Tổng hợp và mô tả đặc tính của peptide, oligonucleotide và liên hợp peptide-oligonucleotide

Tất cả các peptide và oligonucleotide được tổng hợp và HPLC được tinh chế lần lượt bằng Công nghệ DNA Khoa học và Tích hợp (IDT) của CPC. Các liên hợp peptide-oligonucleotide được tạo ra bằng hóa học nhấp chuột không chứa đồng. Các liên hợp đã được tinh chế trên Agilent 1100 HPLC. Phân tích khối phổ của các liên hợp được thực hiện trên mô hình Bruker giải hấp/ion hóa laser hỗ trợ ma trận MicroFlex–thời gian của phép đo phổ chuyến bay. Trình tự của tất cả các phân tử được sử dụng được liệt kê trong Bảng bổ trợ 1 và 3.

Xét nghiệm phân tách huỳnh quang Cas12a

lbaCas12a (nồng độ cuối cùng, 100 nM; New England Biolabs (NEB)) được ủ với 1× NEB Buffer 2.1, crRNA (250 nM; IDT) và các chất kích hoạt DNA bổ sung (4 nM trừ khi được mô tả cụ thể, trong dung dịch hoặc thêm vào nước tiểu; IDT ) hoặc mẫu nước tiểu được thu thập từ động vật thí nghiệm, trong phản ứng 50 μl ở 37°C trong 30 phút. Các phản ứng được pha loãng theo hệ số 4 thành 1× NEB Buffer 2.1 và ssDNA T₁₀ Chất nền phóng thích FQ (30 pmol; IDT) vào thể tích phản ứng 60 μl mỗi giếng và chạy ba lần. lbaQuá trình kích hoạt Cas12a được phát hiện ở 37°C cứ sau 2 phút trong 3 giờ bằng cách đo huỳnh quang bằng đầu đọc bản Tecan Infinite Pro M200 (λ_ex = 485nm, λ_em = 535nm). Trình tự của tất cả các oligonucleotide được liệt kê trong Bảng bổ sung 1. Huỳnh quang cho các điều kiện nền (không có đầu vào trình kích hoạt DNA hoặc không có điều kiện crRNA) được sử dụng làm đối chứng âm. Hoạt tính Cas12a ssDNase được tính toán từ đường cong động học do đầu đọc đĩa tạo ra (sự phát huỳnh quang của đầu dò tổng hợp theo thời gian). Vận tốc phản ứng ban đầu (V₀) tương ứng với độ dốc của pha tuyến tính của đường cong động học (8–10 điểm thời gian ban đầu). Phân tích được thực hiện bằng Python v.3.9.

Xét nghiệm phân cắt Cas12a với chỉ số dòng chảy bên

Các mẫu được ủ trong 30 phút ở 37°C như trong thử nghiệm kích hoạt Cas12a được mô tả ở trên. Các phản ứng sau đó được pha loãng theo hệ số 4 thành 1× NEB Buffer 2.1 và ssDNA T₁₀ Chất nền phóng thích biotin FAM–biotin (1 pmol; IDT) vào thể tích phản ứng 100 µl và ủ ở 37°C trong 1–3 giờ. HybriDetect 1 dải dòng chảy bên được nhúng vào dung dịch (20 μl mẫu với 80 μl dung dịch đệm Milenia Hybridetect). Cường độ của các dải được định lượng trong ImageJ v.1.49.

Đặc tính của nồng độ hoặc độ dài của chất kích hoạt DNA đối với hoạt động Cas12a ssDNase

Để xác định độ dài tối ưu để phát hiện bằng Cas12a, chúng tôi đã thử nghiệm độ dài của trình kích hoạt DNA tự nhiên bị cắt ngắn và đã sửa đổi từ 10 đến 34 nt. Để xác định độ mạnh in vivo, các chất kích hoạt DNA biến đổi phosphorothioate có độ dài khác nhau đã được tiêm ở 1nmol vào chuột BALB/c và các mẫu nước tiểu được thu thập 1 giờ sau khi tiêm. Các mẫu nước tiểu được sử dụng làm chất kích hoạt DNA trong xét nghiệm phân tách huỳnh quang Cas12a. Hoạt động Cas12a ssDNase được kích hoạt bởi mỗi trình kích hoạt DNA đã được chuẩn hóa thành hoạt động của trình kích hoạt DNA đã sửa đổi 24-mer.

Phát hiện chất lỏng và phân tích dữ liệu

Các phản ứng phát hiện Cas12 được tạo thành hai hỗn hợp riêng biệt, hỗn hợp xét nghiệm và hỗn hợp mẫu, để nạp vào mạch chất lỏng tích hợp Biểu hiện gen vi lỏng (GE) 96.96 (IFC) (Fluidigm): hỗn hợp xét nghiệm chứa 10 μM lbaCas12a (NEB), 1× Thuốc thử tải xét nghiệm (Fluidigm), 1× NEB Buffer 2.1 và 1 μM crRNA cho tổng thể tích 16 μl mỗi phản ứng. Hỗn hợp mẫu chứa chất ức chế RNase 25.2 U (NEB), 1× NEBuffer 2.1, 1× ROX Reference Dye (Invitrogen), 1× Thuốc thử nạp mẫu GE (Fluidigm), 9 mM MgCl₂ và trình báo DNA huỳnh quang tổng hợp được dập tắt 500 nM (FAM–T₁₀–3IABkFQ, IDT) với tổng thể tích là 12.6 μl. Sau đó, ống tiêm và 4 μl hỗn hợp xét nghiệm hoặc mẫu được nạp vào các vị trí tương ứng của chúng trên GE 96.96 IFC vi lỏng và được chạy theo hướng dẫn của nhà sản xuất. IFC đã được tải lên Juno (Fluidigm) nơi tập lệnh 'Load Mix' được chạy. Sau khi tải IFC thích hợp, hình ảnh được thu thập trong khoảng thời gian 3 giờ bằng giao thức tùy chỉnh trên Biomark HD.

Để phân tích dữ liệu do hệ thống Fluidigm tạo ra, chúng tôi đã vẽ sơ đồ huỳnh quang trừ nền chuẩn hóa tham chiếu cho các cặp mục tiêu hướng dẫn. Đối với một cặp hướng dẫn-mục tiêu (tại một thời điểm nhất định, tvà nồng độ mục tiêu), trước tiên chúng tôi tính giá trị chuẩn hóa tham chiếu là (trung vị (P_t - P₀) / (R_t - R₀)) ở đâu P_t là tín hiệu hướng dẫn (FAM) tại thời điểm, P₀ là phép đo nền của nó trước phản ứng, R_t là tín hiệu tham chiếu (ROX) tại thời điểm, R₀ là phép đo nền của nó và giá trị trung bình được thực hiện trên các lần lặp lại. Dữ liệu được hiển thị bằng Python 3, R 4 và Prism 9.

Nhân bản vô tính và biểu hiện các nanobody tái tổ hợp

Các đoạn gen gBlocks sợi đôi mã hóa vật thể nano quan tâm với các vị trí hạn chế NcoI và BlpI ở sườn đã được đặt hàng từ IDT. Các đoạn gen được sao chép vào vec tơ biểu hiện Novogen pET-28a(+) tại các vị trí giới hạn NcoI và BlpI và được biến đổi thành SHuffle T7 có khả năng Escerichia coli (NEB). Các khuẩn lạc vi khuẩn mã hóa các phần chèn gen chính xác đã được xác nhận bằng trình tự Sanger. Để sản xuất protein tái tổ hợp tiếp theo, 500 ml môi trường nuôi cấy thứ cấp SHuffle T7 có khả năng E. coli. mã hóa gen thể nano quan tâm được nuôi cấy trong canh thang LB có bổ sung kanamycin ở 37°C từ môi trường nuôi cấy sơ cấp 3 ml qua đêm cho đến khi mật độ quang học ở bước sóng 600 nm (OD600) đạt khoảng 0.6–0.8. Biểu hiện nanobody sau đó được tạo ra với việc bổ sung isopropyl-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (nồng độ cuối cùng 0.4 mM). Nuôi cấy được ủ ở 27 ° C trong 24 giờ. Viên vi khuẩn được ly giải bằng thuốc thử chiết xuất protein vi khuẩn hoàn chỉnh B-PER (Thermo Fisher Khoa học), sau đó được tinh chế bằng sắc ký ái lực kim loại cố định tiêu chuẩn (IMAC) với Ni-NTA agarose (Qiagen). Sản phẩm nanobody đã được xác nhận thông qua phân tích điện di trên gel polyacrylamide SDS. Trình tự các nanobody được sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê trong Bảng bổ trợ 3.

Tổng hợp dấu ấn sinh học nước tiểu tổng hợp được mã hóa DNA với lõi nanobody

Nanobody (2 mg) được ủ ở nhiệt độ phòng qua đêm trong gel khử TCEP disulfide cố định (7.5% v/v) (Thermo Fisher Khoa học) để giảm có chọn lọc cysteine ​​ở đầu C theo một giao thức đã thiết lập trước đó³⁷. Cysteine ​​ở đầu C đã khử (1 đương lượng) được phản ứng với chất liên kết ngang sulfo DBCO-maleimide (4 đương lượng) (Click Chemistry Tools) trong PBS (pH 6.5, 1 mM EDTA) ở nhiệt độ phòng trong 6 giờ, sau đó chất liên kết ngang dư thừa đã được loại bỏ bằng cột khử muối PD-10 dùng một lần (GE Healthcare Bio-Science). Các nanobody có chức năng DBCO đã được tinh chế thêm bằng sắc ký lỏng protein nhanh ÄKTA (GE Health). Sự kết hợp trình báo DNA được thực hiện bằng cách ủ vật thể nano có chức năng DBCO (1 đương lượng) với trình báo DNA có chức năng azide (tương đương 1.1) trong PBS (pH 7.4) ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Trình báo cáo DNA dư thừa đã được loại bỏ thông qua sắc ký loại trừ kích thước. Sản phẩm đã được xác nhận thông qua phân tích điện di trên gel SDS–polyacrylamide và được định lượng bằng Bộ xét nghiệm ssDNA Quant-iT OliGreen. Trình tự các dấu ấn sinh học nước tiểu tổng hợp được mã hóa DNA được sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê trong Bảng bổ sung 4.

Tổng hợp các dấu ấn sinh học nước tiểu tổng hợp được mã hóa DNA với lõi polyme

PEG đa hóa trị (40 kDa, tám nhánh) chứa các tay cầm phản ứng với maleimide (Công nghệ JenKem) được hòa tan trong dung dịch đệm phốt phát 100 mM (pH 7.0) và được lọc (kích thước lỗ, 0.2 μm). Sau khi lọc, các liên hợp DNA peptide-kết thúc cysteine ​​​​được thêm vào với lượng mol vượt quá 2 lần vào PEG và phản ứng trong ít nhất 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Các phân tử không liên hợp được phân tách bằng sắc ký loại trừ kích thước với cột Superdex 200 Tăng 10/300 GL trên máy sắc ký lỏng protein nhanh ÄKTA (GE Healthcare). Các cảm biến nano tinh khiết được cô đặc bằng các bộ lọc spin (ngưỡng trọng lượng phân tử, 10 kDa; Millipore) và được định lượng bằng Bộ xét nghiệm ssDNA Quant-iT OliGreen (Thermo Fisher Khoa học). Huỳnh quang được đọc trên đầu đọc tấm Tecan Infinite Pro M200 Quant-iT tại λ_ex = 485nm, λ_em = 535nm. Các hạt được lưu trữ ở 4 ° C trong PBS. Sự tán xạ ánh sáng động (Zeta Sizer Nanoseries, Dụng cụ Malvern) đã được sử dụng để mô tả đường kính thủy động lực học của các hạt nano. Trình tự các dấu ấn sinh học tổng hợp trong nước tiểu được mã hóa DNA được liệt kê trong Bảng bổ sung 4.

Kính hiển vi điện tử truyền qua đông lạnh

Các DNA-SUB dựa trên lõi polyme 5 plex được gộp lại và cô đặc thành 0.5 mg ml^-1 bằng nồng độ DNA. Các mẫu được nạp trên một lưới đồng có ren được phủ một lớp màng carbon liên tục. Sau đó, lưới được gắn trên thiết bị giữ lạnh nghiêng đơn Gatan 626 được đặt trong cột kính hiển vi điện tử truyền qua. Các mẫu được làm lạnh bằng nitơ lỏng và giữ lạnh trong quá trình chuyển vào kính hiển vi (kính hiển vi JEOL 2100 FEG đặt ở 200 kV; độ phóng đại, 10,000–60,000). Tất cả các hình ảnh được ghi lại bằng máy ảnh thiết bị kết hợp sạc Gatan 2kx2k UltraScan.

Phân tích phiên mã và proteomic

Dữ liệu RNA-Seq của ung thư biểu mô tuyến đại tràng ở người được tạo bởi Mạng nghiên cứu bản đồ bộ gen ung thư (http://cancergenome.nih.gov). Các phân tích biểu thức khác biệt được thực hiện với DESeq2 1.10.1. Dữ liệu proteomic về thành phần của ma trận ngoại bào trong ung thư ruột kết ở người và các mô ruột kết bình thường thu được bằng phân tích khối phổ của các thành phần ma trận ngoại bào và có sẵn từ Matrisome (http://matrisomeproject.mit.edu/).

Nuôi cấy tế bào

Dòng tế bào chuột MC26-LucF (mang luciferase của đom đóm, từ Phòng thí nghiệm Kenneth K. Tanabe, Bệnh viện Đa khoa Massachusetts) được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Gibco) được bổ sung 10% (v/v) huyết thanh bào thai bò (Gibco), 1% ( v/v) penicillin/streptomycin (CellGro) ở 37°C và trong 5% CO₂. Các dòng tế bào người PC-3 (ATCC CRL-1435) được nuôi cấy trong RPMI1640 (Gibco) được bổ sung 10% (v/v) huyết thanh bào thai bò và 1% (v/v) penicillin/streptomycin. Các tế bào RWPE1 (ATCC CRL-11609) được nuôi cấy trong môi trường không có huyết thanh tế bào sừng (Gibco) được bổ sung 2.5 µg yếu tố tăng trưởng biểu bì tái tổ hợp ở người và 25 mg chiết xuất tuyến yên của bò. Tất cả các dòng tế bào được xét nghiệm âm tính với nhiễm mycoplasma.

Mô hình động vật

Tất cả các nghiên cứu trên động vật đã được phê duyệt bởi ủy ban chăm sóc động vật của Viện Công nghệ Massachusetts (MIT) (giao thức MIT 0420-023-23 và 0220-010-23). Tất cả các thí nghiệm được tiến hành tuân thủ các hướng dẫn của tổ chức và quốc gia và được giám sát bởi Phòng Y học So sánh (DCM) của nhân viên MIT.

BALB/c cái (BALB/cAnNTac, 6–8 tuần tuổi; Taconic Bioscatics), NCr cái khỏa thân (CrTac:NCr-Foxn1^nu, 4–5 tuần tuổi, Taconic Bioscatics), nam và nữ Krasn^LSL−G12D/+;TRP53^{fl / fl} Chuột C57L/B6 (KP) (8–16 tuần tuổi; quà tặng từ Phòng thí nghiệm Tyler Jacks, MIT) đã được sử dụng cho các thí nghiệm. Chuột được duy trì trong cơ sở động vật của Viện Ung thư Koch, với chu kỳ 12 giờ sáng/12 giờ tối (07:00–19:00), ở ~18–23 °C và độ ẩm ~50%. Nước hấp tiệt trùng và chế độ ăn chow tiêu chuẩn luôn sẵn có. Chuột khỏa thân NCr được nhốt trong phòng chỉ dành cho người suy giảm miễn dịch, trong lồng hấp tiệt trùng và giường giấy và được xử lý bằng kỹ thuật vô trùng. Tình trạng sức khỏe của chuột được kiểm tra hàng tuần và hàng ngày khi khối u có đường kính > 5 mm. Chuột đã được tiêu hóa theo tiêu chí của bác sĩ thú y (ví dụ: kích thước khối u> 1 cm, tình trạng cơ thể kém). Chúng tôi đã sử dụng cỡ mẫu ít nhất ba con chuột cho mỗi nhóm. Quy mô nhóm lớn hơn hoặc bằng năm khi so sánh các mức mã vạch tiết niệu (hai mặt t-test, α đặt ở mức 0.05). Những người bạn cùng giới được phân ngẫu nhiên vào các nhóm thử nghiệm và kiểm soát.

Để thiết lập các khối u phổi CRC, chuột cái BALB/c được tiêm vào tĩnh mạch dòng tế bào MC26-Fluc biểu hiện luciferase (100,000 tế bào trên mỗi con chuột). Sự tiến triển của khối u được theo dõi hàng tuần bằng hệ thống hình ảnh IVIS (PerkinElmer) và được định lượng trên Living Image (PerkinElmer). Để thiết lập mô hình xenograft PCa, những con chuột cái khỏa thân NCr đã được tiêm các dòng tế bào PC-3 của con người (5 triệu tế bào trên mỗi sườn, 2 sườn trên mỗi con chuột) trong khi gây mê bằng isoflurane. Các tế bào đã được chuẩn bị trong Ma trận màng 30% Corning Matrigel (Thermo Fisher Khoa học) và môi trường huyết thanh thấp (Opti-MEM, Gibco). Các khối u được đo hàng tuần và các thí nghiệm được tiến hành khi các khối u ở sườn đạt chiều dài hoặc chiều rộng khoảng 5 mm (~200 mm³) hoặc 3 tuần sau khi cấy. Thể tích khối u được tính bằng thước đo chiều dài và chiều rộng của sườn; tính thể tích theo phương trình f_x = (chiều rộng² × chiều dài)/2, trong đó chiều dài là đoạn dài hơn.

Để tạo ra các khối u phổi autochthonous, trước tiên chúng tôi tạo ra Krasn^LSL−G12D/+;TRP53^{fl / fl} Chuột C57L/B6 (KP)^42,43 trong đó việc kích hoạt một alen gây ung thư của KRAS là đủ để bắt đầu quá trình hình thành khối u, và việc xóa bổ sung hoặc đột biến điểm của trp53 tăng cường đáng kể sự tiến triển của khối u, dẫn đến sự phát triển nhanh hơn của ung thư biểu mô tuyến có các đặc điểm của bệnh tiến triển hơn. Các khối u phổi được bắt đầu bằng cách sử dụng 50 μl adenovirus-SPC-Cre (2.5 × 10) trong khí quản.⁸ các đơn vị hình thành mảng bám trong Opti-MEM với 10 mM canxi clorua ở chuột KP đực hoặc cái trong độ tuổi từ 8 đến 16 tuần) khi gây mê bằng isoflurane. Các đoàn hệ đối chứng bao gồm những con chuột phù hợp với độ tuổi và giới tính cũng trải qua việc sử dụng AdenoCre trong khí quản. Chuột KP được duy trì mà không cần can thiệp thêm để cho phép khối u phát triển cho đến khi các thí nghiệm được thực hiện.

Phân tích xét nghiệm phân tách Cas12a được kích hoạt bằng mã vạch DNA trong nước tiểu

ssDNA (1nmol), cảm biến PEG mã vạch DNA 5 lớp (0.2nmol mỗi cái, tổng cộng 1nmol theo nồng độ mã vạch DNA) hoặc cảm biến thể nano được mã hóa DNA (1nmol theo nồng độ mã vạch DNA) được tiêm vào tĩnh mạch chuột thí nghiệm. Các mẫu nước tiểu (100–200 μl mỗi con chuột) được thu thập vào lúc 12:00 mỗi ngày, 1 giờ sau khi tiêm DNA hoặc cảm biến và được thử nghiệm kích hoạt Cas12a để xác định tốc độ phản ứng ban đầu (V₀). Chuẩn hóa trung bình đã được thực hiện trên V₀ các giá trị để giải thích cho sự thay đổi giữa động vật với động vật trong nồng độ nước tiểu. Trong thử nghiệm phân cắt Cas12a sử dụng phóng huỳnh quang, y trục đại diện cho giá trị trung bình chuẩn hóa V_{0_động vật mang khối u}/ nghĩa là bình thường hóa V_{0_điều khiển động vật}. Sau đó, mẫu nước tiểu tương tự được sử dụng để thực hiện xét nghiệm phân cắt Cas12a với chỉ số LFA. Các dải giấy thu được được căn chỉnh và quét đồng thời. Cường độ băng tần được định lượng bằng ImageJ v.1.49v.

Nghiên cứu phân phối sinh học và dược động học

Các tác nhân được đánh dấu bằng thuốc nhuộm cận hồng ngoại đã được sử dụng để giảm thiểu nhiễu từ nền huỳnh quang tự động trong cơ thể. Chuột BALB/c được tiêm tĩnh mạch các phân tử DNA tự nhiên hoặc biến đổi có gắn nhãn Cy5 (1nmol) và các mẫu nước tiểu được thu thập sau 30 phút và 1, 2, 3, 4 giờ sau khi tiêm. Các thể liên hợp nanobody–DNA được ghép với este sulfo-Cyanine7 NHS (Lumiprobe, 2 chất nhuộm tương đương của protein), phản ứng qua đêm, tinh chế bằng cách lọc quay và tiêm tĩnh mạch vào chuột trần mang khối u PC-3. Sau 24 giờ, những con chuột đã được tiêu hóa và tiến hành khám nghiệm tử thi để loại bỏ các khối u, phổi, tim, thận, gan và lá lách. Nước tiểu, máu và các cơ quan được quét bằng hệ thống hình ảnh IVIS và Odyssey CLx (LI-COR). Huỳnh quang nội tạng được định lượng bằng ImageStudio trong Odyssey CLx. Động học tuần hoàn máu được theo dõi ở chuột BALB/c bằng cách lấy máu nối tiếp sau 10 phút, 30 phút, 2 giờ và 3 giờ sau khi tiêm tĩnh mạch DNA hoặc PEG đánh dấu Cy5 ở mức 1nmol thuốc nhuộm trên mỗi con chuột. Máu để đo dược động học được thu thập bằng cách sử dụng chảy máu vô ích ở đuôi. Máu được pha loãng trong PBS với 5 mM EDTA để ngăn đông máu, ly tâm trong 5 phút ở 5,000gvà nồng độ chất phóng xạ huỳnh quang được định lượng trong các đĩa 384 giếng so với các tiêu chuẩn trên Odyssey CLx.

Nghiên cứu mô học, hóa mô miễn dịch và miễn dịch huỳnh quang

Các mô nhúng parafin được bảo quản trong 4% paraformaldehyd qua đêm và được bảo quản trong 70% ethanol trước khi nhúng vào parafin. Các mô đông lạnh nhanh được bảo quản trong 2% paraformaldehyde trong 2 giờ, được bảo quản trong 30% sucrose qua đêm và đông lạnh trong hợp chất có nhiệt độ cắt tối ưu (OCT) ở -80 °C. Phổi đông lạnh nhanh được xử lý thông qua tiêm nội khí quản 50:50 OCT trong PBS ngay sau khi con vật bị chết do dùng quá liều isoflurane. Phổi được đông lạnh từ từ bằng cách nhúng OCT vào dung dịch isopentane/nitơ lỏng. Các mẫu được cắt thành các lát 6 µm. Đối với các nghiên cứu hóa mô miễn dịch, các phiến kính được nhuộm bằng kháng thể chính theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sau đó là HRP-Polymer Rabbit-on-Rodent được sử dụng như đã nhận (Biocare Medical). Đối với các nghiên cứu miễn dịch huỳnh quang, sau khi ngăn chặn bằng huyết thanh dê 5%, 2% BSA và 0.1% Triton X-100 trong PBS trong 1 giờ, các phần được nhuộm bằng kháng thể sơ cấp trong 1% BSA trong PBS qua đêm ở 4°C. Kháng thể thứ cấp liên hợp Alexa Fluor được ủ ở mức 1 μg ml^-1 trong 1% BSA trong PBS trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Các slide được niêm phong bằng ProLong Antifade Mountant (Thermo Fisher Khoa học), đồng thời được số hóa và phân tích bằng máy quét slide công suất cao 3D Histech P250 (PerkinElmer). Độc tính mô học được đánh giá bởi một nhà nghiên cứu bệnh học thú y, người đã bị mù với các nhóm điều trị. Các kháng thể chính và pha loãng được sử dụng được liệt kê trong Bảng bổ sung 5.

Chiết RNA và phản ứng chuỗi polymerase định lượng thời gian thực

Các tế bào PC-3 và RWPE1 được nuôi cấy và thu thập sau khi thử. Các mẫu mô được thu thập bằng cách khám nghiệm tử thi sau khi chuột đã được tiêu hóa và ngay lập tức được giữ trong Thuốc thử ổn định RNA RNAlater (Qiagen). RNA từ các viên tế bào hoặc mẫu mô đông lạnh đã được chiết xuất bằng RNeasy Mini Kit (Qiagen). RNA được phiên mã ngược thành cDNA bằng cách sử dụng Siêu hỗn hợp phiên mã ngược Bio-Rad iScript trên Bio-Rad iCycler. Độ khuếch đại phản ứng chuỗi polymerase định lượng của cDNA đã được đo sau khi trộn với các đầu dò biểu hiện gen Taqman và Hệ sinh học ứng dụng TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Khoa học) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phản ứng chuỗi polymerase định lượng được thực hiện trên Máy luân chuyển nhiệt C96 của hệ thống thời gian thực Bio-Rad CFX1000.

Cơ chất protease tái tổ hợp và xét nghiệm phân tách protein lysate mô

Cơ chất protease fluorogen có huỳnh quang (FAM) và chất khử (CPQ2) được tổng hợp bởi CPC Scientific. Protease tái tổ hợp được mua từ Enzo Life Science và R&D Systems. Các mẫu mô được đồng nhất hóa trong PBS và ly tâm ở 4°C trong 5 phút ở 6,000g. Supernatant được tiếp tục ly tâm ở 14,000g trong 25 phút ở 4°C. Nồng độ protein được đo bằng Bộ xét nghiệm protein Thermo Fisher BCA và được chuẩn bị ở mức 2 mg ml^-1. Các thử nghiệm được thực hiện trong các đĩa 384 giếng, ba lần trong dung dịch đệm đặc hiệu với enzyme có peptit (1 µM) và protease (40 nM đối với xét nghiệm protease tái tổ hợp)/dung dịch ly giải tế bào (0.33 mg ml^-1 đối với xét nghiệm ly giải mô) trong 30 µl ở 37°C. Huỳnh quang được đo tại λ_ex = 485nm, λ_em = 535 nm trên đầu đọc vi bản Tecan Infinite 200pro. Enzyme và điều kiện đệm được liệt kê trong Bảng bổ sung 6.

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme PSA

Khoảng 200 μl máu được thu thập từ tĩnh mạch hiển bên của động vật thí nghiệm và các tế bào máu được tạo thành viên ngay lập tức bằng cách ly tâm ở 14,000g trong 25 phút ở 4°C. Huyết tương được bảo quản ở −80 ° C trước khi định lượng PSA. Các mức PSA được đo bằng cách sử dụng bộ ELISA PSA Quantikine theo các giao thức của nhà sản xuất (Hệ thống R&D).

Phân tích thống kê và khả năng tái sản xuất

Các phân tích thống kê được thực hiện trong GraphPad Prism 9. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng phương tiện với sem. Cụ thể, các nhóm dữ liệu lần đầu tiên được kiểm tra tính quy tắc bằng kiểm tra tính quy tắc Kolmogorov–Smirnov với kiểm tra Dallal–Wilkinson–Lillie cho P giá trị. Kết quả sau đó đã được kiểm tra về ý nghĩa thống kê bằng cách ghép đôi hai đuôi t-test (tham số) để so sánh hai nhóm và phân tích phương sai để so sánh nhiều nhóm. Các phân tích phi tham số được thực hiện bằng thử nghiệm MannTHER Whitney hai đuôi chưa ghép cặp. Kích thước mẫu và kiểm tra thống kê được chỉ định trong truyền thuyết hình. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại độc lập ít nhất hai lần với kết quả tương tự. Lưu ý rằng các thí nghiệm đã được lặp lại và hiển thị trực quan bởi hai nhà nghiên cứu độc lập khi kết quả từ các thí nghiệm đại diện (chẳng hạn như vi ảnh mô học hoặc huỳnh quang) được hiển thị.

Tóm tắt báo cáo

Thông tin thêm về thiết kế nghiên cứu có sẵn trong Tóm tắt báo cáo danh mục đầu tư tự nhiên liên kết đến bài viết này.

• Phân phối nội dung và PR được hỗ trợ bởi SEO. Được khuếch đại ngay hôm nay.
• Platoblockchain. Web3 Metaverse Intelligence. Khuếch đại kiến ​​thức. Truy cập Tại đây.
• Đúc kết tương lai với Adryenn Ashley. Truy cập Tại đây.
• nguồn: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01372-9