Tổng hợp nanobot

Nanobots đã được chuẩn bị như mô tả trước đây³³. Tóm lại, MSNP được tổng hợp bằng phương pháp Stöber đã sửa đổi⁴¹, phản ứng với trietanolamine (35 g), nước siêu tinh khiết (20 ml) và hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB; 570 mg) ở 95 °C trong 30 phút trong khi khuấy. Tetraethyl orthosilicate (1.5 ml) sau đó được thêm từng giọt vào; hỗn hợp này được để phản ứng trong 2 giờ ở 95 °C và thu được MSNP được thu thập bằng cách ly tâm và rửa trong etanol (ba lần, 2,500g, 5 phút). Để loại bỏ mẫu CTAB, MSNP được đặt trong điều kiện hồi lưu trong metanol có tính axit (1.8 ml HCl, 30 ml metanol) trong 24 h. Sau đó, MSNP được thu thập bằng cách ly tâm và rửa ba lần trong etanol (2,500g, 5 min) trước khi kết hợp biến đổi amin bằng cách thêm APTES (6 µl mỗi mg MSNP) vào MSNP (1 mg ml^-1) trong dung dịch etanol 70% ở 70 °C, khuấy mạnh trong 1 h. MSNP-NH₂ được thu thập và rửa ba lần trong ethanol và ba lần trong nước bằng cách ly tâm (ba lần, 1,150g, 5 phút). MSNP-NH₂ được huyền phù lại trong PBS ở nồng độ 1 mg ml^-1 và tổng thể tích là 900 µl, và được kích hoạt bằng glutaraldehyde (100 µl) trong 2.5 h ở nhiệt độ phòng. MSNP-NH được kích hoạt₂ được thu thập và rửa trong PBS ba lần bằng cách ly tâm (1,150g, 5 min), được huyền phù lại trong dung dịch urease (3 mg ml^-1) và PEG dị thể (1 μg PEG trên mỗi mg 5 kDa HS-MSNPs-NH₂) trong PBS và phản ứng trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các nanobot thu được được thu thập và rửa ba lần trong PBS bằng cách ly tâm (1,150g, 5 min) trước khi phân tán lại chúng trong môi trường phân tán AuNP, được chuẩn bị như mô tả trước đây⁵¹, để chúng phản ứng trong 10  phút và rửa kỹ bằng cách ly tâm (ba lần, 1,150g, 5 phút).

Phân bố kích thước thủy động lực và điện tích bề mặt của MSNP, MSNP-NH₂, nanobots và nanobots trang trí AuNP được xác định bằng cách sử dụng hệ thống tán xạ ánh sáng động Wyatt Mobius và Malvern Zetasizer tương ứng. Trong mọi trường hợp, nồng độ là 20 µg ml^-1 và thời gian thu nhận là 5 giây, sử dụng ba lần chạy cho mỗi thử nghiệm. Ba phép đo cho mỗi loại hạt đã được thực hiện.

Tổng hợp FITC MSNP

Hỗn hợp FITC (2 mg), etanol (5 ml) và APTES (400 µl) được chuẩn bị và khuấy trong 30 phút. Sau đó, quy trình tổng hợp MSNP được mô tả trước đó được tuân theo, ngoại trừ việc chúng tôi thêm từng giọt tetraethyl orthosilicate (1.25 ml) kết hợp với hỗn hợp FITC–APTES (250 µl). Các bước chức năng hóa để thu được nanobot có nhãn FITC như đã nói ở trên.

Tổng hợp AuNP

AuNP được tổng hợp bằng phương pháp được báo cáo³³. Tóm lại, tất cả các vật liệu đều được làm sạch bằng nước cường toan mới chuẩn bị, rửa kỹ bằng nước và để khô trong không khí. Sau đó, AuCl 1 mM₄ dung dịch được đun nóng đến điểm sôi trong khi khuấy trong bình đáy tròn tích hợp vào hệ thống hồi lưu. Sau đó, thêm 10 ml dung dịch natri citrat (30.8 mM) vào và đun sôi dung dịch này trong 20 phút, tạo thành màu đỏ. Sau đó, dung dịch được để nguội đến nhiệt độ phòng trong khi khuấy trong 1 giờ. AuNP thu được được bảo quản trong bóng tối và tiến hành xác định đặc tính bằng kính hiển vi điện tử truyền qua.

Hoạt động enzym

Hoạt động enzyme của nanobots, ¹⁸F-nanobot và ¹³¹I-nanobots được đo bằng phenol đỏ. Để làm như vậy, 2 µl nanobots (1 mg ml^-1) được thêm vào đĩa 96 giếng và trộn với 200 l dung dịch urê khác nhau (0, 50, 100, 200 mM) trong 1.1 mM phenol đỏ. Độ hấp thụ ở bước sóng 560 nm được đo theo thời gian ở 37 °C.

Động lực học chuyển động của Nanobot qua kính hiển vi quang học

Các video quang học của nanobot được thu được bằng kính hiển vi Leica Thunder, kết hợp với máy ảnh CCD tốc độ cao Hamamatsu và vật kính ×1.25. Để làm được điều này, các nanobot được ly tâm và phân tán lại trong 50 µl PBS (nồng độ cuối cùng là 20 mg ml^-1). Sau đó, đĩa Petri chứa đầy 3 ml PBS hoặc dung dịch urê 300 mM (trong PBS) và quan sát dưới kính hiển vi. Một giọt 5 µl với nanobot (20 mg ml^-1) sau đó được thêm vào đĩa Petri chứa đầy chất lỏng và video được ghi ở tốc độ 25 khung hình mỗi giây. Sự phân bổ cường độ pixel video trong ROI được phân tích trong khoảng thời gian 15 giây bằng phần mềm ImageJ.

Dán nhãn phóng xạ cho nanobots bằng [¹⁸F] F-PyTFP

Tổng hợp [¹⁸F] F-PyTFP

[¹⁸F] F-PyTFP đã được tổng hợp trong mô-đun Neptis xSeed (Ứng dụng hóa phóng xạ được tối ưu hóa), theo phương pháp được báo cáo trước đó³³.

Tổng hợp ¹⁸Nanobots có nhãn F

Nanobots được dán nhãn [¹⁸F]F-PyTFP, trên cơ sở quy trình đã được thiết lập trước đó với những sửa đổi nhỏ³³. Tóm lại, 200 µl dung dịch nanobot (1 mg ml^-1) được ly tâm (10 phút, 13,853g), được huyền phù lại trong 10 µl PBS (1 mM, pH 8) và được ủ với 4 µl [¹⁸F]F-PyTFP trong axetonitril (khoảng 37 MBq) trong 35 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi ủ, hỗn hợp phản ứng được pha loãng với nước (200 µl) và được tinh chế bằng cách ly tâm (5 phút, 13,853g). Sau đó, viên thu được được rửa sạch ba lần bằng nước trước khi được đo trong máy hiệu chuẩn liều lượng (CPCRC-25R, Capintec). Hiệu suất hóa phóng xạ được tính bằng tỷ lệ giữa lượng phóng xạ có trong nanobot sau khi rửa và lượng phóng xạ ban đầu. Độ tinh khiết hóa học phóng xạ sau khi tinh chế là ≥99%, được xác định bằng sắc ký lớp mỏng vô tuyến (radio-TLC) sử dụng giấy sắc ký iTLC-SG (Agilent Technologies) và dichloromethane và metanol (2:1) lần lượt là pha tĩnh và pha động. Các tấm TLC được phân tích bằng đầu đọc TLC (MiniGITA, Raytest).

Tính ổn định của ¹⁸F-nanobot

sự ổn định của ¹⁸Các nanobot gắn nhãn F được xác định bằng cách sử dụng các môi trường sau: (1) 300 mM urê, (2) nước và (3) nước tiểu từ động vật mang khối u. ¹⁸Các nanobot có nhãn F (10 µl) được ủ với dung dịch tương ứng (100 µl) trong 1 h ở nhiệt độ phòng. Sau đó, nanobot và chất nổi phía trên được tách ra bằng cách ly tâm và thu thập, đồng thời đo độ phóng xạ bằng máy hiệu chuẩn liều (CPCRC-25R).

Dán nhãn phóng xạ cho nanobots bằng ¹³¹I

Quá trình iốt phóng xạ của nanobot urease được thực hiện bằng cách ủ các nanobot với dung dịch tiêm [¹³¹I]Dung dịch NaI (925 MBq ml^-1; GE HealthCare). Tóm lại, 400 µl dung dịch nanobot urease (1 mg ml^-1) được ly tâm (13,853g, 5  phút), được tạo huyền phù trong 100 µl PBS (10 mM, pH 7.4) và ủ với 25 µl hoặc 185 l dung dịch tiêm [¹³¹I]NaI (tương ứng khoảng 42.55 hoặc 277.5 MBq) trong 30  phút, tùy thuộc vào hoạt động cuối cùng mong muốn. Sau khi ủ, hỗn hợp phản ứng được tinh chế bằng cách ly tâm (13,853g, 5 phút). Kết tủa thu được được rửa ba lần bằng nước (100 l). Hoạt độ phóng xạ ở phần nổi phía trên và kết tủa được xác định bằng cách sử dụng máy hiệu chuẩn liều (CPCRC-25R) và cả hai phần được phân tích bằng radio-TLC, như đối với ¹⁸F-nanobot.

Phát triển mô hình động vật

Chuột được bảo quản và xử lý theo Chỉ thị 2010/63/UE của Hội đồng Châu Âu và các hướng dẫn nội bộ. Tất cả các quy trình thử nghiệm đã được phê duyệt bởi ủy ban đạo đức CIC biomaGUNE và chính quyền địa phương (Diputación Foral de Guipuzcoa, PRO-AE-SS-276). Phân tích hình ảnh (cả PET và MRI) đều bị mù đối với sự phân bố nhóm của động vật.

Mô hình chuột chỉnh hình của ung thư bàng quang được tạo ra bằng cách tiêm tế bào MB49 (dòng tế bào bàng quang ung thư biểu mô chuột) vào chuột cái C57BL/6JRj (8 tuần tuổi, Janvier). Đối với các thí nghiệm nhằm xác định sự tích tụ khối u (bốn nhóm; chi tiết bên dưới), sáu con vật được tiêm chủng cho mỗi nhóm, được xác định bằng cách sử dụng phân tích độ chính xác, với các giả định sau: độ chính xác yêu cầu, 20%; sd dự kiến, ± 20%; độ tin cậy là 95%; mất động vật, 20%. Đối với các thí nghiệm về hiệu quả điều trị (sáu nhóm; chi tiết bên dưới), mười con vật được đưa vào mỗi nhóm, được tính toán bằng cách sử dụng Học sinh một đuôi t-test, sự khác biệt giữa hai phương tiện độc lập, với các giả định sau: giả thuyết khống, việc điều trị không ảnh hưởng đến sự phát triển của khối u; α, 0.05; 1 − β, 0.95; sd, ± 50%; sự khác biệt dự kiến ​​giữa các nhóm là 50%; mất động vật, 20%. Vì thí nghiệm được tiến hành thành hai đợt vì lý do vận hành nên một nhóm đối chứng được đưa vào cả hai đợt (Bảng 2), và sau đó tất cả các động vật được gộp lại. Để hình thành khối u, chuột được gây mê bằng cách hít 3% isoflurane trong OXNUMX nguyên chất.₂ và duy trì ở nồng độ 1.0–1.5% isoflurane trong 100% O₂. Sau đó, bàng quang được làm trống và các tổn thương hóa học gây ra trên biểu mô tiết niệu bằng cách nhỏ 50 µl poly- vào trong bàng quang.l-lysine (Sigma-Aldrich) qua ống thông 24 gauge trong 15 phút. Sau đó, bàng quang lại được làm trống và các tế bào MB49 (10⁵ tế bào) trong DMEM hàm lượng glucose cao (100 µl) được nhỏ trong 1 h trước khi tháo ống thông và làm rỗng bàng quang bằng cách xoa bóp bụng. Trong suốt các thí nghiệm, chuột được theo dõi và cân nặng để theo dõi sức khỏe và phúc lợi. Điểm cuối trên người được áp dụng nếu giảm cân vượt quá 20% hoặc dựa trên các triệu chứng lâm sàng, theo tiêu chí của bác sĩ thú y phụ trách.

Theo dõi kích thước khối u

Các nghiên cứu MRI được tiến hành 7 và 14 ngày sau khi phát hiện khối u, sử dụng máy quét 7 T Bruker BioSpec USR 70/30 (Bruker BioSpin) được trang bị bộ chèn gradient BGA-12S 440 mT m^-1 và bộ cộng hưởng QSN 112/086 (T12053V3) cho tần số vô tuyến¹⁴ truyền và cuộn dây bề mặt não chuột (T11205V3) để thu RF (cả hai đều hoạt động ở tần số 300 MHz). Động vật được gây mê bằng isoflurane (4% cho cảm ứng và 1.5% cho duy trì trong môi trường 50% OXNUMX).₂/50%N₂ hỗn hợp) và đặt trên giá đỡ tương thích với MR. Nhiệt độ cơ thể và tốc độ hô hấp được theo dõi liên tục bằng thiết bị theo dõi tương thích MR (model 1030 SA, Dụng cụ động vật nhỏ), kết nối với hệ thống sưởi không khí cho loài gặm nhấm nhỏ để duy trì nhiệt độ cơ thể. Sau khi có được hình ảnh tham chiếu, chuỗi hình ảnh có trọng số khuếch tán dựa trên tiếng vang spin đã được sử dụng để chụp ảnh các khối u, sử dụng các tham số sau: thời gian tiếng vang (T_E) = 22.3 ms, thời gian lặp lại (T_R) = 2,500 ms, n = 2 mức trung bình, một ảnh A0 (ảnh cơ bản có b = 0 smm^-2) và một hình ảnh DW thu được bằng cách sử dụng gradient khuếch tán theo hướng (1, 0, 0) với thời lượng gradient δ = 4.5 ms và phân tách độ dốc Δ = 10.6 ms, cho b = 650 smm^-2, 16 × 16 mm² trường nhìn, kích thước ma trận hình ảnh 160 × 160 điểm, 20 lát cắt liên tiếp có độ dày 0.5 mm (không có khe hở, thu được ở chế độ xen kẽ) và băng thông 192.9 Hz trên mỗi pixel. Để hình dung các khối u, hình ảnh được xử lý hậu kỳ bằng phần mềm ImageJ, phân chia hình ảnh thu được bằng độ dốc khuếch tán (b = 650 smm^-2) bởi những người có được mà không có (b = 0 smm^-2) và áp dụng bộ lọc Gaussian 3D (σ_x = σ_y = σ_z =  0.7) vào kết quả. Các khối u được phác họa thủ công để xác định khối lượng của chúng.

Phân phối sinh học in vivo

Vào ngày thứ 15 sau khi tạo ra khối u, chuột được chia ngẫu nhiên thành bốn nhóm để có được sự phân bổ khối lượng khối u trung bình đồng nhất giữa các nhóm. Quét PET-CT (máy quét MOLECUBES β và X-CUBE) được thực hiện 3 h sau khi tiêm tĩnh mạch 100 l dung dịch ¹⁸F-BSA (nhóm 1 và 2) hoặc ¹⁸Nanobots F-urease (nhóm 3 và 4) ở nồng độ 200 µg ml^-1, sử dụng nước (nhóm 1 và 3) hoặc 300 mM urê trong nước (nhóm 2 và 4) làm phương tiện (Bảng 1). Để thu được hình ảnh, động vật được gây mê (5% isoflurane trong oxy nguyên chất) và đặt ở tư thế nằm ngửa trước khi xoa bóp vùng bụng để sơ tán bàng quang. Ngay sau đó, thông báo tương ứng ¹⁸Nanobots có nhãn F (¹⁸F-BSA/¹⁸F-urease trong nước/urê) được nhỏ vào bàng quang thông qua ống thông 24 thước và ủ trong 1 giờ, trước khi tháo ống thông, làm rỗng bàng quang và để chuột hồi phục sau khi gây mê. Tại t = 3 h sau khi dùng, động vật được gây mê lại và thu được hình ảnh PET toàn thân tĩnh trong 10 min, sau đó là chụp CT. Hình ảnh PET được xây dựng lại bằng thuật toán tái tạo tối đa hóa kỳ vọng tập hợp con theo thứ tự 3D với các hiệu chỉnh ngẫu nhiên, phân tán và suy giảm. Hình ảnh PET-CT của cùng một con chuột đã được đồng đăng ký và phân tích bằng công cụ xử lý hình ảnh PMOD. Sơ đồ nồng độ phóng xạ theo thời gian thu được bằng cách tạo ra một khối quan tâm ở vùng trên bàng quang bằng cách sử dụng công cụ tạo đường viền 3D và đo hoạt động (đã hiệu chỉnh phân rã) tính bằng kilobecquerel trên mỗi cơ quan. Kết quả được hiệu chỉnh bằng cách áp dụng hệ số hiệu chuẩn và sau đó được chuẩn hóa bằng thể tích khối u thu được từ MRI.

Nghiên cứu ex vivo

Phân tích mô bệnh học

Sau khi hoàn thành tất cả các hình ảnh, các bong bóng được chọn (n = 3 mỗi nhóm) từ động vật mang khối u và động vật khỏe mạnh được loại bỏ trong điều kiện vô trùng và cố định ngay trong 4% formaldehyde. Sau đó, các bong bóng được nhúng vào parafin trước khi lấy 2 phần–3 m để nhuộm haematoxylin–eosin. Hình ảnh đại diện được lấy từ tất cả các điều kiện để kiểm tra mô bệnh học.

phân tích ICP-MS

Các phép đo được thực hiện trên Thermo iCAP Q ICP-MS (Thermo Fisher Scientific) kết hợp với bộ lấy mẫu tự động ASX-560 (CETAC Tech). Sau khi hoàn thành tất cả các hình ảnh, động vật đã bị giết và các bong bóng được chọn (n = 2 mỗi nhóm; bốn nhóm) được thu thập và phân hủy trong 1  ml HNO₃:HCl (hỗn hợp 4:1). Dịch phân tán được đun sôi cho đến khi các cơ quan hòa tan hoàn toàn. Sau đó, dung dịch được làm lạnh đến nhiệt độ phòng và được phân tích bằng ICP-MS để xác định nồng độ Au trong mỗi mẫu, chuyển kết quả thành phần trăm liều tiêm trên mỗi gam mô (%ID g^-1).

Hóa mô miễn dịch và hình ảnh kính hiển vi đồng tiêu

Để phân tích hóa mô miễn dịch, động vật mang khối u đã nhận được nanobot gắn nhãn FITC trong nước hoặc urê 300 mM (n = 4 mỗi nhóm), như được mô tả ở trên, đối với nghiên cứu PET-CT. Ngoài ra, động vật mang khối u không có nanobot được coi là nhóm đối chứng (n = 2). Trong mọi trường hợp, bong bóng được thu thập, đông lạnh và cắt thành các phần 10 m rồi cố định ngay trong 10% formaldehyd trong 15 phút, rửa bằng 10 mM PBS và sau đó ủ trong 50 mM NH₄Cl trong PBS trong 5  phút trước khi rửa lại bằng PBS. Quá trình thẩm thấu được thực hiện với metanol:axeton (1:1) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng và 0.1% Triton trong PBS trong 5 phút. Sau khi rửa PBS, các mẫu được bão hòa với dung dịch 5% BSA–0.5% Tween trong PBS trong 15  phút ở nhiệt độ phòng và ủ trong 1  giờ ở nhiệt độ phòng với chuột chống FITC (1:100, Abcam) trong 5% BSA –0.5% Tween. Các phần được rửa ba lần với 10 mM PBS trong 5 phút và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng với kháng thể thứ cấp Alex Fluor 647 lừa chống chuột IgG (Probes phân tử, Life Technologies, 1:1,000) trong 5% BSA–0.5% Tween trong PBS, được rửa lại trong PBS (3 × 5 phút) và gắn bộ chống phai màu ProLong với 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Đầu dò phân tử, Life Technologies). Hình ảnh được thu được bằng kính hiển vi đồng tiêu Leica STELLARIS 5 (Công viên khoa học UPV / EHU) với các cài đặt giống hệt nhau cho tất cả các phần: độ phóng đại × 10 với hình ảnh và đường khâu xếp (thường là trường nhìn 4   ×  5). Đường laser và cửa sổ phát hiện là 405 nm và 440–503 nm đối với DAPI, 489 nm và 494–602 nm đối với laser trắng FITC và 653 nm và 660–836 nm đối với laser trắng Alexa647.

Xóa quang học

Sau khi truyền với 4% paraformaldehyde và PBS, các mẫu bàng quang được loại bỏ và cố định thêm trong 4% paraformaldehyde qua đêm ở 4 °C, sau đó nhúng vào ống tiêm 5 ml có agarose có điểm nóng chảy thấp 0.8% để tạo thành khối hình trụ và cho phép dễ dàng sử dụng. gắn vào cuvet thạch anh. Toàn bộ khối được khử nước dần dần bằng metanol:H₂O ở 4 °C (30%:70% trong 1 h, 50%:50% trong 1 h, 70%:30% trong 1 h, 100%:0% trong 1 h, sau đó 100% metanol qua đêm và lặp lại trong 4 h) và cuối cùng được ngâm trong benzyl Alcohol–benzyl benzoate (BABB) làm dung dịch so sánh chỉ số khúc xạ cho hình ảnh. Để so sánh trong ống nghiệm giữa các nanobot FITC màu xanh lá cây với các hạt màu đỏ thương mại, chúng tôi đã sử dụng các hạt nano silica huỳnh quang màu đỏ DiagNano (Chẩn đoán sáng tạo), đường kính 1 µm, có khả năng chống lại khả năng làm sạch BABB.

Hình ảnh sLS tự phát huỳnh quang và phân cực

Hình ảnh tấm ánh sáng được thực hiện trên MacroSPIM, một hệ thống tùy chỉnh để xóa hình ảnh toàn bộ cơ quan được phát triển tại IRB Barcelona^44,45. Tóm lại, các mẫu được nhúng vào khối agarose, được làm sạch cùng với mẫu và chụp ảnh bên trong cuvet thạch anh. Hình ảnh tự phát huỳnh quang sử dụng tia laser ở bước sóng 488, 561 hoặc 638 nm mang lại ánh sáng thông qua thấu kính hình trụ đôi tiêu sắc 50 mm (ACY254-050-A, Thorlabs). Để giảm hiện tượng sọc, tấm ánh sáng được xoay bằng máy quét cộng hưởng SC-10 (EOPC) dọc theo kính viễn vọng 4f với thấu kính đôi tiêu sắc G322288322 100 mm (QI Optic Photonics). Sự tự phát huỳnh quang của mô được thu thập thông qua các bộ lọc huỳnh quang dải hoặc dải dài và được ghi lại bằng máy ảnh ORCA Flash v2 (Hamamatsu Photonics). Hình ảnh được thực hiện ở mức ×9.6 với ống kính zoom ×8, ống kính ×2 và ống kính ống ×0.6. Tấm ánh sáng được làm phẳng trên toàn bộ trường nhìn, mang lại độ phân giải trục 5–6 m. Hình ảnh 3D được thực hiện theo các bước 2.5  m. Hình ảnh toàn bộ bàng quang được thực hiện ở 2 × 3 hoặc 3 × 4 XY gạch, tùy thuộc vào kích thước cơ quan.

Hình ảnh sLS đạt được bằng cách loại bỏ bộ lọc huỳnh quang hoặc sử dụng bất kỳ bộ lọc nào truyền tia laser. Xoay tấm đèn giúp giảm nhiễu đốm laze, dẫn đến tính kết hợp laze trung bình theo thời gian như minh họa trước đó⁵². Hướng phân cực của tấm ánh sáng tuyến tính trong chiếu sáng được điều khiển bằng cách xoay một tấm nửa sóng (AHWP05M-600, Thorlabs) trước máy quét trục. Tín hiệu được phát hiện đã được chọn trong phân cực bằng cách sử dụng bộ phân cực tuyến tính quay (LPVISC100, Thorlabs) trước khi bánh xe lọc được phát hiện, làm giảm cường độ> 50% khi phát hiện huỳnh quang. Mặc dù sự phân bố tín hiệu sLS nói chung thay đổi theo hướng của bản phân cực, tín hiệu tự phát huỳnh quang của mô vẫn không bị ảnh hưởng bởi chuyển động quay của bản phân cực. sLS mang lại độ phân giải không gian 2.4 ± 0.3 µm trong BABB, tương đương với độ phân giải trong hình ảnh tấm đèn huỳnh quang (được xác nhận bằng cách khớp chức năng Gaussian với XY phản ứng hình ảnh của một hạt đơn lẻ, Hình bổ sung. 8l–m) và gần với độ phân giải lý thuyết trong không khí (1.53 µm với khẩu độ số (NA) = 0.2 ở mức thu phóng macro tối đa ×8).

Xử lý hình ảnh và phân tích 3D

Việc xử lý, phân đoạn và phân tích hình ảnh của bộ dữ liệu bảng ánh sáng được thực hiện bằng ImageJ/Fiji, trong khi Figs. 3 và 4 được tạo bằng Imaris Viewer 9.9 (https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer) và Video bổ sung 3 được tạo bằng Imaris 9 (https://imaris.oxinst.com/) (Bitplane, Dụng cụ Oxford). Các bộ dữ liệu về tấm ánh sáng được xếp chồng lên nhau được ghép lại bằng KhảmExplorerJ⁵³. Phân đoạn 3D mô bàng quang được thực hiện bằng cách sử dụng macro ImageJ/Fiji tùy chỉnh để chú thích 3D bán tự động với khối lượng lớn ở chế độ ảo. Tóm lại, tập lệnh đầu tiên, 'Macro1', tải các ngăn xếp hình ảnh 3D, cho phép người dùng chú thích ROI trong một số mặt phẳng và tự động nội suy ROI để tạo và xuất mặt nạ 3D. ROI được vẽ sau mỗi 15 mặt phẳng (cứ sau 37.5 µm) để tạo điều kiện phân đoạn liên tục tốt trong khi vẫn giữ chú thích ở mức tối thiểu hợp lý. Tập lệnh thứ hai, 'Macro2', thực hiện các phép toán hoặc phép toán Boolean, theo từng mặt phẳng mà không tải toàn bộ ngăn xếp vào bộ nhớ, giữa mặt nạ 3D hoặc giữa mặt nạ 3D và dữ liệu gốc, lưu kết quả dưới dạng ngăn xếp mới. Tất cả các mặt nạ được tạo ra bằng cách chú thích hình ảnh tự phát huỳnh quang.

Cả khối u và lớp bề mặt mô khỏe mạnh (Hình 2). 3) được phác họa bằng cách sử dụng dụng cụ đũa và dây thòng lọng của Fiji trên khoang bàng quang trong một chiếc mặt nạ. Gọi lần lặp đầu tiên này là BC1, các lần chạy tiếp theo của Macro1 sau đó sẽ tự động giãn nở đường viền 3D này theo một lượng pixel xác định để tạo ra các lần lặp mặt nạ mới, BC2, BC3, v.v., với độ giãn nở ngày càng tăng. Lớp đầu tiên chứa cả khối u và mô khỏe mạnh, mặt nạ L1, thu được bằng cách trừ mặt nạ BC1 khỏi BC2, v.v., thu được L2 và L3 dưới dạng các lớp đồng tâm. Khối lượng khối u gần khoang nhất được thu được bằng cách chú thích khối u bằng công cụ đũa và lasso để tạo mặt nạ T1, trong khi lớp urothelium 3D khỏe mạnh được phát hiện riêng biệt trong mặt nạ U1. Trừ U1 khỏi L1 sẽ tạo ra lớp bề mặt của khối u, v.v.: L2 − U1, L3 − U1. Ngược lại, lớp đầu tiên của biểu mô tiết niệu thu được bằng cách trừ T1 khỏi L1. Tất cả các lớp trong hình. 3 được xác định là có độ dày 33 µm.

Bộ macro và quy trình tương tự (công cụ đũa ImageJ, xói mòn kỹ thuật số 500 µm, v.v.) đã được sử dụng để phác họa và phân đoạn phần bên trong của mô bàng quang, sau đó ước tính thể tích mô bên trong của bàng quang (Hình XNUMX). 4, xem chi tiết ở trên). Biểu đồ cường độ tín hiệu tán xạ được tạo ra ở Fiji bằng cách kết hợp tín hiệu tán xạ và mặt nạ.

RNT sử dụng ¹³¹I-nanobots

Giữa ngày 8 và 15 sau khi cấy ghép khối u, động vật được chia thành sáu nhóm (nhóm 1–6), cố gắng đạt được khối lượng khối u trung bình tương tự giữa các nhóm (Bảng 2). Đối với các thí nghiệm, động vật được gây mê bằng thuốc mê (5% isoflurane trong O tinh khiết₂) và đặt nằm ngửa trước khi làm trống bàng quang bằng cách xoa bóp vùng bụng. Ngay sau đó, 100 µl dung dịch xử lý thích hợp ở nồng độ 400 µg ml^-1 (Bàn 2) được đưa vào bàng quang bằng ống thông 24 gauge. Chất điều trị và chất (nước hoặc urê) vẫn còn trong bàng quang trong 1 giờ trước khi rút ống thông. Bàng quang được làm trống một lần nữa bằng cách xoa bóp bụng và những con chuột đã hồi phục sau khi được gây mê trong chuồng, thay thế mùn cưa trong lồng động vật 24 h sau khi điều trị để loại bỏ ô nhiễm phóng xạ.

Hiệu quả điều trị được xác định bằng MRI

Hai nghiên cứu MRI được thực hiện trên mỗi con chuột: (1) giữa ngày 7 và 14 sau khi cấy khối u để phân ngẫu nhiên động vật giữa các nhóm và đo khối lượng khối u ban đầu (tiền xử lý); (2) trong khoảng thời gian từ ngày 16 đến ngày 21 sau khi cấy ghép khối u (sau điều trị) để đánh giá hiệu quả điều trị. MRI được tiến hành bằng máy quét 7 T Bruker BioSpec và 11.7 T Bruker BioSpec (cả hai đều có phần mềm ParaVision 7), tùy thuộc vào tình trạng sẵn có. Điều này không ảnh hưởng đến kết quả vì trường bên ngoài không quan trọng đối với hình ảnh giải phẫu¹⁴. Các thí nghiệm hình ảnh được thực hiện bằng cách sử dụng các thông số và xử lý hình ảnh tương tự như đã giải thích ở trên (Theo dõi kích thước khối u). Trong trường hợp máy quét 11.7 T, thiết lập bao gồm một cuộn dây bề mặt tim chuột để thu và một cuộn thể tích để truyền. Khối lượng khối u trong mỗi lát cắt được xác định từ khối lượng quan tâm được vẽ thủ công trên khu vực khối u.

Phân tích thống kê

Trong nghiên cứu hình ảnh PET, tỷ lệ phần trăm liều tiêm (% ID) và liều tiêm trên thể tích khối u (% ID cm^-3) được so sánh bằng ANOVA một chiều. Sự khác biệt giữa các nhóm được xác định bằng phép thử so sánh nhiều lần của Tukey. NTV trong phần RNT được lấy từ một t-kiểm tra các giá trị chưa ghép đôi. Phân phối dữ liệu được coi là bình thường, nhưng điều này chưa được kiểm tra chính thức. Phân tích thống kê được thực hiện với GraphPad Prism v.8.

Tóm tắt báo cáo

Thông tin thêm về thiết kế nghiên cứu có sẵn trong Tóm tắt báo cáo danh mục đầu tư tự nhiên liên kết đến bài viết này.

• Phân phối nội dung và PR được hỗ trợ bởi SEO. Được khuếch đại ngay hôm nay.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. Trao quyền cho chính mình. Truy cập Tại đây.
• PlatoAiStream. Thông minh Web3. Kiến thức khuếch đại. Truy cập Tại đây.
• Trung tâmESG. Than đá, công nghệ sạch, Năng lượng, Môi trường Hệ mặt trời, Quản lý chất thải. Truy cập Tại đây.
• PlatoSức khỏe. Tình báo thử nghiệm lâm sàng và công nghệ sinh học. Truy cập Tại đây.
• nguồn: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01577-y