Xây dựng các plasmid

Toàn bộ chuỗi axit amin của từng thụ thể được xây dựng được hiển thị trong Thông tin bổ sung (Hình bổ sung. 1). Plasmid pMK-Stuffer-IPTG xương sống²⁵ được sử dụng để điều trị nhiễm retrovirus, trong đó vị trí xâm nhập ribosome bên trong (IRES; I) được sử dụng để cùng biểu hiện các gen mã hóa kháng puromycin (P), peptide T2A tự phân cắt (T) và protein huỳnh quang màu xanh lá cây tăng cường (EGFP; G). Khung đọc mở mã hóa từng chuỗi thụ thể được khuếch đại bằng PCR và chèn vào pMK-stuffer-IPTG bằng cách sử dụng Bộ nhân bản HD tổng hợp (TakaraBio). Việc nhân bản, khuếch đại và giải trình tự từng plasmid được tiến hành theo một giao thức chuẩn.

Để xây dựng thư viện họa tiết, chúng tôi đã chọn quy trình tiêu hóa/nối làm phương pháp đáng tin cậy. Các codon NNS được chỉ định trong đoạn mồi PCR để chọn ngẫu nhiên 3 gốc axit amin ở hạ lưu tyrosine của mô-đun gắn kết STAT1. Các đoạn DNA ngẫu nhiên được tạo ra bằng PCR sử dụng pMK-F1-IPTG, mã hóa thụ thể được thao tác di truyền với mô-đun gắn kết STAT1, làm khuôn mẫu, được cắt bằng EcoRI và CLAI và gắn vào pMK-F1-IPTG được tiêu hóa bằng cùng loại enzyme để tạo ra pMK-F1lib-IPTG. Tế bào điện tử MegaX DH10B T1R (ThermoFisher Scientific) đã được điện hóa bằng pMK-F1lib-IPTG (100 ng) bằng cách sử dụng Gene PulserII (Bio-Rad) được đặt ở mức 2.0 kV, 200 Ω và 25 µF. Tất cả E. coli tế bào được cấy lên đĩa LB cỡ lớn đảm bảo thu được đủ số lượng khuẩn lạc kháng kháng sinh vượt quá kích thước thư viện DNA lý thuyết (3.3×10⁴) trong số 3 đột biến ngẫu nhiên axit amin được tạo ra bởi các codon NNS thoái hóa. Các khuẩn lạc được thu hoạch để chiết xuất plasmid bằng cách sử dụng QIAGEN Plasmid Midi Kit (Qiagen).

Sự tải nạp vector vô tính

Để tải nạp tế bào Ba/F3 (Ngân hàng tế bào RIKEN # RCB0805, Ibaraki, Nhật Bản), các tế bào Plat-E đóng gói retrovirus (được cung cấp bởi Tiến sĩ T. Kitamura, Đại học Tokyo) đã được gieo vào các đĩa 6 giếng một ngày trước đó sự truyền nhiễm. Vào ngày hôm sau, 3 µg plasmid chuyển gen, 3 µL Thuốc thử PLUS (ThermoFisher Scientific) và 150 µL Opti-MEM (ThermoFisher Scientific) được trộn trong một ống, trong khi trong một ống khác là 7.5 µL Thuốc thử Lipofectamine LTX ( ThermoFisher Scientific) và 150 µL Opti-MEM được trộn lẫn. Sau đó, hỗn hợp thu được từ hai ống được trộn với nhau và thêm vào các tế bào Plat-E được nuôi cấy trước (ngày 0). Môi trường nuôi cấy được thay đổi vào ngày 1. Vào ngày thứ 2, chất nổi phía trên retrovirus được thu hoạch, lọc bằng màng PVDF 0.45 µm, thêm vào các đĩa 24 giếng được phủ Retronectin (TakaraBio) và để trong 6 giờ ở nhiệt độ phòng. Retronectin có thể đồng bộ hóa các tế bào và các hạt retrovirus, dẫn đến hiệu suất tải nạp cao và do đó rút ngắn thời gian cần thiết để thu được đủ số lượng tế bào chất chuyển đổi cho các phân tích tiếp theo. Sau khi rửa bằng PBS một lần, tế bào Ba/F3 (1.0 × 10⁵ tế bào/giếng) được gieo vào các đĩa, sau đó bổ sung 1 µg/mL puromycin vào ngày thứ 3 hoặc thứ 4 để chọn lọc các tế bào được tải nạp ổn định.

Các tế bào Ba/F3 có thể được tải nạp các hạt retrovirus có vỏ hướng sinh thái, trong khi các tế bào 32Dcl3 (Ngân hàng Tế bào RIKEN # RCB1377) thì không thể. Do đó, các tế bào 32Dcl3 đã được tải nạp các hạt retrovirus được tạo kiểu giả với vỏ VSV-G. Để tải nạp các tế bào 32Dcl3, các tế bào 293GP (được cung cấp bởi Tiến sĩ M. Otsu, Đại học Kitasato) đã được sử dụng để đóng gói retrovirus giả⁹. Quy trình chuyển gen tương tự như trong trường hợp tế bào Ba/F3, ngoại trừ 2.25 µg plasmid chuyển gen và 0.75 µg pCMV-VSV-G đã được sử dụng. Vào ngày thứ 2, chất nổi phía trên retrovirus được ly tâm ở 6000 g trong 16 giờ ở 4°C và cô đặc 100 lần với môi trường RPMI làm dung môi. Virus cô đặc được thêm vào các tế bào 32Dcl3 (1.0 × 10⁵ tế bào) với 10 µg/mL protamine sulfate, sau đó bổ sung 3 µg/mL puromycin vào ngày thứ 3 hoặc 4 để chọn lọc các tế bào được tải nạp ổn định.

Sự tải nạp vector thư viện

Trong quá trình tải nạp vectơ thư viện, quy trình tải nạp retrovirus sau đây sử dụng thuốc thử cation protamine sulfate theo kinh nghiệm mang lại hiệu suất tải nạp < 10%, điều này là mong muốn cho việc tải nạp thư viện đơn dòng vào tế bào nhận. Các quy trình tổng thể gần giống như trong trường hợp tải nạp vectơ vô tính, ngoại trừ việc nuôi cấy tế bào và thuốc thử được sử dụng đã được mở rộng quy mô. Các giá trị tăng tỷ lệ trong việc tải nạp vectơ thư viện được liệt kê như sau.

Để tải nạp tế bào Ba/F3, tế bào Plat-E được gieo hạt trên đĩa 10 cm; dung dịch plasmid là 16 µg plasmid chuyển gen, 32 µL thuốc thử P3000 (ThermoFisher Scientific) và 500 µL Opti-MEM; dung dịch lipofectamine là 21.7 µL thuốc thử Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific) và 500 µL Opti-MEM; 1.0 × 10⁷ tế bào Ba/F3 được tải nạp với sự có mặt của 10 µg/mL protamine sulfate.

Để tải nạp tế bào 32Dcl3, tế bào 293GP được gieo vào đĩa 10 cm; dung dịch plasmid là 10 µg plasmid chuyển gen, 2.5 µg pCMV-VSV-G, 12.5 µg thuốc thử PLUS và 1 mL Opti-MEM; dung dịch lipofectamine là 31 µL Thuốc thử Lipofectamine LTX và 2.4 mL Opti-MEM; 1.0 × 10⁷ của các tế bào 32Dcl3 được tải nạp với sự có mặt của 10 µg/mL protamine sulfate.

Đo tế bào dòng chảy

Tỷ lệ dương tính với EGFP được đo bằng FACSCalibur (BD Bioscatics).

Sàng lọc thư viện

Để sàng lọc các chất chuyển nạp Ba/F3, các tế bào được tải nạp (1.1 × 10⁵) được gieo vào đĩa 96 giếng với kích thước 1.0 × 10³ tế bào/mL với 10 nM AP20187 (TakaraBio) vào ngày 0. Để hỗ trợ sự phát triển của tế bào vô tính trong điều kiện pha loãng giới hạn, các tế bào gốc không được tải nạp (3.0 × 10⁵ tế bào/mL) được trộn làm tế bào trung chuyển. Các khuẩn lạc đang phát triển được thu nhỏ thành các đĩa 24 giếng và sau đó là các đĩa 6 cm. Cuối cùng, 18 dòng tế bào nhanh nhất đã được thử nghiệm thêm. DNA bộ gen được chiết xuất bằng Bộ mô và máu DNeasy (QIAGEN). PCR bộ gen được tiến hành để khuếch đại vùng ngẫu nhiên. Các mảnh khuếch đại đã được giải trình tự. Các quy trình tương tự đã được tiến hành để sàng lọc các chất chuyển đổi 32Dcl3.

Xét nghiệm tăng sinh tế bào

Các tế bào được rửa bằng PBS hai lần và gieo vào các đĩa 24 giếng trong môi trường nuôi cấy chứa các nồng độ AP20187 (TakaraBio) khác nhau, 1 ng/mL IL-3 (ThermoFisher Scientific) hoặc 10 ng/mL G-CSF (R&D). Hệ thống). Mật độ tế bào khả thi được ước tính bằng Bộ đếm tế bào-8 (Phòng thí nghiệm Dojindo) bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 450nm bằng Đầu đọc vi bản GloMax Discover (Promega).

Tây phương

Các quy trình thí nghiệm chi tiết về phương pháp làm mờ vết rạn da phương Tây đã được mô tả trước đây³². Trong các phân tích tín hiệu, các tế bào được nuôi cấy trong môi trường không có IL-3 trong 10–16 giờ và sau đó được kích thích bằng 10 nM AP20187, 1 ng/ml IL-3 hoặc 10 ng/ml G-CSF ở 37˚C trong 15 phút. Trong xét nghiệm biểu hiện MPO, các tế bào được nuôi cấy trong môi trường chứa 10 nM AP20187, 1 ng/ml IL-3 hoặc 10 ng/ml G-CSF trong 5 ngày. Protein của các dịch ly giải tế bào được phân giải bằng SDS-PAGE, được chuyển trên màng nitrocellulose và được thử nghiệm với các kháng thể sơ cấp và thứ cấp. Các kháng thể được sử dụng được liệt kê trong Thông tin bổ sung (Hình bổ sung. 2).

• Phân phối nội dung và PR được hỗ trợ bởi SEO. Được khuếch đại ngay hôm nay.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. Trao quyền cho chính mình. Truy cập Tại đây.
• PlatoAiStream. Thông minh Web3. Kiến thức khuếch đại. Truy cập Tại đây.
• Trung tâmESG. Than đá, công nghệ sạch, Năng lượng, Môi trường Hệ mặt trời, Quản lý chất thải. Truy cập Tại đây.
• PlatoSức khỏe. Tình báo thử nghiệm lâm sàng và công nghệ sinh học. Truy cập Tại đây.
• nguồn: https://www.nature.com/articles/s41598-023-42378-6