細胞培養

褐色脂肪細胞は、前述のように、B. Spiegelman (ハーバード大学) のご厚意により提供された不死化褐色前駆脂肪細胞マウス細胞株から分化しました。¹⁹。 前脂肪細胞は、50% ウシ胎児血清 (Sigma-Aldrich)、20 mM HEPES (Sigma-Aldrich) を添加した増殖培地 (ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース (Gibco)) 中で低コンフルエンス (<20%) で維持および増殖させました。 100Uml^-1 ペニシリン – ストレプトマイシン (Gibco))。 分化のために、前脂肪細胞をリン酸緩衝溶液（PBS）（Gibco、pH 7.4、1×）で23,000回洗浄し、TrypLE Expressで解離させ、約XNUMX細胞cm の密度で播種しました。^-2 成長培地中で。 ２４時間後に培地を分化培地（ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース、１０％ウシ胎児血清、２０ｎＭインスリン、１ｎＭトリヨードチロニンおよび１００Ｕｍｌを補充したもの）に交換した。^-1 ペニシリン - ストレプトマイシン) を加え、細胞を 2 日間培養しました。 次いで、誘導培地（０．１２５ｍＭインドメタシン、０．５μＭデキサメタゾンおよび０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチンを補充した分化培地）を２日間添加することによって細胞分化を誘導し、その後、培地をさらに２日間分化培地に交換した。 分化した脂肪細胞を飢餓培地(ダルベッコ改変イーグル培地、低グルコース(Gibco)、最終濃度0.125mMまでグルコースを補充、0.5%ウシ血清アルブミン(Sigma-Aldrich)および0.5Uml)で2回洗浄した。^-1 ペニシリン - ストレプトマイシン) を使用し、インスリン NanoRods または飢餓培地で本文に示されている時間希釈した NanoRods で処理する前に、飢餓培地で 2 時間インキュベートしました。 処理後、細胞を PBS で 18 回洗浄し、イムノブロット用のタンパク質または遺伝子発現用の RNA を単離するために収集しました。 DNA-PAINT による IR 分析の場合、前駆脂肪細胞は上記のように次の変更を加えて分化されました。 誘導培地で処理した後、細胞を TrypLE Express で解離し、μ-Slide 2 Well Glass Bottom ウェル (ibidi) の分化培地に播種しました。 2日後、細胞を飢餓培地とともに10時間インキュベートし、続いて飢餓培地中の10nMインスリンでXNUMX分間処理した。 対照実験では、インスリンの添加を省略した。 治療前に、分化した脂肪細胞を視覚的に分析して細胞表面密度を評価し、細胞の分化を評価した後、治療グループと対照グループにランダムに割り当てました。

細胞は、5% CO を含む加湿雰囲気中で維持、増殖、分化しました。₂ 37℃で。

IRのDNA-PAINT

分化した脂肪細胞を、あらかじめ温めた12%パラホルムアルデヒド/PBSを用いて室温(RT)で4分間固定し、PBSで90回洗浄し、ブロッキング溶液(3.0%ウシ胎児血清/0.1%トリトンX)を用いて室温で100分間ブロックした。 −１００（ＰＢＳ中））を用いてウサギ抗ＩＲβ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（４Ｂ８）；ブロッキング溶液で１：３００希釈）とともに４℃で２日間インキュベートした。 次に細胞をPBSで4回洗浄し、ブロッキングバッファー(Massive Photonics)で8:1に希釈したナノボディFluoTag-XM-QC抗ウサギIgG(Massive Photonics)とともに室温で300時間インキュベートした。 PBSで2回洗浄した後、細胞を4 nmの金ナノ粒子(Sigma-Aldrich、ブロッキング緩衝液で1:200希釈)とともに1分間インキュベートした。 細胞をＰＢＳで１回洗浄し、画像バッファー（Ｍａｓｓｉｖｅ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）で希釈した５ｎＭ Ｃｙ３ｂ標識鎖（Ｍａｓｓｉｖｅ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）とともにインキュベートした。

イメージングは​​、油浸式 iLAS2 円形全反射蛍光モジュール (Gataca Systems) を使用した対物レンズ型全反射蛍光構成を適用した、Perfect Focus システム (Nikon Instruments) を備えた Nikon ECLIPSE Ti-E 顕微鏡で実行されました。開口数1.49のCFI Plan Apo全反射蛍光×100対物レンズ(Nikon Instruments)、最終ピクセルサイズ1.5 nmに対応する×87の補助Optovar倍率を装備。 使用したレーザーは、縮小フィールド超解像度イメージング用に最適化されたカスタム iLas 入力ビーム拡張光学系 (Cairn) を備えた OBIS 561 nm LS 150 mW (Coherent) でした。 蛍光ビームはまず、励起クワッドバンド フィルター、クワッドバンド ダイクロイック フィルター、クワッドバンド発光フィルター (ZET89901/405/488/561x、ZET640/405/488/561bs および ZET640) を含むフィルター キューブ (405、Chroma Technology) を通過しました。 /488/561/640m、クロマテクノロジー）。 次に、蛍光光を発光フィルター (ET595/50m、Chroma Technology) でスペクトル的にフィルター処理し、iXon Ultra 888 電子増倍電荷結合素子カメラ (Andor) で画像化しました。 Micro-Manager ソフトウェア v. 1.4 を使用して、12,000 MHz 読み出しフレーム、10 ms 露光、電子増倍ゲインなしで 130 フレームを取得しました。 XNUMX つの独立した実験から得られた合計 XNUMX 個の細胞が各条件で画像化されました (補足 および補足図 1).

INS-DNAの生成と精製

インスリン (Merck、1 mg ml^-1) をジベンゾシクロオクチン-スルホ-と反応させたN-ヒドロキシスクシンイミジル エステル (DBCO-スルホ-NHS、クリック ケミストリー ツール; 690 μM) (100 mM Na 溶液)₂CO₃ バッファー (pH 11.5) で室温で 20 分間静置します。 次いで、トリス塩基（Sigma-Aldrich、5 mM）を添加することにより、反応を100分間クエンチした。 溶液を400μlの100mM NaでXNUMX回洗浄した。₂CO₃ 0.5 kDa カットオフ膜を備えた Amicon Ultra 3 ml 遠心フィルターユニット (Merck) を使用。 各洗浄ステップで、カラムを 10 倍で 14,000 分間回転させました。g。 最後の洗浄ステップの後、インスリン-DBCO (690 μM) をアジド修飾 DNA (バイオマー、35 μM; 補足表) と混合しました。 3) 100 mM Na中₂CO₃ 室温で３時間反応させた。 NaNを添加することにより反応を停止させた₃ (Sigma-Aldrich、6.9 mM)。 サンプルは、INS- DNA形成。 イメージングは​​、ImageQuant LAS 6 ゲル イメージャーを使用して実行されました。 インスリン-DBCO-スルホ-NHS 結合プロトコルは、B 鎖のリジン 19 (B1 リジン) への ssDNA オリゴの結合を、アミン基のアミン基と比較して促進するように最適化されました。 N インスリンA鎖とB鎖の末端。 B29 アミンの pKa 値は、XNUMX つのアミンの pKa 値よりも高くなります。 N termini (11.2 対 8.6 および 6.8)。 高い pH では、架橋剤の NHS 基が最も塩基性のアミン基である B29 リジン アミンと優先的に反応すると予測されます。³²。 したがって、pH 反応条件は、単一の INS-DNA 産物を促進するように最適化されました。

INS-DNA 反応混合物を逆相高速液体クロマトグラフィー C で精製しました。₁₈ カラム (Agilent Poroshell 120 EC-C₁₈）Amersham Pharmacia Biotech ÄKTA Ettan LC で。 緩衝液 A (50 mM 酢酸トリエチルアミン) および緩衝液 B (90% アセトニトリルおよび 10% 緩衝液 A) を勾配プロファイルで使用し、緩衝液 B のパーセントを 30 分間で 50% から 20% に増加させました。 画分を収集し、真空濃縮器 (Thermo Scientific SpeedVac Savant DNA 120) で高熱で 30 分間遠心して、高速液体クロマトグラフィー緩衝液の揮発性成分を除去しました。 選択したピークを、0.5 kDa カットオフ膜（Merck）を備えた Amicon Ultra 3 ml 遠心フィルターユニットを使用し、10 倍で 14,000 分間 XNUMX 回遠心することにより PBS に緩衝液交換しました。g 毎回 400 µl の PBS で洗浄します。 精製された画分のサンプルをネイティブポリアクリルアミドゲル上で泳動し、SYBR Gold (Thermo Fisher) で染色して、精製された INS-DNA を視覚化しました。 コンジュゲートの最終純度は、次の 4 つの方法で調製ごとに分析されました。ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (Invitrogen、12 ～ 4% ボルトゲル) 上の銀染色バンド強度 (Pierce Silver Stain Kit) とインスリン標準 (Merck) の比較。 DNA標準（Integrated DNA Technologies）およびQubit ssDNAアッセイキット（Qubit 20 Fluorimeter、Invitrogen）に対するネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるSYBR Goldバンド強度の比較。 INS-DNA の最終濃度は、Qubit ssDNA 測定に基づいて計算されました。 精製した INS-DNA は凍結し、さらに使用するまで -XNUMX °C で保存しました。

NanoRods およびインスリン NanoRods の製造

折り紙構造は、足場プラスミド DNA (p7560、Tilibit、10 nM) と適切なステープル鎖 (Integrated DNA Technologies、100 nM) を混合することによって調製されました (補足表) 4–9) フォールディングバッファー (pH 5.0 の 8.5 mM Tris (Sigma-Aldrich)、1.0 mM EDTA (Panreac AppliChem) および 12.5 mM MgCl₂ (シグマ-アルドリッチ))。 次に混合物をサーモサイクラー (MJ Research PTC-225 グラディエント サーマル サイクラー) に置き、80.0 °C まで 5 分間加熱し、60.0 °C/分で 1.0 分間かけて 20 °C まで冷却し、その後 20.0 °C までゆっくり冷却することによってアニーリングしました。 0.5 °C/分で °C。 過剰なステープルは、0.5 kDa カットオフ膜 (Merck) を備えた Amicon Ultra 100 ml 遠心フィルターユニットを使用し、2 倍で 14,000 分間、XNUMX 回回転することにより除去されました。g 毎回400μlのフォールディングバッファーで洗浄します。 精製された構造の濃度は、260 nm で DNA 吸光度を測定することによって決定されました (Thermo Scientific NanoDrop 2000)。 次に、精製した INS-DNA を、NanoRod 構造上の利用可能な拡張鎖結合部位に 3 倍の化学量論的過剰量で添加し、サーモサイクラー内で 37.0 °C まで 1 時間加熱し、22.0 分あたり 0.1 °C で 22.0 °C まで冷却することでアニーリングしました。 14 °C で 4.0 時間インキュベートし、0.1 分あたり 0.5 °C の速度で 100 °C まで冷却します。 結合していないINS-DNAを、2 kDaカットオフ膜(Merck)を備えたAmicon Ultra 14,000 ml遠心フィルターユニットを使用し、XNUMX×でXNUMX分間XNUMX回回転させて除去した。g 毎回 400 μl の PBS + 10 mM MgCl で洗浄₂。 インスリン ナノロッドは、さらに使用するまで 4 °C で保管しました。

アガロースゲル電気泳動

NanoRod 構造は、氷上のアガロースゲル上でサンプルを 4 V で 70 時間実行することによって分析されました。ゲルは、2 × TBE 緩衝液 (Panreac AppliChem) に溶解した 0.5% アガロース (Thermo Scientific TopVision Agarose) と 10 mM MgCl で構成されました。₂ (Sigma-Aldrich) および 1× SYBR Safe DNA 染色 (Invitrogen)。 イメージングは​​、ImageQuant LAS 4000 ゲル イメージャーを使用して実行されました。

動的光散乱

NanoRod およびインスリン NanoRod サンプルは、PBS + 10 mM MgCl で調製されました。₂、０．１μｍ膜（Ｍｅｒｃｋ）を使用してシリンジろ過し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で分析した。 0.1 つの測定値は、低容量セル (ZSU25) 内で 1002 °C で取得され、平均されました。

NanoRod の oxDNA シミュレーション

NR、NR-1、NR-2、NR-4、NR-7、NR-15 の構造は、oxDNA 粗視化モデリングを使用して解析されました (https://oxdna.org/）。 インスリン取り込み部位から伸びる dsDNA 鎖を含む NanoRod 構造は、vHelix を使用して作成され、tacoxDNA Web サイト (http://tacoxdna.sissa.it/）。 構造物は、 oxDNA.org 37 °C でのシミュレーション用 Web サーバー、塩分濃度を 1、1 × 10⁸ 広告付きのタイムステップt 値 0.0001、およびデフォルトのパラメーターを使用した予備緩和ステップ。 シミュレーションは視覚化され、oxView ツール (https://oxdna.org/).

ネガティブ染色TEM

精製した NanoRods (10 nM) をグロー放電カーボンサポート銅 TEM グリッド (TEM-CF200CU50、Thermo Fisher Scientific) 上に分注し、溶液を除去する前に 60 秒間インキュベートしました。 次に、グリッドを 10% w/v ギ酸ウラニル 5 μl で 2 秒間染色し、その後除去しました。 染色手順を 30 回繰り返し、イメージングの前に TEM グリッドを 120 分間風乾しました。 イメージングは​​、Talos 2C G120 (92,000 kV、Ceta-D 検出器) を使用して、近視野視野で×1.53 で実行されました。 Raw 画像は ImageJ ソフトウェア (vXNUMX) を使用して処理されました。

AFM

NanoRod 構造は、エポキシ接着剤で顕微鏡スライドの中心に固定され、Reprorubber を使用してスライドに取り付けられたプラスチック リングで囲まれた雲母のディスク上に画像化されました。 ナノ構造をTE-Mg緩衝液（1 mM Tris塩基、5 mM EDTA、1 mM MgCl）で10 nMに希釈しました。₂、ｐＨ８．０）、１０μｌを新たに切断した雲母上にピペットで移した。 8.0 秒後、10 mM NiSO 30 μl₄ を添加し、さらに4.5分間インキュベートした。 次いで、表面を１．０ｍｌの０．１μｍろ過したＴＥ－Ｍｇ緩衝液ですすぎ、その後、１．５ｍｌのろ過したＴＥ－Ｍｇ緩衝液をイメージングのために雲母ディスクに添加した。 画像化は、ＡＣモードのＢｒｕｋｅｒ ＡＣ４０カンチレバーを備えたＪＰＫ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＮａｎｏＷｉｚａｒｄ ３ Ｕｌｔｒａ原子間力顕微鏡を使用して液体中で行われた。

インスリン NanoRod ナノ構造の DNA-PAINT

μ-Slide 18 Well Glass Bottom ウェル (ibidi) をイソプロパノールで洗浄し、N で乾燥しました。₂。 ウェルを1 mg ml でインキュベートしました。^-1 ビオチンウシ血清アルブミン (Thermo Fisher) を緩衝液 A (10 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、および 0.05% (v/v) Tween 20、pH 8.0) に溶解し、室温で 5 分間、緩衝液 A で 0.5 回洗浄し、 XNUMXmg ml^-1 ニュートラアビジン (Thermo Fisher) をバッファー A に溶解し、室温で 5 分間反応させます。 次いでウェルを緩衝液Aで5回洗浄し、続いて緩衝液B(10 mM Tris-HCl、XNUMX mM MgCl)でXNUMX回洗浄した。₂、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）。 次に、1 つのビオチン標識 DNA 鎖を組み込んだ 0.05 pM NanoRods (拡張データ図 2a）、9ヌクレオチドのPAINTドッキング配列を含むINS-DNA（DS1;補足表） 3）を各ウェルに５分間添加した。 ウェルをバッファー B で 5 回洗浄しました。次に、1 nM の Atto-647N イメージャー鎖 (IS1; 補足表) 10）脱酸素剤（プロトカテキュ酸（Ｓｉｇｍａ）、プロトカテク酸３，４－ジオキシゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）およびＴｒｏｌｏｘ（Ｓｉｇｍａ））を添加した緩衝液Ｂ中の溶液を各ウェルに添加した。 デュアル交換 PAINT の場合、3,4 つのドッキング シーケンス (DS2; 補足テーブル) 10) を NanoRods の両端に追加しました。 サンプルは前述のように調製し、各イメージング取得の間にウェルを緩衝液 B で 647 回洗浄しました。 各イメージング取得は、異なる Atto-1N イメージャ ストランド (IS2 および ISXNUMX; 補足表) を使用して行われました。 10）。 Micro-Manager ソフトウェアを使用して、9,000 MHz 読み出しフレーム、10 ms 露光、電子増倍ゲインなしで 200 フレームを取得しました (補足 および補足図 2 & 3).

SPR

Biacore T200 機器 (Cytiva) を使用して SPR 実験を実行し、データは Biacore T200 システム制御ソフトウェア v. 2.01 を使用して取得されました。 ビオチン化 ECD-IR (Nordic BioSite) をストレプトアビジン センサー チップ SA (Cytiva) 上に固定化しました。 HBS-P+ バッファー (Cytiva) をランニングバッファーとして使用しました。 ECD-IR の固定化後、安定したベースラインに達するために 15 分間の安定化時間を導入しました。 NR-1、NR-2、NR-4、NR-7、NR-15、NR-8、および NR-8dsDNA を、ランニングバッファー中の 11.4 nM 濃度のインスリンで注入しました。 インスリンと INS-DNA を、分析可能な結合曲線を得る最小濃度である 55 nM で注入しました。 NR を陰性対照として、インスリン NanoRod 注射内で使用される NanoRod の最高濃度と等しい濃度で注射しました (NR-1 = 11.4 nM)。 あるいは、NR-2、NR-4、NR-7、および NR-15 を 5.7 nM 濃度のナノ構造で注入しました (拡張データ図 XNUMX)。 4e）、NR-7^K-PEG 50 nM 濃度のインスリンも注射されました (拡張データ図 XNUMX)。 9c）。 各サンプルの注入は、180 秒の結合フェーズと 300 秒の解離フェーズを使用して実行されました。 解離平衡定数 (K_D)、結合速度定数 (k_on) および解離速度定数 (k_オフ）は、BIAevaluation 3.0 ソフトウェアを使用して決定されました。 の t_1/2 滞留時間を定義する値は、式 ln2/ を使用して決定されました。k_オフ。 IR と IGF7R の間の NR-1 構造の結合を比較するために、製造業者の指示に従って、ECD-IR タンパク質と ECD-IGF1R タンパク質 (Nordic BioSite) をアミンカップリング反応を介して CM5 センサーチップの 6.2 つの異なるフローセルに固定しました。 インスリンと INS-DNA の結合は、ランニングバッファー (HBS-P+) 中の異なる濃度のインスリン (18.5、55.6、166.7、500.0、および 140 nM) をシングルサイクル速度論モードで注入することによってテストされました。 300 秒と 7 秒の解離フェーズ。 NR-11.4 の結合は、180 秒の結合段階と 300 秒の解離段階を使用して、単一濃度の構造 (XNUMX nM のインスリン) を注入することによってテストされました。

クマシージェル

ここでは、0.5 μg の組換え ECD-IR (Nordic BioSite) を Laemmli サンプルバッファー (Bio-Rad) に再懸濁しました。 還元条件では、2-メルカプトエタノールを最終濃度 2.5% で添加しました。 サンプルを 80 °C で 10 分間変性し、ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、GelCode Blue 安全タンパク質染色 (Thermo Fisher Scientific) で染色しました。

ゲルシフトアッセイ

7 nMのNanoRods (NRおよびNR-20)を、300 nMのヒトIRの組換え細胞外ドメイン(Nordic BioSite)またはPBSとともに30℃で4分間インキュベートしました。 次に、サンプルを 2% アガロースゲルで泳動し、SYBR Safe で染色しました。

イムノブロッティング

細胞をＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した放射免疫沈降アッセイ緩​​衝液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で溶解し、振盪しながら氷上で３０分間インキュベートした。 ライセートを遠心分離 (30×) によって除去しました。g 20℃で4分間）、ブラッドフォードタンパク質アッセイ（Bio-Rad）を使用してタンパク質溶解物を定量しました。 タンパク質溶解物を、2.5% の 2-メルカプトエタノールを含む Laemmli サンプルバッファー (Bio-Rad) に再懸濁し、80 °C で 10 分間変性し、ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ポリフッ化ビニリデン膜に転写しました。 膜をブロッキング溶液（1% Tween 0.1 (TBST) および 20% 脱脂粉乳を含むトリス緩衝生理食塩水) 中で 5.0 時間インキュベートし、続いてホスホ IR ベータ/IGF4R に対する一次抗体とともに 1 °C で一晩インキュベートしました。ベータ (CST 3024、1:1,000)、ホスホ AKT-S473 (CST 4058、1:1,000)、または GAPDH (Invitrogen PA1-987、1:5,000)。 TBSTで31460回洗浄した後、メンブレンをホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体(Invitrogen、1、5,000:1)とともに室温でXNUMX時間インキュベートした。 西洋わさびペルオキシダーゼの検出は、ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad) 上の化学発光基質 Immobileon Forte によって実行されました。 バンド密度測定は、ImageJ ソフトウェアを使用して実行されました。

フローサイトメトリー

分化した血清欠乏脂肪細胞を上記のように調製した。 続いて、脂肪細胞をハンクス平衡塩類溶液 (HBSS) で 1.5 回洗浄し、コラゲナーゼ D 溶液 (XNUMX U ml) で解離させました。^-1 コラゲナーゼ D (Roche) および 10 mM CaCl₂ HBSS 中で) 20 °C で 37 分間。 細胞をHBSSに再懸濁し、35 μm HBSS平衡セルストレーナー(BD Biosciences)で濾過し、300倍でペレット化しました。g ５分間静置し、染色緩衝液（１×ＰＢＳおよび１％ウシ血清アルブミン）に再懸濁した。 メーカーの指示に従って、死細胞を LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific) で標識し、その後、細胞懸濁液を 5 倍でペレット化しました。g 5分間静置し、染色バッファーに再懸濁しました。 ここでは、約 100,000 個の細胞を、最終容量 10 μl の 647 nM ATTO-100 標識 NanoRod 構造とともに 10 °C で 37 分間インキュベートしました。 NanoRod構造なしでインキュベートした細胞を未処理の対照として使用しました。 次いで、細胞を染色緩衝液で３００×遠心分離により２回洗浄した。g 5分間フローサイトメトリー測定は、BD FACSDIVA ソフトウェア v. 9.0 (BD Biosciences) を備えた BD FACSCANTO II で実行されました。 生きた脂肪細胞は、最初に FSC-A 対 AmCyan-A で細胞をゲーティングし、続いて FSC-A 対 FSC-H でゲーティングしてシングレットを検出することによって同定されました。 取得したデータは、FlowJo 10.7.1 ソフトウェア (BD Biosciences) を使用して分析しました。 未処理の対照に対して正規化した後の蛍光強度の幾何平均を使用して、NanoRods による細胞標識の程度を定義しました。

RNA-seq ライブラリーの調製とシーケンス

Quick-RNA Microprep Plus Kit (Zymo Research) を使用して分化した脂肪細胞から全 RNA を単離し、メーカーの低サンプル プロトコールに従って TruSeq RNA Library Prep Kit v500 を使用して mRNA-seq ライブラリーの調製に 2 ng の精製 RNA を使用しました。 ライブラリーの定量は、Varioskan LUX マルチモードマイクロプレートリーダー (Thermo Fisher) 上の製造業者のマルチウェルプレートプロトコルに従って QuantiFluor dsDNA システム (Promega) を使用して実行されました。 ライブラリーのサイズと品質は、Bioanalyser 2100 および High Sensitivity DNA Kit (Agilent) を使用して評価されました。 NextSeq 標準正規化プロトコル (Illumina) を使用してライブラリを変性および希釈し、NextSeq 1 プラットフォーム上の NextSeq 75/500 High Output Kit v. 550 (2.5 サイクル) を使用してシングルエンドリード (75 × 550 bp) を使用してシーケンスを実行しました (イルミナ）。

RNA-seq 定量化、DEG 解析および GSEA

シーケンシングリードは、以下の参照トランスクリプトームに対してマッピングされました。 筋を行く タンパク質をコードする転写配列（リリース M29、GRCm39; https://www.gencodegenes.org/mouse/)、Salmon 1.7.0 を使用して定量化しました (ref. ³³）。 カウント テーブルは tximport パッケージを使用して生成されました³⁴ DEG のリストは DESeq2 パッケージ (v. 1.34.0) を使用して取得されました。³⁵、調整された遺伝子のみ P 0.001 以下の値と対数₂±0.58 での倍率変化カットオフをさらなる分析のために考慮しました。 ヒート マップと UpSet プロットは ComplexHeatmap (v. 2.10.0) を使用して生成されました。³⁶。 遺伝子オントロジー用語と KEGG 経路の両方を使用した生物学的プロセスの GSEA は、clusterProfiler (v. 4.2.2) への入力として遺伝子のランク付けされたリストを使用して実行されました。³⁷ 誤検出率調整後の重要性 P 値はそれぞれ 0.10 と 0.05 未満です。

ゼブラフィッシュのマイクロインジェクションと遊離グルコースの定量

NanoRod とインスリン NanoRod をオリゴリシン PEG と混合しました (K₁₀-PEG_5K、アラマンダポリマー）、K のリジンのアミン間の比率が 1:1₁₀-PEG_5K そしてDNAのリン酸塩³⁰、各ゼブラフィッシュ幼生にサンプル 30 nl をマイクロインジェクションする前に、RT で 2 分間インキュベートしました。 注射用のサンプルは、コーティングされた NanoRod サンプルの構造の最終濃度 100 nM、コーティングされたインスリン NanoRod サンプルのインスリンの最終濃度 100 nM (NR-100.0 の NanoRods の 14.3 および 1 nM に相当) で調製されました。^K-PEG そしてNR-7^K-PEG、 それぞれ）。 ゼブラフィッシュ幼生に濃度 1 nM のヒト インスリン 100 nl を注射すると、遊離グルコース レベルの低下とインスリン シグナル伝達と一致する転写変化が誘導されることが示されています。³⁸。 したがって、我々は、遊離グルコースレベルに対するインスリン媒介効果を評価するために、アッセイで2 nM濃度のインスリンを100 nl注入しました。 2 dpf のゼブラフィッシュの総血液量は 60 ～ 89 nl であるため (ref. ³⁹)、アッセイで注入されたインスリンの推定濃度は約 2 ～ 3 nM となります。 これらのアッセイでは、注入されるサンプルの量も制限されており、より高い注入レベル (3 および 4 nl) では幼虫の生存率が低下します。

ゼブラフィッシュの維持と交配 (D.レリオ) ラインは、ストックホルムの djurförsöksetiska nämnd によって承認された動物福祉規制に関するスウェーデンの法律に従って実施されました。 β細胞除去および遊離グルコースアッセイ実験には生後5日未満の動物のみが使用されたため、2010/63/EUに従って倫理的許可は必要ありませんでした。 使用されるゼブラフィッシュ トランスジェニック系統は以前に記載されています。 Tg(プラグイン:CFP–NTR)^s892 （参考文献 ²⁷）と Tg(プラグイン:楓)^s949 （参考文献 ²⁸).

β細胞の除去は生後XNUMX日目に行われました。 Tg(プラグイン:CFP–NTR）と Tg(プラグイン:CFP–NTR);Tg(プラグイン:楓）10 mM 1-フェニル-3-チオ尿素（PTU、Acros Organics）を添加した卵水溶液（E0.2）中の1％ DMSO（VWR）で希釈した2 mM MTZ（Sigma-Aldrich）で24時間処理した胚。 β細胞除去後、生後XNUMX日目 Tg(プラグイン:CFP–NTR) 幼虫 (72 hpf) を 0.01% トリカインで麻酔し、2 nl の 1× PBS、未修飾インスリン、またはコーティングされた NanoRod/インスリン NanoRods を総枢静脈 (キュビエ管) に注射しました。⁴⁰。 フェノールレッド (Sigma-Aldrich) を最終濃度 0.1% で PBS、インスリン、またはコーティングされたインスリン NanoRod サンプルに添加して、マイクロインジェクションプロセスの視覚化と注射が成功した幼虫の判定を支援しました。 ゼブラフィッシュ幼生をランダムに処理グループに割り当てました。 遊離グルコースレベルは他の場所で説明されているように測定されました⁴¹ 蛍光ベースの酵素キット (BioVision) を使用します。 条件/反復ごとに、注射された幼虫 XNUMX ～ XNUMX 匹のグループを使用しました。

共焦点イメージング

Tg(プラグイン:CFP–NTR);Tg(プラグイン:楓）アブレーション処理の24時間後にアブレーション幼虫を収集し、前述のプロトコールに従って麻酔および注射し、共焦点イメージングによってβ細胞数を分析する前に4％パラホルムアルデヒド溶液で固定した。 共焦点画像は、Leica TCS SP8 顕微鏡および LAS X ソフトウェア (v. 3.5.5.19976) を使用して取得されました。 β細胞除去された膵臓の初代膵島 Tg(プラグイン:CFP–NTR);Tg(プラグイン:楓) 幼虫は 40 倍の水浸対物レンズでスキャンされ、 z スタックは、Fiji ソフトウェア (v1.53) を使用して分析されました。 表示されたすべての画像は同じ実験から取得され、視覚化の目的でコントラスト値が調整されました。 β 細胞の定量化は、元の未変更の画像に対して実行されました。

統計分析

サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されていませんが、サンプルサイズは以前の出版物で報告されたものと同様でした^28,38,42。 細胞培養サンプルと動物は、対照群と治療群にランダムに割り当てられました。 データの収集と分析は、実験条件を無視して実行されたわけではありません。 ほとんどのグラフでは、個々のデータ ポイントがプロットされます。 サンプルサイズ （n）実験的な生物学的反復の数と使用された統計的手法は、対応する図の凡例に示されています。 データセットはガウス分布についてテストされ、その後、適切な統計テストが行​​われました。 データの統計分析とグラフ表示は、GraphPad Prism 9.4.0 で処理されました。 両側マン・ホイットニー検定を実行して、対照細胞とインスリン処理細胞間のクラスター特性を比較しました。 ウェスタンブロット定量化の場合、一元配置分散分析 (ANOVA) に続いてダネットの多重比較検定を実行しました。 β細胞の定量化のために、クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダンの多重比較検定を実行した。 遊離グルコース値の分析は、Tukey の多重比較検定を備えた一元配置分散分析を使用して実行されました。

レポートの概要

研究デザインの詳細については、 ネイチャー ポートフォリオ レポートの概要 この記事にリンクされています。

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• 情報源： https://www.nature.com/articles/s41565-023-01507-y