Materiaalvoorbereiding en karakterisering

Een waterige GO-oplossing werd verdund in gedeïoniseerd water om een ​​hoeveelheid van 0.15 mg ml te verkrijgen.^-1 oplossing en vacuüm gefilterd door een nitrocellulosemembraan met poriën van 0.025 µm, waardoor een dunne film GO ontstaat. De dunne film werd vervolgens overgebracht naar het doelsubstraat met behulp van natte overdracht in gedeïoniseerd water en verder thermisch uitgloeien bij 100 ° C gedurende 2 minuten. De GO-film-substraatstapel werd gedurende 134 uur hydrothermisch gereduceerd bij 3 ° C in een standaard autoclaaf om EGNITE te vormen. Het basissubstraat voor alle karakteriseringsstudies van EGNITE was een vierkant (1 × 1 cm²) van Si/SiO₂ (400 µm/1 µm).

XPS

XPS-metingen werden uitgevoerd met een Phoibos 150-analysator (SPECS) in ultrahoogvacuümomstandigheden (basisdruk, 5 × 10^-10 mbar) met een monochromatische Al Ka-röntgenbron (1,486.74 eV). Overzichtsspectra werden verkregen met een doorgangsenergie van 50 eV en een stapgrootte van 1 eV en spectra met hoge resolutie werden verkregen met een doorgangsenergie van 20 eV en een stapgrootte van 0.05 eV. De algehele resolutie in deze laatste omstandigheden is 0.58 eV, zoals bepaald door het meten van de volledige breedte op het halve maximum van de Ag 3d5/2 piek van gesputterd zilver. De XPS-analyse laat een sterke afname zien na de hydrothermische behandeling van de C–O-piek (geassocieerd met epoxidegroepen), maar een kleine bijdrage van C–OH, C=O en C(O)OH als gevolg van hydroxylen, carbonylen en carboxylen die blijven na reductie. De deconvolutie van de O1s piek bevestigt dergelijk gedrag. De belangrijkste bijdrage aan de C1s signaal na de hydrothermische reductie komt echter vandaan sp² gehybridiseerde C-C-orbitalen^34,57.

Röntgendiffractie

Röntgendiffractiemetingen (θ-2θ scan) werden uitgevoerd in een Materials Research Diffractometer (Malvern PANalytical). Deze diffractometer heeft een horizontaal ω-2θ goniometer (320 mm straal) in een viercirkelgeometrie en werkte met een keramische röntgenbuis met Cu Ka-anode (λ = 1.540598 Å). De gebruikte detector is een Pixcel, een snelle röntgendetector gebaseerd op Medipix2-technologie.

Raman spectroscopie

Raman-spectroscopiemetingen werden uitgevoerd met behulp van een Witec-spectrograaf uitgerust met een laserexcitatielijn van 488 nm. Voor de metingen werden Raman-spectra verkregen met behulp van een 50x objectief en een rooster van 600 groeven per nm; het laservermogen werd onder de 1.5 mW gehouden om verwarming van het monster te voorkomen.

TEM

Een gefocusseerde ionenbundellamel werd vervaardigd met een Helios NanoLab DualBeam (LMA-INA) voor de dwarsdoorsnedestudie van het EGNITE-monster. Structurele analyses werden uitgevoerd met behulp van TEM met behulp van een Tecnai F20-microscoop die werkte bij 200 kV, inclusief HRTEM en ringvormige donkerveld-STEM-technieken met hoge hoek. Het STEM-EELS-experiment werd uitgevoerd in een Tecnai F20-microscoop die werkte bij 200 KeV, met een opening van 5 mm, een cameralengte van 30 mm, een convergentiehoek van 12.7 mrad en een verzamelhoek van 87.6 mrad. Omdat we 0.5 eV per pixel en 250 eV als startenergie gebruikten bij de acquisitie van kernverlies, verkregen we niet de verwachte Si K-rand bij 1,839 eV, de Pt M-rand bij 2,122 eV en de Au M-rand bij 2,206 eV. De relatieve atomaire samenstelling van C – O is verkregen door onze aandacht te richten op de gereduceerde GO-laag en aan te nemen dat de geanalyseerde randen (C en O in ons geval) optellen tot 100%. Deze veronderstelling is in ons geval geldig, zoals blijkt uit de Aanvullende informatie kaarten. De dwarsdoorsnede van het energieverschil werd berekend met behulp van het Hartree-Slater-model en de achtergrond met behulp van een power-low-model.

Elektrische geleiding

Metingen van de elektrische geleidbaarheid werden uitgevoerd met behulp van een Keithley 2400-bronmeter in tweepuntsconfiguratie. De gemeten monsters bestonden uit EGNITE-films van 1 x 1 cm² bovenop een SiO₂ substraat.

Data-analyse

Röntgendiffractie-, Raman- en XPS-gegevens werden geanalyseerd met behulp van Python 3.7-pakketten (Numpy, Pandas, Scipy, Xrdtools, Lmfit, Rampy, Peakutils, Matplotlib). De afstand tussen vlakken werd berekend uit de röntgendiffractiemetingen volgens de wet van Snell. Nadat de gegevens naar het ruimtelijke domein waren verplaatst, werd het maximum van de pieken aangepast. De overeenkomstige afstand gaf een gemiddelde waarde van de afstand tussen vlakken. Afwijkingen van deze gemiddelde waarden werden berekend op basis van de volledige breedte op het halve maximum van de Lorentziaanse fittingen van de pieken op het ruimtelijke domein. XPS- en Raman-spectroscopiemetingen werden geanalyseerd door een convolutie van pieken op verwachte locaties voor de overeenkomstige kenmerken aan te brengen. De geleidbaarheidswaarden van de GO en EGNITE zijn verkregen door het aanbrengen van de I-V curven gemeten bij de elektrische geleidbaarheidsmetingen volgens de wet van Ohm. Gegevens zijn n = 1 voor elke meting.

Flexibele array-fabricage

De fabricage van de apparaten wordt getoond in aanvullende figuur 2. 4. Apparaten werden vervaardigd op 4 inch Si/SiO₂ (400 μm/1 μm) wafeltjes. Eerst werd een 10 µm dikke laag PI (PI-2611, HD MicroSystems) door spincoating op de wafer aangebracht en gedurende 350 minuten bij 30°C gebakken in een stikstofrijke atmosfeer. Metaalsporen werden van een patroon voorzien met behulp van optische lithografie van de beeldomkeerfotoresist (AZ5214, Microchemicals). Er werd gebruik gemaakt van elektronenbundelverdamping om 20 nm titanium en 200 nm goud af te zetten en er werd een lift-off uitgevoerd. We gebruikten een EGNITE-film met een dikte van ongeveer 1 μm als afweging tussen elektrochemische prestaties en array-flexibiliteit. Na het overbrengen van de GO-film werd aluminium met een elektronische straal verdampt en werden gebieden bovenop de toekomstige micro-elektroden gedefinieerd met behulp van een negatieve fotoresist (nLOF 2070, Microchemicals) en opgetild. Vervolgens werd de GO-film overal geëtst, behalve de toekomstige micro-elektroden, met behulp van zuurstofreactief ionenetsen (RIE) gedurende 5 minuten bij 500 W en werden de beschermende aluminiumkolommen geëtst met een verdunde oplossing van fosfor- en salpeterzuren. Vervolgens werd een 3 µm dikke laag PI-2611 op de wafel afgezet en gebakken zoals eerder beschreven. PI-2611-openingen op de micro-elektrode werden vervolgens gedefinieerd met behulp van een positieve dikke fotoresist (AZ9260, Microchemicals) die fungeerde als masker voor een daaropvolgende zuurstof-RIE. Later werden de apparaten op de PI-laag van een patroon voorzien, opnieuw met behulp van AZ9260-fotoresist en RIE. De fotoresistlaag werd vervolgens verwijderd in aceton en de wafel werd gereinigd in isopropylalcohol en gedroogd. Ten slotte werden de apparaten van de wafer gehaald en waren ze klaar om in sterilisatiezakken te worden geplaatst om gedurende 134 uur hydrothermisch te worden behandeld bij 3 ° C in een standaard autoclaaf.

Elektrochemische karakterisering van micro-elektroden

Elektrochemische karakterisering van de micro-elektroden werd uitgevoerd met een Metrohm Autolab PGSTAT128N potentiostaat in 1 x PBS (Sigma-Aldrich, P4417) met 10 mM fosfaatbuffer, 137 mM NaCl en 2.7 mM KCl bij pH 7.4 en met behulp van een configuratie met drie elektroden. Een Ag/AgCl-elektrode (FlexRef, WPI) werd gebruikt als referentie en een platinadraad (Alfa Aesar, 45093) werd gebruikt als tegenelektrode.

Voorafgaand aan de prestatie-evaluatie werden de elektroden gepulseerd met 10,000 ladingsgebalanceerde pulsen (1 ms, 15 µA). Blootstelling van elektroden aan continue pulserende protocollen, gevolgd door 100 cyclische voltammetriecycli (−0.9 tot +0.8 V) bij 50 mV s^-1, 20 herhalingen van 5,000 pulsen (1 ms) en herbepaling van het nullastpotentieel.

Data-analyse

Elektrochemische karakteriseringsgegevens werden geanalyseerd met behulp van Python 3.7-pakketten (Numpy, Pandas, Scipy, Pyeis, Lmfit, Matplotlib). Impedantiespectroscopiegegevens werden aangepast aan een equivalent elektrisch model bestaande uit een weerstand (R) in serie met een constant fase-element (CPE). Van daaruit werd de CPE-waarde benaderd tot een capaciteit en gedeeld door het geometrische gebied van de micro-elektrode om een ​​equivalente waarde te verkrijgen voor de grensvlakcapaciteit van EGNITE. Ladingopslagcapaciteit (CSC) van de micro-elektrode werd berekend op basis van cyclische voltammetriemetingen door de kathodische en anodische regimes van de gemeten stroom te integreren en te normaliseren door de scansnelheid. De kathodische en anodische ladingopslagcapaciteit (cCSC en aCSC) bij een scansnelheid van 100 mV van EGNITE zijn 45.9 ± 2.4 en 34.6 ± 2.8 mC cm^-2, respectievelijk (n = 3). Zoals gerapporteerd voor andere materialen⁵⁸, de verkregen CSC's zijn afhankelijk van de scansnelheid (aanvullende figuur 2). 5). Om de aanwezigheid van zuurstofreductiereacties te beoordelen, hebben we de CV-golfvorm gemeten onder met stikstof gespoelde elektrolyt⁵⁹ en observeerde geen substantiële verschillen in golfvorm (aanvullende figuur 1). 6). Onze resultaten gaan echter niet volledig in op de impact van zuurstofreductiereacties op de ladingsinjectiecapaciteit van EGNITE en er moet aanvullend werk worden gedaan om dit goed te onderzoeken. De ladingsinjectiecapaciteit (CIC) van de micro-elektrode werd vastgesteld door het bepalen van de stroompulsamplitude die een spanningsverschil opwekte (na het verwijderen van de ohmse daling) dat overeenkwam met het elektrochemische watervenster van de elektrode (-0.9 V voor kathodisch en +0.8 V voor anodisch versus Ag/AgCl ) (Aanvullende afbeelding. 17)⁶⁰.

statistische analyse

Gegevens zijn gemiddelde ± sd, n = 18 voor EIS en n = 3 voor chronopotentiometrieën. Gegevens van de kaart van kathodische capacitieve spanningsexcursies zijn het gemiddelde van de kathodische capacitieve spanningsexcursies voor één gebeurtenis voor elke pulsvorm van n = 3 elektroden.

Evaluatie van mechanische stabiliteit

Echografie ultrasoonapparaat

EGNITE-elektrodereeksen werden in een bekerglas gevuld met water in een ultrageluidwaterbad (Elmasonic P 180H) geplaatst. Sonicatie werd toegepast bij 37 kHz gedurende 15 minuten bij 200 W, en gevolgd door nog eens 15 minuten ultrasoonapparaat bij 37 kHz met het vermogen verhoogd tot 300 W. Beelden van elektroden werden voor en na de sonicatiestappen verkregen.

Buigtest

De buigopstelling (afb. 2k) bestond uit drie cilindrische staven; de middelste (diameter, 700 µm) werd naar beneden gelaten, waardoor buighoeken van 131° ontstonden. Voor de buigtest werden drie flexibele micro-elektrode-arrays gebruikt. Elke array bevatte 18 micro-elektroden met een diameter van 50 µm. Twee arrays werden na 10 en 20 cycli gemeten, terwijl één apparaat slechts gedurende 10 cycli werd gemeten omdat het tijdens het hanteren na het meten beschadigd raakte. De buigtestcyclus bestond uit een belasting van 10 seconden plus 10 seconden zonder belasting. Apparaten werden elektrochemisch gekarakteriseerd (EIS en CV) voor en na 10 en 20 buigcycli.

Epicorticale neurale opname

Epicorticale implantatie

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Europese Gemeenschapsraad en de Franse wetgeving voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren. De protocollen zijn goedgekeurd door de ethische commissie van Grenoble (ComEth) en geautoriseerd door het Franse ministerie (nummer 04815.02). Sprague-Dawley-ratten (mannelijk, 4 maanden oud, met een gewicht ~600 g) werden intramusculair verdoofd met ketamine (50 mg per kg (lichaamsgewicht)) en xylazine (10 mg per kg (lichaamsgewicht)) en vervolgens gefixeerd op een stereotactische houder. Door de tijdelijke schedel te verwijderen, kwam de auditieve cortex bloot te liggen. Dura mater werd bewaard om beschadiging van het corticale weefsel te voorkomen. Er werd een gat geboord bij het hoekpunt om de referentie-elektrode in te brengen, en een tweede gat, 7 mm naar voren vanaf de eerste, werd geboord om de aardelektrode in te brengen. De elektroden waren 0.5 mm dikke pinnen die werden gebruikt voor stopcontacten voor geïntegreerde schakelingen. Ze werden geplaatst om elektrisch contact te maken met de dura mater en met tandcement aan de schedel bevestigd. Vervolgens hebben we het oppervlakmicro-elektrodelint op de auditieve cortex gemonteerd, zoals weergegeven in Fig. 3b. De aderpatronen identificeren de auditieve cortex, in gebied 41 van Kriegs rattenhersenkaart. Corticale signalen werden gelijktijdig versterkt met een versterking van 1,000 en gedigitaliseerd met een bemonsteringssnelheid van 33 kHz. Een luidspreker op 20 cm voor het oor van een rat, contralateraal van de blootgestelde cortex, leverde akoestische stimuli af. De afgegeven stimuli werden gevolgd door een microfoon van 0.25 inch (Brüel & Kjaer, 4939) die vlakbij het oor was geplaatst en werd weergegeven in geluidsdrukniveau (dB SPL re 20 μPa). We onderzoeken de vertex-positieve (negatieve omhoog) middellange latentiereacties die worden opgeroepen door afwisselende klikken bij 80 dB SPL, en tone burst-stimuli bij 70 dB SPL met frequenties variërend van 5 tot 40 kHz, een stijgtijd- en daaltijd van 5 ms en een duur van 200 ms.

Data-analyse

Elektrofysiologische gegevens werden geanalyseerd met behulp van Python 3.7-pakketten (Numpy, Pandas, Scipy, Neo, Elephant, Sklearn Matplotlib) en de aangepaste bibliotheek PhyREC (https://github.com/aguimera/PhyREC). r.m.s. waarden werden berekend met een schuifvenster van 20 ms bij frequenties boven 200 Hz. Spectrogrammen werden berekend voor een bereik tussen 70 Hz en 1.1 kHz. PSD werd berekend over 60 seconden continue opnames. Voor een gegeven elektrode-array werden twee PSD's berekend: in vivo (IV) en post-mortem (PM). De SNR wordt uitgedrukt in dB (20 × ln(r.m.s.(IV)/r.m.s.(PM))) en geïnterpoleerd voor 20 punten logaritmisch verdeeld tussen 10 Hz en 1 kHz.

statistische analyse

Epicorticale neurale gegevens gepresenteerd in Fig. 3 zijn afkomstig van individuele metingen bij één enkel dier. In afb. 3cworden gegevens van 64 elektroden gepresenteerd. In afb. 3dworden gegevens van twee geselecteerde elektroden gepresenteerd. In afb. 3fworden de PSD en SNR berekend op basis van 64 EGNITE-elektroden en weergegeven als gemiddelde ± s.d. In aanvullende afbeelding. 12c, d mediaangegevens worden gepresenteerd voor 192 EGNITE-elektroden van n = 3 experimenten en 60 platina-elektroden van n = 1 experiment.

Intracorticale neurale opname

Intracorticale implantatie

Dieren werden verdoofd met een mengsel van ketamine/xylazine (75:1, 0.35 ml/28 g i.p.) en deze toestand werd gehandhaafd met een inhalatiemasker dat 1.5% isofluraan opleverde. Er werden verschillende microschroeven in de schedel geplaatst om het implantaat te stabiliseren, en die bovenop het cerebellum werd gebruikt als algemene aarding. De sonde werd geïmplanteerd in de prefrontale cortex (coördinaten: AP, 1.5 mm; ML, ± 0.5 mm; DV, −1.7 mm van bregma). De implantatie werd uitgevoerd door de sonde te bedekken met maltose (zie onderstaand protocol) om tijdelijke stijfheid van de sonde te verschaffen en het inbrengen van de sonde te vergemakkelijken. De sonde werd afgedicht met tandcement. Er werden TDT-ZifClip-connectoren gebruikt om de sonde via een geminiaturiseerde kabel op het elektrofysiologische systeem aan te sluiten. Na de operatie onderging de muis een herstelperiode van 1 week en kreeg pijnstillende (buprenorfine) en ontstekingsremmende (meloxicam) behandelingen. Neurale activiteit werd geregistreerd met het meerkanaals Open Ephys-systeem met een bemonsteringsfrequentie van 30 kHz met een Intan RHD2132-versterker. De auditieve taakexperimenten werden uitgevoerd in een geluiddichte doos, met twee luidsprekers erin, waarbij protocollen werden gebruikt die waren gebaseerd op eerder beschreven werk⁶¹. De geluidsstimulus bestond uit een 15 ms lange witte ruisklik, 100 keer herhaald (cycli), elk gescheiden door 5 seconden (interstimulusinterval). Tijdens de taak kon het dier zich vrij bewegen.

Maltose-verstijverprotocol

Een waterige oplossing van maltose wordt verwarmd tot het glasovergangspunt (T_g), tussen 130 en 160 °C, met behulp van een kookplaat of magnetron. Zodra de maltose stroperig is, wordt de achterkant van de sonde alleen in contact gebracht met de maltose. Naarmate de maltose afkoelt, wordt de sonde stijver en stijver.

Data-analyse

Neurale signalen van elke elektrode werden offline gefilterd om SUA en LFP's te extraheren. SUA werd geschat door het signaal tussen 450 en 6,000 Hz te filteren en de pieken van individuele neuronen werden gesorteerd met behulp van hoofdcomponentenanalyse met Offline Sorter v.4 (Plexon). Om LFP's te verkrijgen, werden de signalen gedownsampled naar 1 kHz, gedetrended en notch-gefilterd om ruislijnartefacten (50 Hz en zijn harmonischen) te verwijderen met op maat geschreven scripts in Python. AEP SNR werd berekend als de verhouding tussen de piek-N1-amplitude en de s.d. van een periode van 20 ms voorafgaand aan de stimulus.

statistische analyse

Gegevens getoond in Afb. 3u, ik zijn gemiddelde ± sd, n = 30 als het aantal gemiddelde pogingen. Gegevens die van dezelfde elektrode zijn geregistreerd, worden weergegeven op dag 30, 60 en 90. Gegevens van een enkel dier worden weergegeven.

Chronische epicorticale biocompatibiliteit

Chirurgische implantatie van apparaten

Voor dit onderzoek werden in totaal 27 volwassen mannelijke Sprague-Dawley-ratten gebruikt (Charles River). De dieren werden gehuisvest bij een omgevingstemperatuur van 21 ± 2 °C en een luchtvochtigheid van 40-50%, in een cyclus van 12 uur licht/12 uur donker. Ratten werden in groepen gehuisvest en kregen gedurende de gehele experimentele periode vrije toegang tot dieet en water. Experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Animal Welfare Act (1998), onder goedkeuring van het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken en de plaatselijke ethische beoordelingsinstantie voor dierenwelzijn (AWERB). Dieren werden gedurende de duur van de operatie verdoofd met isofluraan (2-3%) en de diepte van de anesthesie werd gevolgd door de teenknijpreflextest. Dieren werden in een stereotactisch frame (Kopf, 900LS) geplaatst, boven een thermische deken om de lichaamstemperatuur op peil te houden. Een craniotomiegat (~5 mm x 4 mm) werd op 1 mm afstand van de middellijn gemaakt met behulp van een tandartsboor met een boor van 0.9 mm, de dura werd verwijderd en het epicorticale apparaat op het corticale oppervlak van de hersenen geplaatst. Het craniotomiegat werd afgedicht met Kwik-sil, gevolgd door tandcement om het vast te zetten, en de huid werd gesloten. Subcutane injecties met zoutoplossing (1 ml per kg (lichaamsgewicht)) en buprenorfine (0.03 mg per kg (lichaamsgewicht)) werden gegeven om verloren vocht aan te vullen en postoperatieve pijn te verminderen, en de anesthesie werd stopgezet.

Weefselverzameling en -verwerking

Dieren werden 2, 6 of 12 weken na implantatie gedood met behulp van een methode die geschikt was voor het uit te voeren type analyse.

Histologie en immunohistochemie

2, 6 of 12 weken na de implantatie werden ratten gedood via cardiale perfusie met gehepariniseerde (10 E ml^-1, Sigma-Aldrich) PBS, gevolgd door 4% paraformaldehyde (PFA, Sigma-Aldrich) in PBS. Hersenen werden gedurende 4 uur gefixeerd in 24% PFA en vervolgens gedurende ten minste 30 uur overgebracht naar 48% sucrose in PBS voordat ze werden ingevroren in isopentaan. De hersenen werden vervolgens bewaard bij -80 °C totdat ze werden ingevroren bij 25 µm. Het weefsel werd vervolgens gekleurd op geïoniseerd calciumbindend adaptermolecuul 1 (Iba-1) om het niveau van microgliale activering te bepalen. In het kort werden weefselcoupes geblokkeerd met 5% geitenserum in PBS met 0.1% Triton-X gedurende 1 uur vóór incubatie gedurende de nacht bij 4 °C met het primaire antilichaam anti-Iba-1 (1:1,000, 019-19741; Wako). Secties werden vervolgens gedurende 594 uur bij kamertemperatuur gekleurd met secundair antilichaam, anti-konijn Alexa Fluor 1 (400:11012, A-1; Thermo Fisher). De objectglaasjes werden gemonteerd met dekglaasjes met behulp van Prolong Gold anti-fade montagemedia met 4,6-diamidino-2-fenylindool (Thermo Fisher). De sonde besloeg een gebied van 3 x 3.7 mm² op het corticale oppervlak van de hersenen; weefselsecties geselecteerd voor kleuring bedekten een lengte van 3.2 mm in dit gebied. Dia's werden afgebeeld met behulp van een 3DHistech Pannoramic-250 microscoopglaasjesscanner bij 20x en beelden werden geanalyseerd met CaseViewer v.2.4 (3DHistech). Om de activering van microglia te beoordelen, werd een gebied van 3.2 mm bedekt, waarbij elke 100 µm één beeld werd geanalyseerd. Er werden beelden gemaakt met een vergroting van 8.5x, die een gedeelte van de epicorticale sondelocatie gedetailleerd beschreven, 3 mm vanaf de middellijn van de hersenen, en het gebied direct onder de sondelocatie omvatten.

Beeldverwerking

De microscopiegegevens werden met een beeld verwerkt met behulp van een algoritme voor karakterisering van het microglia-fenotype (aanvullende figuur 2). 13). Microgliale activatie werd geanalyseerd met behulp van een aangepaste CellProfiler* (Broad Institute, v.3.1.9 van https://cellprofiler.org/) pijpleiding. Ten eerste werd de EnhanceOrSuppressFeatures-module gebruikt om draadvormige structuren zoals neurieten te verbeteren door toepassing van de tubeness-verbeteringsmethode. Van de verbeterde afbeeldingen werden cellen gesegmenteerd met behulp van de module IdentityPrimaryObjects. Voorlopige metingen van de cellen suggereerden dat het geschikte objectdiameterbereik 3-40 pixels was. Objecten buiten dit diameterbereik of die de rand van het beeld raken, worden weggegooid. De cellen werden gesegmenteerd met behulp van een Otsu-adaptieve drempelstrategie van twee klassen met een adaptieve venstergrootte van 50 pixels. De objecten geïdentificeerd door de module IdentityPrimaryObjects werden ingevoerd in de module MeasureObjectSizeShape om de noodzakelijke eigenschappen voor celclassificatie te berekenen. In de ClassifyObjects-module werd AreaShape gespecificeerd als de categorie waarop classificaties moesten worden gebaseerd, en werd Extent geselecteerd als de overeenkomstige meting. De cellen werden geclassificeerd als 'geactiveerd’ of ‘niet-geactiveerd’ op basis van hun eigenschap Extent, wat de verhouding is van het gebied dat door de cel wordt ingenomen en het gebied dat wordt ingenomen door het kader. Deze classificatiebenadering werd gerationaliseerd door het feit dat geactiveerde microglia grote cellichamen hebben en geen processen, en dus een veel groter deel van hun grenskaders in beslag nemen dan hun niet-geactiveerde tegenhangers. Ten slotte werden de modules CalculateMath en ExportToSpreadsheet gebruikt om de gewenste statistieken te berekenen en uit te voeren.

statistische analyse

Datasets zijn dat wel n = 3 voor elk apparaattype (implantaat met alleen PI; PI met zichtbaar microgefabriceerd goud (goud); en PI met microgefabriceerd goud en EGNITE (EGNITE) op alle tijdstippen), met uitzondering van 6 weken goud dat n = 2 voor ELISA-gegevens. Contralaterale hemisferen werden op elk tijdstip gecombineerd om te geven n = 9 2 en 12 weken na implantatie en n = 8 6 weken na implantatie. Analyse van de gegevens werd uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism v.8-software. De statistische analyse werd voltooid met behulp van een tweewegsvariantieanalyse (ANOVA) met de meervoudige vergelijkingstest van Tukey, waar van toepassing; P < 0.05 werd als significant beschouwd.

ELISA

Na de implantatieperiode werden de dieren gedood door cervicale dislocatie. Hersenweefsel werd geëxtraheerd uit zowel de rechter als de linker hersenhelft, snel ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 °C tot verder gebruik. Weefsel werd gelyseerd met behulp van NP-40-lysebuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, 1% Nonidet P40-substituut, Fluka, pH aangepast tot 7.4) die protease en fosfataseremmer bevatte (Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, Thermo Fisher), gevolgd door mechanische verstoring van het weefsel (TissueLyser LT, Qiagen). De monsters werden vervolgens gedurende 10 minuten bij 5,000 rpm gecentrifugeerd en het supernatant tot verder gebruik bij 4 °C bewaard. Het LEGENDplex Rat Inflammation Panel (catalogusnummer 740401, BioLegend), een op kralen gebaseerde multiplex ELISA-kit, werd uitgevoerd om de volgende cytokinen te kwantificeren; IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-18, IL-33, CXCL1 (KC), CCL2 (MCP-1), granulocyt-macrofaagkoloniestimulerend factor, interferon-γ en tumornecrosefactor. De kit werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant, met eiwit geladen in een vast volume van 15 µl. Na incubatie met supernatant werden de kralen op een BD FACSVerse flowcytometer gelopen en werden de gegevens geanalyseerd met behulp van LEGENDplex data-analysesoftware.

Neurale stimulatie

Intrafasciculaire implantatie

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Universitat Autònoma de Barcelona in overeenstemming met Richtlijn 2010/63/EU van de Europese Gemeenschappen. De dieren werden gehuisvest bij 22 ± 2 °C onder een cyclus van 12 uur licht/12 uur donker, waarbij voedsel en water vrij beschikbaar waren. De heupzenuw van verdoofde vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten (250-300 g, ~18 weken oud) werd operatief blootgesteld en de TIME-elektroden werden transversaal over de heupzenuw geïmplanteerd met behulp van een rechte naald bevestigd aan een 10-0 lusdraad⁴⁶. Het proces werd gevolgd onder een dissectiemicroscoop om de juiste positie van de actieve plaatsen in de zenuwbundels te garanderen (Fig. 4b). Tijdens de experimenten werd de lichaamstemperatuur van het dier op peil gehouden met een verwarmingskussen.

Zenuwstimulatie werd uitgevoerd door het toepassen van reeksen bifasische stroompulsen met een vaste duur van 100 µs per fase en toenemende amplitude van 0 tot 150 µA in stappen van 1 of 3 µA bij 3 Hz gedurende 33 seconden (Stimulator DS4, Digitimer) via de verschillende EGNITE micro-elektroden. Tegelijkertijd werden de CMAP's geregistreerd van de GM-, TA- en PL-spieren met behulp van kleine naaldelektroden (13 mm lang, 0.4 mm diameter, roestvrijstalen naaldelektroden A-03-14BEP, Bionic) die in elke spier waren geplaatst.⁶². De actieve elektrode werd op de spierbuik geplaatst en de referentie ter hoogte van de pees. Elektromyografische opnames werden versterkt (x100 voor GM en TA, x1,000 voor PL; P511AC-versterkers, Grass), banddoorlaatfilter (3 Hz tot 3 kHz) en gedigitaliseerd met een PowerLab-opnamesysteem (PowerLab16SP, ADInstruments) op 20 kHz.

Data-analyse

De amplitude van elke CMAP werd gemeten vanaf de basislijn tot de maximale negatieve piek. De spanningspiekmetingen werden genormaliseerd naar de maximale CMAP-amplitude die voor elke spier in het experiment werd verkregen. Voor elke actieve plaats werd een selectiviteitsindex (SI) berekend als de verhouding tussen de genormaliseerde CMAP-amplitude voor één spier, CMAP_ien de som van de genormaliseerde CMAP-amplitudes in de drie spieren, volgens de formule SI_i = nWCPA_i/∑nWCPA_j, bij de minimale stimulatiestroomamplitude die een minimale functioneel relevante spierrespons opwekte (gedefinieerd als ten minste 5% CMAP-amplitude voor een van de spieren ten opzichte van de maximale CMAP-amplitude van die spier die eerder was bepaald). Vervolgens werden de actieve plaatsen met de hoogste SI voor elk van de drie spieren geselecteerd als de SI's voor elke spier in een bepaald experiment.

Chronische intraneurale biocompatibiliteit

Na een eerder gerapporteerde procedure^50,63, de heupzenuw van verdoofde vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten (250-300 g, ~18 weken oud) werd blootgesteld en de apparaten voor in vivo biocompatibiliteit met en zonder EGNITE werden longitudinaal geïmplanteerd in de tibiale tak van de heupzenuw (n = 6–8 per groep). In het kort wordt de zenuw bij de trifurcatie doorboord met een rechte naald bevestigd aan een 10-0 lusdraad (STC-6, Ethicon); de draad trekt aan het pijlvormige uiteinde van de gebogen elektrodestrook. De punt is afgesneden om de draad weg te nemen, en de punten van elke arm zijn licht gebogen om te voorkomen dat het apparaat wordt teruggetrokken. Er werd gekozen voor een longitudinaal implantaat omdat dit een betere studie van de reactie op vreemd lichaam in de zenuw mogelijk maakt⁵⁰.

Zenuw- en dierfunctionele beoordeling

Dieren werden geëvalueerd tijdens de follow-up na implantatie door middel van zenuwgeleidings-, algesimetrie- en loopspoorbewegingstests⁶². Voor geleidingstests werd de heupzenuw van de geïmplanteerde en contralaterale poten gestimuleerd door naaldelektroden bij de heupinkeping en werd de CMAP van de PL-spier geregistreerd zoals hierboven. De latentie en de amplitude van de CMAP werden gemeten. Voor de algesimetrietest werden ratten op een draadnetplatform geplaatst en werd een mechanische, niet-schadelijke stimulus toegepast met een metalen punt verbonden met een elektronische Von Frey-algesimeter (Bioseb). De nociceptieve drempel (kracht in grammen waarbij de dieren de poot terugtrokken) van geïmplanteerde versus contralaterale poten werd gemeten. Voor de loopbaantest werd het plantaire oppervlak van de achterpoten met zwarte inkt geverfd en liet men elke rat door een gang lopen. De voetafdrukken werden verzameld en de ischias functionele index berekend⁶².

histologie

Na 2 of 8 weken werden de dieren geperfuseerd met PFA (4%) en werden de heupzenuwen geoogst, achteraf gefixeerd, gecryopreserveerd en verwerkt voor histologische analyse. Voor de evaluatie van de FBR werden heupzenuwen in dwarsdoorsneden van 15 μm dik gesneden met een cryostaat (Leica CM190). Monsters werden gekleurd met primaire antilichamen voor gemyeliniseerde axonen (anti-RT97 om Neurofilament 200K, 1:200; Developmental Studies Hybridoma Bank) en macrofagen (anti-Iba-1, 1:500; Wako) te labelen. Vervolgens werden secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met secundaire antilichamen ezel anti-muis Alexa Fluor 488 en ezel anti-konijn Alexa Fluor 555 (1:200, Invitrogen). Er werden representatieve secties van het centrale deel van het implantaat in de scheenbeenzenuw geselecteerd, beelden gemaakt met een epifluorescentiemicroscoop (Eclipse Ni, Nikon) bevestigd aan een digitale camera (DS-Ri2, Nikon) en beeldanalyse uitgevoerd met ImageJ-software (National Institutes van gezondheid). De hoeveelheid Iba-1-positieve cellen in het hele gebied van de scheenbeenzenuw werd gekwantificeerd en de dikte van de weefselcapsule werd gemeten als de gemiddelde afstand van elke zijde van het implantaat tot de dichtstbijzijnde axonen.

statistische analyse

Voor statistische analyse van gegevens gebruikten we een- of tweeweg-ANOVA gevolgd door een post-hoc-test van Bonferroni voor verschillen tussen groepen of tijden. GraphPad Prism-software werd gebruikt voor grafische weergave en analyse. Er werd rekening gehouden met statistische significantie P <0.05.

Rapportage samenvatting

Nadere informatie over onderzoeksontwerp is beschikbaar in de Samenvatting van de rapportage over de natuurportfolio gekoppeld aan dit artikel.

• Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
• PlatoData.Network Verticale generatieve AI. Versterk jezelf. Toegang hier.
• PlatoAiStream. Web3-intelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
• PlatoESG. carbon, CleanTech, Energie, Milieu, Zonne, Afvalbeheer. Toegang hier.
• Plato Gezondheid. Intelligentie op het gebied van biotech en klinische proeven. Toegang hier.
• Bron: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01570-5