Nuôi cấy tế bào

E14 mESC được mua từ Ngân hàng Tế bào gốc của Viện Khoa học Trung Quốc. Chúng được nuôi cấy ở 37°C trong 5% CO₂ trong lồng ấp. Môi trường nuôi cấy là Knockout DMEM (Gibco, 10829-018), được bổ sung 15% huyết thanh bào thai bò (FBS, Gibco, 10099-141), 1× MEM axit amin không cần thiết (Gibco, 11140-050), 1× GlutaMAX (Gibco , 35050-061), 50 μM 2-Mercaptoetanol (Sigma, M3148), 1000 IU/mL LIF (Millipore, ESG1107), 1 μM PD0325901 (Selleck, S1036) và 3 μM CHIR99021 (Selleck, S2924) [25]. mESC được duy trì trên nguyên bào sợi phôi chuột được xử lý bằng mitomycin C (MEF) để di chuyển hoặc trong các đĩa phủ gelatin 0.1, 3% để thử nghiệm. Môi trường được thay đổi mỗi ngày và các tế bào được chuyển đi XNUMX ngày một lần.

Loại bỏ Haspin trong mESCs

Để loại bỏ Haspin, chúng tôi đã thiết kế hai RNA hướng dẫn (gRNA) nhắm mục tiêu vào các chuỗi mã hóa Haspin. Các gRNA được ủ và sau đó được sao chép vào vectơ pX459 được tiêu hóa BbsI. Hai plasmid Haspin gRNA này đã được đồng biến vào các tế bào WT E14 bằng cách sử dụng Lipofectamine 2000 (Lip2000, Invitrogen, 11668019). 24 giờ sau khi truyền nhiễm, môi trường được đổi sang môi trường ES bổ sung 1.5 μg/mL puromycin trong 3 ngày, và các dòng vô tính đơn lẻ còn sống sót được chọn và chuyển sang đĩa 96 giếng. Để thu được các tế bào Haspin-KO, chúng tôi đã sử dụng phương pháp tạo miễn dịch H3T3ph để chọn các dòng vô tính đơn âm tính H3T3ph. Sau đó, các đoạn DNA bộ gen của tế bào Haspin-KO được khuếch đại bằng PCR và giải trình tự để xác nhận rằng gen Haspin đã bị phá vỡ.

Cảm ứng phân chia tế bào gốc không đối xứng

Khi kiểm tra khả năng phân chia tế bào gốc không đối xứng, E14 mESC được chuyển sang môi trường N2B27 và ủ trong 16 giờ trên đĩa nuôi cấy tế bào đáy thủy tinh phủ gelatin (Nest, 801001) sau khi đi qua. Môi trường N2B27 bao gồm DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), Neurobasal (Gibco, 21103-049) (1:1), 50 μM 2-mercaptoetanol, 0.5% N2 (Gibco, 17502-048), 1% B27 (Gibco , 17504-044), dung dịch BSA 0.033% 7.5% (Thermo Fisher, 15260037) và 1× GlutaMAX (Gibco, 35050-061) [24]. Sau 16 giờ, các thí nghiệm nhuộm miễn dịch huỳnh quang ngay lập tức được thực hiện trên các tế bào và sau đó các tế bào được chuẩn bị để chụp ảnh đồng tiêu. nanô, một trong những dấu hiệu đa năng cốt lõi, luôn được sử dụng để xác định tỷ lệ ACD [24,25,26]. Khi tỷ lệ tín hiệu của Nanog giữa hai tế bào con lớn hơn 1.2 thì được coi là ACD [53].

Xây dựng plasmid và biểu hiện quá mức

Các vectơ Chek2-eGFP và Chek2-RFP được lấy từ Tiến sĩ Zhiyong Mao. Chúng tôi đã khuếch đại trình tự mã hóa của Haspin và Wnt5a từ cDNA của mESC và sau đó phân nhóm chúng thành vectơ Chek2-eGFP để thay thế trình tự mã hóa Chek2. Để biểu hiện quá mức, vectơ Haspin-eGFP hoặc Wnt5a-RFP đã được chuyển vào E14 mESC bằng Lip2000. Sau 3 ngày truyền máu, các tế bào dương tính với GFP đã được tinh chế bằng phương pháp tế bào học dòng chảy sử dụng huỳnh quang màu xanh lá cây. Hiệu quả biểu hiện quá mức được đo bằng qRT‒PCR và phương pháp Western blot.

siRNA

Các tế bào E14 đã được thay thế bằng nhắm mục tiêu siRNA chốt or Wnt5a trong 48 giờ sử dụng Lip2000 theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các chốt và Wnt5a siRNA được tổng hợp bởi Ribobio (Quảng Châu, Trung Quốc) và trình tự DNA mục tiêu của chúng được trình bày trong Bảng bổ sung 1.

Chất ức chế Haspin kinase CHR-6494

Chất ức chế Haspin kinase CHR-6494 (MCE, HY-15217) đã được hòa tan trong DMSO để tạo ra dung dịch gốc 10 mM và sau đó được bảo quản ở −20 ° C [27]. Sau khi di chuyển và kết dính tế bào, môi trường được thay đổi thành 0.5 μM hoặc 1 μM CHR-6494 được thêm vào môi trường ES hoặc môi trường N2B27 và 1 μM DMSO được sử dụng làm đối chứng. Phương tiện đã được thay đổi mỗi ngày.

Đồng bộ hóa tế bào

Để đo mức độ H3T3ph, chúng tôi đã đồng bộ hóa các mESC. Các tế bào đã được đồng bộ hóa với metaphase thông qua xử lý với 1 μg/mL colchicine (Sigma, C3915) trong 8 giờ, sau đó, các tế bào được thu thập để làm mờ vết rạn da hoặc nhuộm miễn dịch huỳnh quang.

Nhuộm phosphatase kiềm

Nhuộm phosphatase kiềm (AP) mESC được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất bằng cách sử dụng Bộ phát hiện Phosphatase kiềm (Millipore, SCR004). Đầu tiên, các tế bào được cố định trong 1 phút ở nhiệt độ phòng với 4% paraformaldehyde trong PBS và sau đó được rửa trong 5 phút với 1× PBST. Tiếp theo, dung dịch Fast Red Violet và dung dịch Napthol AS-BI phosphate được áp dụng cho mESC trong 10 phút trong bóng tối. Các tế bào nhuộm màu được rửa bằng 1× PBS và kiểm tra dưới kính hiển vi đảo ngược.

Đường cong tăng trưởng

Khoảng 20,000 tế bào được gieo vào mỗi giếng của đĩa 24 giếng (Thermo, 142475). Sau đó, các đường cong tăng trưởng được tạo ra ở 24, 48, 72, 96 và 120 giờ và ba giếng của mỗi dòng được đếm để xác định số lượng tế bào. Số lượng tế bào được đo thông qua Countess II (Thermo) theo quy trình của nhà sản xuất. Các tế bào còn lại được rửa bằng 1× PBS và môi trường được thay thế hàng ngày bằng môi trường mới.

Phân tích chu kỳ tế bào

E14 mESC được mạ trong đĩa nuôi cấy tế bào sáu giếng (Thermo, 140675). Ba ngày sau, các tế bào được cố gắng cố định và cố định trong ethanol 70% lạnh qua đêm ở 4°C. Các tế bào được nối lại và ủ bằng dung dịch RNaseA ở 37°C trong 30 phút, sau đó ủ với dung dịch propylidine iodide (PI) 50 μg/mL trong 30 phút nữa ở nhiệt độ phòng. Sau đó, BD FACS Aria ll được sử dụng để đánh giá tần số của các tế bào ở pha G1, pha S và pha G2/M.

Tạo cơ thể phôi

Phương pháp thả treo được sử dụng để tạo ra thể phôi (EB). Các tế bào E14 được phân tách và tái huyền phù trong môi trường EB ở nồng độ 1–1.5 × 10⁵ tế bào/mL. Môi trường EB chứa Knockout DMEM, 15% FBS, 1× MEM axit amin không cần thiết, 1× Natri Pyruvate và 0.1 mM 2-Mercaptoetanol [54]. Sau đó, 20 µL giọt treo được nuôi cấy trong ba ngày trên nắp đĩa 10 cm. Để ngăn giọt treo bị khô, 1× PBS được đặt ở dưới cùng của nắp. Sau ba ngày, EB được thu thập, chuyển vào các tấm có độ bám dính cực thấp (Corning, 3474) và nuôi cấy trên môi trường EB thêm 3 ngày nữa. Các mẫu EB được thu thập và sau đó được thực hiện qRT‒PCR để phân tích mức độ biểu hiện gen.

Sự hình thành khối u quái

Chuột được nuôi và xử lý theo hướng dẫn của Ủy ban Viện Nghiên cứu Động vật của Đại học Tongji, Thượng Hải, Trung Quốc. Để hình thành u quái, các tế bào E14 đã được cố gắng cố gắng tạo ra các tế bào đơn lẻ. Với mỗi loại ô, tổng cộng là 1 × 10⁶ các tế bào được treo lại trong môi trường 100 μL EB và tiêm dưới da vào hai bên sườn của chuột đực 8 tuần tuổi NOD-SCID bị suy giảm miễn dịch (n = 4 khối u/nhóm). Bốn tuần sau khi tiêm chủng, khối u quái được thu hoạch và cân. Sau đó, những khối u quái này được thu thập trong 4% PFA, nhúng vào parafin và được cắt thành từng phần trong microtome. Các phần của mỗi khối u quái được nhuộm bằng hematoxylin/eosin (H&E) và được phân tích sâu hơn.

PCR định lượng thời gian thực (qRT‒PCR)

Tổng RNA được chiết xuất từ ​​WT và Haspin-KO mESC, EB và u quái bằng TRIzol (Invitrogen, 10296010) theo giao thức. Tổng RNA được định lượng bằng máy quang phổ kế NanoDrop 2000 (Thermo). Sau đó, quá trình sao chép ngược thành cDNA được thực hiện bởi Bộ thuốc thử PrimeScript RT với gDNA Eraser (Takara, RR047). qRT‒PCR được thực hiện bằng cách sử dụng TB Green Fast qPCR Mix (Takara, RR430) với thể tích phản ứng là 20 μL và hệ thống Bio-Rad CFX Connect (Bio-Rad). Mức độ biểu hiện mRNA tương đối đã được chuẩn hóa thành GAPDH và được phân tích bằng phương pháp 2-delta-delta-Ct để tính toán sự thay đổi tương đối của nếp gấp. Trình tự mồi được liệt kê trong Bảng bổ sung 1.

Nhuộm huỳnh quang miễn dịch

Đối với nhuộm miễn dịch huỳnh quang, các tế bào phát triển trên đĩa nuôi cấy tế bào đáy kính được cố định bằng 4% paraformaldehyde ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Các mẫu được thẩm thấu bằng PBST (0.2% Triton X-100) ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó, các tế bào bị chặn bằng 5% BSA ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau đó, các mẫu được ủ qua đêm với kháng thể chính ở 4°C. Hơn nữa, các mẫu được rửa ba lần bằng PBST và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ với kháng thể thứ cấp và Hoechst 33342 (Invitrogen, H3570). Sau đó, các mẫu được rửa trong PBST ba lần ở nhiệt độ phòng và bảo quản trong bóng tối. Hình ảnh được chụp bằng kính hiển vi đảo ngược Zeiss-LSM880. Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm Zeiss và phần mềm ImageJ.

Tây phương

Để chiết xuất protein, mESC được ly giải bằng cách sử dụng bộ đệm RIPA (Beyotime, P0013B) có bổ sung chất ức chế protease (Beyotime, P1005) và chất ức chế phosphatase (Beyotime, P1081), sau đó, lysate được ly tâm ở 12,000 rcf và 4 ° C trong 20 phút . Nồng độ protein của chất nổi phía trên được xác định bằng cách sử dụng Xét nghiệm Protein BCA (Thermo, 23227) và sau đó được chuẩn hóa. Lượng mẫu protein tương đương được phân tách bằng gel SDS‒PAGE 15% và sau đó được chuyển sang màng PVDF 0.2 μm (Millipore, ISEQ00010). Màng được chặn bằng TBST bổ sung 5% BSA ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ và sau đó được ủ với kháng thể chính ở 4 ° C qua đêm. Tiếp theo, màng được rửa ba lần bằng TBST, sau đó là kháng thể thứ cấp liên hợp HRP trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Các màng được hiển thị bằng thuốc thử phát quang hóa học ECL (Thermo, 34577).

RNA-seq và phân tích dữ liệu

RNA được chiết xuất từ ​​Haspin-KO và kiểm soát mESC bằng TRIzol. Sau đó, 1 μg RNA đã được chuẩn bị để tạo thư viện giải trình tự. Các thư viện đã được giải trình tự trên IIIuma NovaSeq 6000 (bộ gen Berry) theo giao thức. Để phân tích dữ liệu, các lần đọc được cắt bớt (sử dụng Cutadapt, v1.9.1) được ánh xạ tới bộ gen của chuột (mm10) bằng Hisat2 (v2.0.1). Phân tích gen biểu hiện khác biệt (DEG) được thực hiện bằng DESeq2. Các DEG quan trọng được xác định bằng P các giá trị <0.05 và thay đổi lần> 2, sau đó GOSeq (v1.34.1) được sử dụng để xác định các thuật ngữ Gene Onology (GO).

Xét nghiệm báo cáo Dual-luciferase

Chúng tôi đã khuếch đại các đoạn của trình khởi động Wnt5a (~2 kb ngược dòng TSS) và Pax2 CDS, sau đó, chúng tôi sao chép Wnt5a vào vectơ báo cáo luciferase pGL3 và Pax2 CDS vào vectơ biểu hiện quá mức CAG-eGFP. mESC được gieo vào các đĩa 24 giếng với mật độ 2 × 10⁵ tế bào/mL. Ngày hôm sau, chất kích thích Pax2-eGFP, pRL-SV40, pGL3-Basic hoặc pGL3-Wnt5a đã được đồng nhiễm vào các tế bào bằng Lip2000 và nuôi cấy trong 36 giờ. Mặt khác, bộ khởi động pRL-SV40 và pGL3-Wnt5a đã được đồng bộ hóa vào các tế bào WT. Sau 8 giờ, các tế bào được chuyển nhiễm được đưa vào môi trường chứa WT, DMSO, 0.5 μM CHR-6494 và 1 μM CHR-6494 và ủ trong 36 giờ. Sau đó, các tế bào được thu hoạch và ly giải để đo hoạt tính luciferase theo quy trình của nhà sản xuất (Promega, E1910).

Tăng cường miễn dịch nhiễm sắc thể

Các xét nghiệm tăng cường miễn dịch nhiễm sắc thể (ChIP) được thực hiện bởi bộ Magna ChIP A/G (Millipore) theo giao thức. Tóm lại, các mESC được liên kết chéo và sau đó được siêu âm thành 200 mảnh500 bp, tiếp theo được kích thích miễn dịch bằng kháng thể chống lại Pax2 (Công nghệ tín hiệu tế bào, 9666) hoặc IgG. Sau đó, DNA nhiễm sắc thể kết tủa được phục hồi và phân tích bằng xét nghiệm qRT‒PCR.

Kháng thể

Các kháng thể chính sau đây được sử dụng để nhuộm vết rạn da phương Tây hoặc nhuộm miễn dịch huỳnh quang: anti-H3T3ph (Abcam, ab130940), anti-H3S10ph (Abcam, ab14955), anti-GAPDH (Proteintech, HRP-60004), anti-caspase-3 (Tín hiệu tế bào Technology, 9662S), caspase-3 chống phân cắt (Công nghệ tín hiệu tế bào, 9664S), chống α-tubulin (Mô-típ hoạt động, 39527), chống Nanog (Abcam, ab80892), chống Sox2 (Abcam, ab79351), chống -Oct4 (Abcam, ab27985), anti-Klf4 (Abcam, ab129473), anti-Wnt5a (Abcam, ab235966) và anti-Pax2 (Công nghệ tín hiệu tế bào, 9666).

Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu thống kê được trình bày dưới dạng trung bình ± SEM. Mỗi thử nghiệm được lặp lại ít nhất ba lần và kết quả được phân tích bằng SPSS 20.0. Ý nghĩa thống kê giữa các nhóm được xác định bằng cách sử dụng các bài kiểm tra t của Học sinh hai đuôi không ghép đôi. *P < 0.05, **P < 0.01 và ***P < 0.001 được coi là sự khác biệt có ý nghĩa thống kê và P > 0.05 được coi là không có ý nghĩa.

• Phân phối nội dung và PR được hỗ trợ bởi SEO. Được khuếch đại ngay hôm nay.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. Trao quyền cho chính mình. Truy cập Tại đây.
• PlatoAiStream. Thông minh Web3. Kiến thức khuếch đại. Truy cập Tại đây.
• Trung tâmESG. Ô tô / Xe điện, Than đá, công nghệ sạch, Năng lượng, Môi trường Hệ mặt trời, Quản lý chất thải. Truy cập Tại đây.
• PlatoSức khỏe. Tình báo thử nghiệm lâm sàng và công nghệ sinh học. Truy cập Tại đây.
• ChartPrime. Nâng cao trò chơi giao dịch của bạn với ChartPrime. Truy cập Tại đây.
• BlockOffsets. Hiện đại hóa quyền sở hữu bù đắp môi trường. Truy cập Tại đây.
• nguồn: https://www.nature.com/articles/s41420-023-01604-w