơn, sử dụng môi trường SC-URA với 50 g/L glucose và 20 g/L glycerol trong quá trình lên men theo mẻ trong lò phản ứng sinh học để bàn có kích thước 0.3 L và thể tích làm việc 0.1 L trong điều kiện khuấy trộn tĩnh và phun liên tục O₂ và đồng₂. Chúng tôi quan sát thấy rằng các hiệu giá (27.1 g/L và 30.7 g/L ở 0.333 vvm (thể tích trên thể tích làm việc mỗi phút) của CO₂ và 0.667 vvm CO₂, tương ứng) thấp hơn nhiều so với hiệu giá thu được trong quá trình lên men bình lắc (42.1 g/L) (Hình bổ sung. 10A, B). Đặc biệt, trong khi các chất chuẩn độ SA tương tự có thể được tạo ra từ glucose trong cả bình phản ứng và bình lắc, thì chất chuẩn độ SA được tạo ra trong giai đoạn sử dụng glycerol lại thấp hơn nhiều trong lò phản ứng sinh học. Chúng tôi cũng đã tiến hành lên men theo mẻ trong lò phản ứng sinh học sử dụng chủng g3473∆/PaGDH-DAK/g3837∆ và quan sát thấy chủng này có thể tạo ra nhiều SA hơn trong giai đoạn tiêu thụ glycerol và có thể thu được hiệu giá 38.8 g/L SA ở 0.167 vvm O₂ và 0.667 vvm CO₂ (Hình bổ sung. 10C, D). Chúng tôi đã yêu cầu rằng mặc dù glycerol đang được sử dụng trong môi trường lò phản ứng sinh học có độ sục khí cao hơn môi trường bình lắc, nhưng nhiều dòng carbon hơn có thể được chuyển đến chu trình TCA và dẫn đến hiệu giá SA thấp hơn; mặt khác, việc xóa g3837 có thể kìm hãm hoạt động của các gen chu trình TCA và cải thiện việc sản xuất SA. Phân tích PCR thời gian thực được sử dụng để so sánh mức độ phiên mã của các gen trong con đường rTCA và một số gen được chọn trong chu trình TCA (citrate synthase, Thuế TNDN; aconitase, ACO; và isocitrate dehydrogenase, HDI) ở các chủng g3473∆/PaGDH-DAK có hoặc không có tính năng xóa g3837 được trồng trong môi trường YP có glycerol. Chúng tôi quan sát thấy rằng việc loại bỏ g3837 duy trì các biểu hiện gen tương tự trong con đường rTCA nhưng làm giảm mức độ biểu hiện của Thuế TNDN, sự tương đồng của ACOvà HDIs (Hình bổ sung. 11). Do đó, hoạt động của các gen trong chu trình TCA thấp hơn có thể dẫn đến hiệu giá SA cao hơn thu được từ chủng g3473∆/PaGDH-DAK/g3837∆ trong lò phản ứng sinh học. Quá trình lên men theo mẻ của chủng g3473∆/PaGDH-DAK/g3837∆ trong môi trường SC-URA với việc cho ăn glucose và glycerol tạo ra 109.5 g/L SA với hiệu suất tương đương 0.65 g/g glucose và hiệu suất 0.54 g/ L/giờ (Hình. 3A). Khi kết thúc quá trình lên men, chúng tôi quan sát thấy sự hình thành các tinh thể, có khả năng là SA (Hình bổ sung. 12). Trong khi các axit hữu cơ khác, chẳng hạn như axit lactic và axit axetic, hoàn toàn có thể trộn lẫn trong nước dùng ở pH 1–14, độ hòa tan của SA giảm khi độ pH trở nên axit hơn.²⁷.

A Lên men liên tục chủng g3473∆/PaGDH-DAK/g3873∆ trong môi trường tối thiểu với glucose và glycerol. B Lên men liên tục chủng g3473∆/PaGDH-DAK/ScSUC2 trong môi trường nước mía. C Lên men hàng loạt chủng g3473∆/PaGDH-DAK/ScSUC2 trong môi trường nước mía trong lò phản ứng quy mô thí điểm. Dữ liệu nguồn được cung cấp dưới dạng tệp Dữ liệu nguồn.

Hình ảnh kích thước đầy đủ

Sau hiệu suất lên men cao của sản phẩm tái tổ hợp của chúng tôi I. phương Đông chủng sử dụng môi trường tối thiểu thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm, sau đó chúng tôi đã thử nghiệm việc sản xuất SA bằng cách sử dụng chất nền công nghiệp thực sự là nước mía. Mía là cây C4 lâu năm tiết kiệm năng lượng nhất và có năng suất sinh khối cao hơn so với các loại cây trồng khác như cỏ switchgrass và miscanthus²⁸. Hơn nữa, nước mía, làm nguyên liệu làm từ sucrose, rẻ hơn so với các chất nền làm từ glucose và tinh bột như ngô và sắn.²⁹. Kể từ I. phương Đông không thể sử dụng sucrose, invertase SUC2 từ S.cerevisiae được biểu thị bằng g3473∆/PaGDH-DAK. Quá trình lên men hàng loạt xảy ra trong 48 giờ đầu tiên và SA có thể được tạo ra ở hiệu giá 46.0 g/L, hiệu suất tương đương 0.40 g/g glucose và năng suất 0.96 g/L/h. Với việc cho ăn nước mía cô đặc sau đó, chủng được thiết kế của chúng tôi có thể tạo ra SA ở hiệu giá 104.6 g/L, hiệu suất tương đương 0.63 g/g glucose và năng suất 1.25 g/L/h ở quy mô chuẩn (Hình XNUMX). 3B).

Hơn nữa, chúng tôi đã mở rộng quy trình lên men SA bằng cách sử dụng nước mía từ quy mô dự bị đến quy mô thí điểm. Ở đây, chúng tôi đã xác định các thông số quy trình để duy trì công suất đầu vào tương tự trên mỗi đơn vị thể tích và cùng số Reynolds giữa các lò phản ứng sinh học quy mô băng ghế dự bị và quy mô thí điểm, đồng thời quá trình lên men theo mẻ được thực hiện trong lò phản ứng sinh học quy mô thí điểm có kích thước 75 L và một lò phản ứng sinh học đang hoạt động. thể tích 30 L hoặc hệ số tăng tỷ lệ 300× so với lò phản ứng sinh học để bàn. Chủng của chúng tôi có thể tạo ra SA ở hiệu giá 63.1 g/L, hiệu suất tương đương 0.50 g/g glucose và năng suất 0.66 g/L/h ở pH 3 (Hình XNUMX). 3C). Do yêu cầu về khối lượng, chúng tôi đã không thử lên men theo mẻ ở quy mô thí điểm; tuy nhiên, hiệu giá và năng suất của chúng tôi đối với quá trình lên men theo đợt trong lò phản ứng sinh học quy mô thí điểm tương đương với hiệu suất và năng suất trong lò phản ứng sinh học quy mô băng ghế dự bị. Vì vậy, chúng tôi đã dự đoán hiệu suất tương tự của chủng này trong quá trình lên men theo mẻ cho ăn ở quy mô thí điểm.

Chúng tôi tiếp tục hoàn thiện toàn bộ quy trình sản xuất SA bằng cách chế tạo DSP để thu hồi SA từ dịch lên men nước mía bằng phương pháp chưng cất và kết tinh chân không hai giai đoạn. Nếu không axit hóa thêm môi trường lên men chứa 63.1 g/L SA thu được từ quá trình lên men ở quy mô thí điểm, hiệu suất tối đa là 31.0% trong giai đoạn đầu tiên. Dịch lọc từ giai đoạn 1 sau đó được cô đặc đến 50% thể tích bằng cách chưng cất chân không và trải qua giai đoạn kết tinh thứ hai. Hiệu suất SA từ giai đoạn 2 là 47.7% và thu được lượng tinh thể SA tương tự cho cả hai giai đoạn (1.98 g cho giai đoạn 1 và 2.10 g cho giai đoạn 2). Do đó, thông qua quá trình chưng cất và kết tinh chân không hai giai đoạn, thu được hiệu suất thu hồi SA tổng thể là 64.0% từ môi trường lên men có độ pH thấp. Hơn nữa, độ tinh khiết của tinh thể SA được thu hồi ở giai đoạn 1 và giai đoạn 2 được ước tính lần lượt là 88.9% và 86.23%. Kết quả thu được phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đây³⁰. Từ kết quả, rõ ràng là quá trình kết tinh SA ở độ tinh khiết cao (>85%) từ môi trường lên men chưa qua xử lý đã thành công. Tuy nhiên, cần nghiên cứu thêm để loại bỏ tạp chất tạo màu để thu hồi tinh thể SA đạt cấp thương mại.

Phân tích kinh tế - công nghệ và đánh giá vòng đời

Chúng tôi đã thiết kế và mô phỏng các nhà máy tinh chế sinh học từ đầu đến cuối có khả năng chấp nhận mía làm nguyên liệu thô, đường hóa nó thành nước mía (sucrose, glucose và fructose), lên men đường thành SA bằng cách sử dụng I. phương Đôngvà tách dịch lên men để thu hồi tinh thể SA khô (Hình bổ sung. 13) với công suất sản xuất hàng năm là 26,800 tấn SA (nhu cầu SA toàn cầu năm 2013 là khoảng 76,000 tấn SA³¹). Các nhà máy tinh chế sinh học được mô phỏng theo các kịch bản lên men thay thế với các giả định về năng suất, hiệu giá và năng suất tương ứng với hiệu suất lên men đạt được ở chế độ mẻ quy mô phòng thí nghiệm (kịch bản mẻ trong phòng thí nghiệm) và chế độ tiếp liệu (kịch bản mẻ trong phòng thí nghiệm) cũng như thí nghiệm thiết lập chế độ lô quy mô thí điểm (kịch bản lô thí điểm). Để mô tả khả năng tồn tại về mặt tài chính và lợi ích môi trường của các lộ trình SA đã phát triển, chúng tôi đã thực hiện TEA và LCA cho từng kịch bản theo các giả định cơ bản cũng như trong điều kiện không chắc chắn (2000 mô phỏng Monte Carlo cho từng kịch bản với lấy mẫu siêu khối Latinh; phân phối kết quả ở các số thay thế mô phỏng Monte Carlo được báo cáo trong Bảng bổ sung 1 và các giá trị cơ sở giả định và phân phối của tất cả các tham số không chắc chắn cho từng kịch bản được báo cáo trong Dữ liệu bổ sung 1). Chúng tôi đã sử dụng giá bán sản phẩm tối thiểu (MPSP, năm 2016$ với tỷ lệ hoàn vốn nội bộ là 10%), tiềm năng nóng lên toàn cầu trong 100 năm (GWP₁₀₀; từ đầu đến cuối) và mức tiêu thụ năng lượng hóa thạch (FEC; từ đầu đến cuối) làm số liệu thể hiện kết quả TEA và LCA. Chúng tôi cũng thực hiện phân tích độ nhạy bằng cách sử dụng hệ số tương quan thứ tự xếp hạng của Spearman (Spearman's ρ) để xác định các động lực chính gây ra chi phí sản xuất và tác động môi trường. Cuối cùng, để đặt ra và ưu tiên các mục tiêu nhằm cải thiện hơn nữa khả năng tồn tại về mặt tài chính và tính bền vững của môi trường, chúng tôi đã thiết kế và mô phỏng các nhà máy tinh chế sinh học trong bối cảnh hiệu suất lên men tiềm năng (tức là, 2500 tổ hợp hiệu suất-hiệu suất, mỗi tổ hợp trên một loạt năng suất cho cả quá trình lên men trung tính và độ pH thấp). ).

Dựa trên hiệu suất thử nghiệm trong kịch bản lô trong phòng thí nghiệm, nhà máy tinh chế sinh học có thể sản xuất SA ở mức MPSP ước tính là 1.70 USD/kg (đường cơ sở; Hình XNUMX). 4A) với phạm vi từ 1.51–1.92 USD/kg (phân vị thứ 5–95; sau đây trong ngoặc đơn). GWP của nhà máy lọc sinh học₁₀₀ và FEC theo kịch bản này ước tính là 1.95 kg CO₂-eq./kg (1.37–2.65 kg CO₂-eq./kg) và -3.74 MJ/kg (-12.9–5.39 MJ/kg), tương ứng (Hình XNUMX). 4B và Hình bổ sung. 14A). Trong kịch bản cho ăn theo mẻ trong phòng thí nghiệm (với hiệu giá SA lên men, năng suất và năng suất được cải thiện so với kịch bản theo mẻ trong phòng thí nghiệm), MPSP của nhà máy lọc sinh học là 1.06 USD/kg (0.96–1.22 USD/kg), GWP₁₀₀ là 0.93 kg CO₂-eq./kg (0.71–1.32 kg CO₂-eq./kg) và FEC là −5.36 MJ/kg (−8.97–0.213 MJ/kg). Trong kịch bản lô thí điểm (với hiệu suất và hiệu giá SA lên men được cải thiện so với kịch bản lô trong phòng thí nghiệm nhưng thấp hơn so với kịch bản lô cấp liệu trong phòng thí nghiệm và năng suất thấp hơn cả hai kịch bản trong phòng thí nghiệm), nhà máy tinh chế sinh học có MPSP ước tính là 1.37 USD/kg ($1.23–1.54/kg), GWP₁₀₀ của 1.67 kg CO₂-eq./kg (1.22–2.17 kg CO₂-eq./kg) và FEC là −0.21 MJ/kg (−7.08 đến 6.47 MJ/kg). Một sơ đồ Sankey mô tả dòng carbon qua nhà máy lọc sinh học cho kịch bản này cũng được trình bày trong Hình bổ sung. 15.

Sự không chắc chắn (biểu đồ hình hộp và đường ria) và sự phân tích (biểu đồ thanh xếp chồng) cho (A) giá bán sản phẩm tối thiểu (MPSP) và (B) tiềm năng nóng lên toàn cầu trong 100 năm từ đầu đến cuối (GWP₁₀₀). Các râu, hình hộp và đường ở giữa đại diện cho các phần trăm thứ 5/95, 25/75 và 50 từ mô phỏng Monte Carlo năm 2000 (n = 2000 mô phỏng) cho mỗi kịch bản. Các điểm đánh dấu hình ngũ giác, hình vuông và hình thoi lần lượt thể hiện các kết quả cơ bản cho các kịch bản lô phòng thí nghiệm (Lab. batch) trong phòng thí nghiệm (Lab. fed-batch) và lô thí điểm (Lô thí điểm). Biểu đồ thanh xếp chồng báo cáo kết quả cơ bản cho kịch bản lô thí điểm; kết quả cho các kịch bản khác được đưa vào SI. Tiêu thụ điện chỉ bao gồm mức tiêu thụ của hệ thống; sản xuất đã được loại trừ trong bảng phân tích được mô tả để làm rõ số liệu. Dữ liệu phân tích được lập bảng về chi phí vật liệu và thiết bị lắp đặt, nhiệm vụ sưởi ấm và làm mát, sử dụng điện, GWP₁₀₀và FEC có sẵn trực tuyến⁶². Các đường màu xám đậm được dán nhãn biểu thị các tác động được báo cáo đối với con đường sản xuất dựa trên hóa thạch (f1⁵²; f2-f4⁵¹). Các đường màu xám nhạt được dán nhãn biểu thị tác động được báo cáo đối với các phương pháp sản xuất dựa trên sinh học thay thế (b1⁵¹; b2⁵³; b3⁵²). GWP ở đâu₁₀₀ đã được báo cáo là từ lúc nôi đến cổng, 1.49 kg CO2-eq./kg đã được thêm vào dưới dạng tác động cuối đời để thống nhất với nghiên cứu này và Dunn et al. 2015. Giá trị của tất cả MPSP được báo cáo và tác động trước và sau khi điều chỉnh được liệt kê trong Bảng bổ sung 3 và 4. (C, D) MPSP và (E, F) GWP₁₀₀ trên 2500 tổ hợp năng suất lên men-hiệu giá ở năng suất cơ bản của kịch bản mẻ thí điểm (0.66 g/L/h) đối với chất trung tính (bảng bên trái; C, E) và độ pH thấp (bảng bên phải; D, F) lên men. Hiệu suất được biểu thị bằng % của mức tối đa theo lý thuyết (% theo lý thuyết) được chia tỷ lệ theo hiệu suất tối đa theo lý thuyết là 1.31 g/g-glucose tương đương (dựa trên cân bằng carbon). Đối với một điểm nhất định trên hình, xGiá trị -axis biểu thị năng suất, giá trị trục y biểu thị hiệu giá và các đường màu và đường viền biểu thị giá trị của MPSP, GWP₁₀₀. Điểm đánh dấu kim cương hiển thị kết quả cơ bản cho kịch bản lô thí điểm. Dữ liệu nguồn được cung cấp dưới dạng tệp Dữ liệu nguồn.

Hình ảnh kích thước đầy đủ

Trên 28 thông số mà độ không đảm bảo được quy cho kịch bản lô thí điểm, chúng tôi thấy MPSP nhạy cảm nhất với năng suất SA lên men (Spearman's là −0.60; tất cả các phân bố độ không đảm bảo được liệt kê trong Dữ liệu bổ sung 1 và giá trị ρ của Spearman cho tất cả các tham số được báo cáo trong Bảng bổ sung 2). MPSP cũng nhạy cảm đáng kể với đơn giá mía thức ăn (Spearman's ρ là 0.39), thời gian hoạt động của nhà máy (-0.38), công suất mía thức ăn của nhà máy (-0.31) và hiệu giá SA lên men (-0.30). GWP₁₀₀ nhạy cảm nhất với hiệu suất lò hơi (Spearman's ρ là −0.63). GWP₁₀₀ cũng nhạy cảm đáng kể với hiệu giá và năng suất SA lên men, với giá trị ρ của Spearman lần lượt là −0.62 và 0.32. FEC nhạy cảm nhất với năng suất SA lên men (Spearman's ρ là 0.63), và cũng nhạy cảm nhất với hiệu suất nồi hơi (−0.56) và hiệu giá SA lên men (−0.49). Để mô tả rõ hơn ý nghĩa của hiệu suất lên men, chúng tôi đã thực hiện TEA và LCA trên toàn cảnh hiệu suất lên men (Hình XNUMX). 4CNET F và Hình bổ sung. 14B,C), mô phỏng 2500 tổ hợp năng suất-hiệu giá trên một loạt các năng suất cho từng chế độ trong số hai chế độ thay thế: lên men ở độ pH thấp (nghĩa là lên men ở độ pH bằng 3 được kiểm soát bằng cách bổ sung bazơ trong quá trình lên men và không cần axit hóa sau khi lên men) và lên men trung tính (tức là trung hòa hoàn toàn SA bằng cách bổ sung bazơ trong quá trình lên men và tái axit hóa hoàn toàn sau khi lên men). Kết quả cho một kịch bản pH thấp thay thế cần phải axit hóa lại sau khi lên men được thể hiện trong Hình bổ sung XNUMX. 16.

• Phân phối nội dung và PR được hỗ trợ bởi SEO. Được khuếch đại ngay hôm nay.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. Trao quyền cho chính mình. Truy cập Tại đây.
• PlatoAiStream. Thông minh Web3. Kiến thức khuếch đại. Truy cập Tại đây.
• Trung tâmESG. Than đá, công nghệ sạch, Năng lượng, Môi trường Hệ mặt trời, Quản lý chất thải. Truy cập Tại đây.
• PlatoSức khỏe. Tình báo thử nghiệm lâm sàng và công nghệ sinh học. Truy cập Tại đây.
• nguồn: https://www.nature.com/articles/s41467-023-41616-9