Ethische uitspraak

Alle dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de Canadian Council on Animal Care Guidelines. De rapportage van deze gegevens in het manuscript volgt de aanbevelingen in de ARRIVE-richtlijnen. De Animal Care Committee van de University of Calgary Health Sciences keurde alle dierprotocollen en chirurgische procedures goed die in deze studie werden gebruikt (Ethics ID # AC16-0043).

iPSC-generatie

C57BL/6-embryo's (dag 12.5) werden geoogst, gespoeld in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) en gemacereerd. Na behandeling met 0.25% trypsine werd de resulterende celsuspensie gefilterd om afval te verwijderen en uitgeplaat in DMEM met hoog glucosegehalte (Gibco), 10% FBS (Gibco), 1 x MEM No-Essential Amino Acids (Gibco), 50 eenheden/ml penicilline –Streptomycine (Gibco). De resulterende muizenembryofibroblasten (MEF's) werden verzonden naar Applied Biological Materials Inc. (Richmond, BC) voor cellulaire herprogrammering om iPSC's te produceren. MEF's werden getransduceerd met lentivirussen SFFV-OCT4, -SOX2 en -KLF4. Na een week werden ESC-achtige kolonies overgebracht naar verse putjes met feeders. Na twee passages over feedercellen werden iPSC's van muizen naar UCalgary verscheept. Om GFP in het genoom op te nemen, werd CRISPR/Cas9 gebruikt om een ​​transgen van 6 kb in de ROSA26-locus van de muis in te brengen met behulp van homologie-onafhankelijke gerichte integratie (HITI)-techniek [136]. Voor elke nucleofectiereactie werd CRISPR DNA 10 μl van 916 ng/μl en DNA 10 μl van 719 ng/μl Cas9 DNA-construct gemengd met 28.98 μl van 414 ng/μl GFP-construct gebruikt voor iPSC's. Alle DNA-constructen werden opgelost in water. Voor elke nucleofectiereactie werden constructen met drie miljoen iPSC's gebruikt met nucleofectiekit (muis nucleofectorkit, Lonza, Cat. Nr. VPH-1001) in programma A-023 volgens de instructies van de fabrikant. Nucleofected iPSC's werden gedurende twee dagen gekweekt op de met gelatine en MEF's gecoate platen met ESC-media. Vervolgens werd FACS met SSEA1-marker uitgevoerd. iPSC's werden enzymatisch verteerd met 0.25% trypsine gedurende 5 minuten bij 37 °C. Afzonderlijke cellen werden tweemaal gewassen met koude DPBS en gekleurd met geconjugeerd SSEA1-PE met een concentratie van 1 μg/ml (Santa cruz: sc-21702 PE) gedurende 15 minuten. Dubbel positief voor GFP en SSEA1 iPSC's werden gesorteerd in met gelatine beklede platen met 96 putjes, één cel/putje. Van de klonen werd de sequentie bepaald om de juiste positionering en oriëntatie van het transgen in de ROSA26-locus te bepalen. Om de cellen te valideren die als functionele iPSC's bleven, werden teratoom-assays uitgevoerd in waar 1.10⁶ cellen werden subcutaan getransplanteerd in het dorsale gebied van SCID-beige muizen. Monsters werden gefixeerd, verwerkt en ingebed in paraffine. Ze werden doorgesneden tot een dikte van 10 μM en gekleurd met Safranin O.

iPSC-cultuur

Muriene iPSC's werden routinematig gekweekt op mitotisch geïnactiveerde embryonale fibroblasten van muizen (MEF's) in T25-kolven (Fisher). Kweekmedium bestond uit hoog glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Lonza) aangevuld met 1% niet-essentieel aminozuur, 1% Anti-Anti, 15% foetaal runderserum (FBS) en 0.1 mM β-mercaptoethanol (alle Invitrogen) . Om iPSC-pluripotentie te behouden, werd kweekmedium aangevuld met 1000 U/ml leukemie-remmende factor (LIF). Cellen werden routinematig gepasseerd bij het bereiken van ongeveer 80% confluentie elke derde tot vierde dag en bewaard in een bevochtigde incubator met 5% CO₂ bij 37°C. Eén passage voordat de cellen aan de collageensteiger werden toegevoegd, werden ze gekweekt op met gelatine (0.1%, Fisher) gecoate kolven om overtollige MEF's te verwijderen.

Steiger voorbereiding

De collageen-I-steiger werd bereid volgens eerder gepubliceerde methoden^7,14,18. Runderfibrillair collageen I (3 mg/ml, PureCol, Advanced Biomatrix) werd gepolymeriseerd als een 3D-gel. In het kort werd 80% v/v 3 mg/ml type-I collageenoplossing gemengd met een iPSC-suspensie van 1 miljoen cellen/ml en 20% v/v beta-glycerolfosfaat (βGP, Sigma Aldrich) opgelost in 5 x geconcentreerde Dulbecco's gemodificeerde Adelaarsmedium (DMEM)¹⁸. Vervolgens werd 15% FBS (Invitrogen), 1% niet-essentiële aminozuren, 1% Anti-Anti en 0.1 mM β-mercapto-ethanol (alle Invitrogen) toegevoegd¹⁸. Het collageen-I/iPSC-construct werd verdeeld over een plaat met 96 putjes met een volume van 100 μl per putje. De gepolymeriseerde steiger werd in een incubator geplaatst bij 37 ° C en 5% COXNUMX₂ pre-differentiëren gedurende 5 dagen voorafgaand aan in vivo implantatie in het diermodel. Voor de controle van de steiger met alleen collageen werd het bovenstaande protocol ook uitgevoerd, maar de iPSC's werden niet toegevoegd. Een algemeen overzicht van het proces wordt getoond in Aanvullende Fig. S1.

Realtime polymerasekettingreactie (RT-PCR)

De collageen-I-steigers met iPSC's werden verzameld op tijdstippen: 0, 1, 3, 5, 8, 11, 13, 15, 18 en 21 dagen na het zaaien. Trizol (Invitrogen) werd toegevoegd en een naald van 26 ½ gauge werd gebruikt om de collageen/celmatrix in de Trizol te lyseren. RNA werd geïsoleerd volgens het door de fabrikant aanbevolen protocol. cDNA werd bereid met behulp van de High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (ThermoFisher). RT-PCR werd opnieuw uitgevoerd op een ABI QuantStudio 6 met behulp van sondes Sp7 (Mm04209856_m1) en Blap (Mm03413826_mH), Ibsp (Mm00492555_m1), Sox9 (Mm00448840_m1), Kol2a1 (Mm01309565_m1), Oct4 (Mm03053917_g1), Nanog (Mm02019550_s1) met 18S (Mm03928990_g1) als huishoudcontrole.

Beoordeling van de levensvatbaarheid door flowcytometrie

Cellen werden gedissocieerd in eencellige suspensies met collagenase I-behandeling en onderworpen aan flowcytometrie met behulp van een Attune NXT- en FlowJo-software voor analyse. Per monster werden ten minste tienduizend gebeurtenissen geregistreerd en analyse van hele cellen werd uitgevoerd met behulp van geschikte verstrooiingspoorten om celresten en aggregaten te vermijden. Cellen werden gekleurd met behulp van de Annexin-PI-kit (ThermoFisher) volgens de instructies van de fabrikant.

Diermodellen

MPC-afstammingsmuizen (Hik1^cre-ERT2:ROSA^tdTomaat) op een C57BL/6-achtergrond werden geleverd door Dr. T. Michael Underhill (University of British Columbia). In dit onderzoek werden zowel mannetjes als vrouwtjes van 8-12 weken oud gebruikt. Het experimentele ontwerp voor de botbeschadiging bij intacte en ovariëctomie (OVX) muizen wordt weergegeven in aanvullende figuur XNUMX. S2.

In dit muismodel werden de endogene MPC's permanent gelabeld met tdTomato post-tamoxifen-inductie. Muizen werden verdoofd en kregen intraperitoneale injecties van de actieve isomeer van tamoxifen ((Z)-4-Hydroxytamoxifen, Sigma) opgelost in gesteriliseerde zonnebloemolie. Muizen werden eenmaal per dag gedurende 100 dagen geïnjecteerd met 100 μl tamoxifen-oplossing (4 mg / kg), gevolgd door een wachttijd van 1 week om recombinatie mogelijk te maken.

Een week na de laatste tamoxifen-injectie werd een braamgat (niet-kritieke grootte) verwonding opgelopen. De boorgatverwonding werd uitgevoerd volgens procedures die eerder zijn beschreven door Taiani et al.^12,13,19, die is gewijzigd ten opzichte van methoden die eerder zijn gepubliceerd door Uusitalo et al.²⁰ Muizen werden verdoofd met veterinair isofluraan en voorafgaand aan de operatie werd 0.1 ml buprenorfine subcutaan toegediend. Een high-speed microdrill (Fine Science Tools) werd gebruikt om een ​​gat met een diameter van 0.7 mm te boren in de medullaire holte (zonder de tegenoverliggende zijde te beschadigen) van de metafyse van de proximale tibia¹⁹.

In het homeostatische fractuurmodel werden muizen verdeeld in drie groepen: onbehandelde controle, lege collageen I-constructie en collageen I + iPSC's. Onmiddellijk na de verwonding door het boorgat werd de huid van onbehandelde controlemuizen geniet om de plaats van de incisie te sluiten. Voor de met lege collageen I en collageen I + iPSC behandelde muizen werd 100 µl gel met (100,000 iPSC's per muis) of zonder cellen in het braamgatdefect geïmplanteerd. De plaats van de incisie werd vervolgens afgesloten met nietjes en de muizen werden teruggebracht naar hun kooien en mochten onmiddellijk na de operatie het gewicht dragen.

Vergelijkbaar met het experimentele ontwerp van het homeostatische fractuurgenezingsmodel, Hic1^cre-ERT2:ROSA^tdTomaat kreeg intraperitoneale tamoxifen-injecties eenmaal per dag gedurende 4 dagen. Een week na de laatste tamoxifen-injectie kregen muizen een OVX-operatie. In het kort werden muizen verdoofd en kregen ze voorafgaand aan de operatie 0.1 ml buprenorfine. Beide eierstokken werden gelokaliseerd en weggesneden. Een week na de OVX-operatie werd een boorgatoperatie uitgevoerd. De OVX-muizen werden verdeeld in drie groepen: OVX onbehandelde controle, OVX leeg collageen I-construct en OVX en collageen I + iPSC's.

Histologie en immunofluorescentie

Tibiae werden ontkalkt, verwerkt en ingebed in paraffinewas en doorsneden op 10 μm. Safranin-O/fast-green kleuring en immunofluorescentie werden uitgevoerd. De specifieke gebruikte markers waren: TdTomato, GFP, Anti-Mo/Rt Ki-67 eFluor 660 Clone SolA15 (Invitrogen, Ki67), Bone sialoprotein (BSP) Clone WVID1(9C5) (Developmental Studies Hybridoma Bank). Objectglaasjes werden behandeld met EverBrite™ Hardset Mounting Media met DAPI (Biotium) en afgebeeld met behulp van de Zeiss Axioscan-microscoop.

Weefselcytometrie

Voor kwantitatieve analyse werd het interessegebied verkregen als digitale grijswaardenafbeeldingen. Cellen van een bepaald fenotype werden geïdentificeerd en gekwantificeerd met behulp van de TissueQuest-software (TissueGnostics), waarbij afkapwaarden werden bepaald ten opzichte van de negatieve controles (niet-gekleurde en alleen secundaire controles). Gating en kwantificering van enkele / dubbele positieve cellen werden uitgevoerd met behulp van deze drempels.

Röntgenmicroscopie (Xradia)

Röntgenmicroscopie (XRM)-beeldvorming werd gebruikt op C57BL/6-muizen (normaal en OVX) om de botstructuur en callusvorming in het letselgebied te beoordelen. De tibiae (inclusief zacht weefsel en spieren) werden geoogst en gedurende 10 uur gefixeerd in 24% neutraal gebufferde formaline (NBF). Na 24 uur werden alle zachte weefsels en spieren van het bot verwijderd. Monsters werden in 70% alcohol geplaatst tot XRM-beeldvorming. Om monsters voor XRM te bereiden, werd het scheenbeen uit de alcohol gehaald en vastgezet met schuim in een rechtopstaande houder. PBS werd gebruikt om hydratatie tijdens beeldvorming te garanderen. Drie calciumhydroxyapatiet (CHA) botkalibratiefantomen (dichtheden 50, 1000 en 1200 mg/cm³) werden bovenop een dunne schuimlaag geplaatst om vlak te zitten en met tape aan de houder vastgemaakt. Lage energie (40 kVp spanning, 3 W vermogen) XRM-scans werden uitgevoerd met een 4 × objectief. De belichtingstijd van elke projectie was 3 s en projecties van 2001 werden per rotatie verzameld. Beelden werden gereconstrueerd tot een isotrope voxelgrootte van 4.9 μm. De onbewerkte gegevens verkregen uit de XRM-scan werden verwerkt met behulp van Amira-software en aangepaste SimpleITK-scripts (v0.10.0, http://www.simpleitk.org/)²¹. Alle plakjes met het braamgatdefect werden gesegmenteerd, inclusief het gebied tot waar het corticale bot eindigt en alle nieuw gevormde botcallus die zich uitstrekt vanaf de defectplaats (aanvullend Fig. S3). Regions of interest (ROI's) werden in de CHA-kalibratiefantomen geplaatst om randartefacten te vermijden met behulp van ITK-SNAP (v3.8.0, http://www.itksnap.org/)²². De gemiddelde lineaire verzwakking werd berekend in elke ROI en er werd een lineaire kalibratievergelijking gebruikt om de XRM-beelden te kalibreren. Voor alle kalibraties, R² > 99%. Een dichtheidsdrempel van 800 mg/cm³ werd gebruikt om volledig gemineraliseerd weefsel te segmenteren. Callus botvolumefractuur (BV/TV) werd berekend als het aantal volledig gemineraliseerde voxels in de callussegmentatie gedeeld door het totale aantal voxels in de callussegmentatie. Callus botmineraaldichtheid (BMD) werd berekend als de gemiddelde dichtheid binnen de callussegmentatie. Eeltweergaven werden gegenereerd met ParaView (5.7.0) software. Er zijn drie filters toegepast: (1) Drempel - minimaal 0.5, (2) Oppervlak extraheren en (3) Glad - bij 400 iteraties.

statistische analyse

Alle gegevens werden geanalyseerd met behulp van GraphPad Prism 9. Alle gegevenssets met meer dan twee experimentele groepen werden geanalyseerd met behulp van een one-way variantieanalyse (ANOVA) met een betrouwbaarheidsinterval van 95% (α = 0.05) met een Fisher's LSD post-hoc test . Gegevenssets met slechts twee groepen werden geanalyseerd met behulp van een tweezijdige ongepaarde parametrische t-test met een betrouwbaarheidsinterval van 95% (α = 0.05).

• Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
• EVM Financiën. Uniforme interface voor gedecentraliseerde financiën. Toegang hier.
• Quantum Media Groep. IR/PR versterkt. Toegang hier.
• PlatoAiStream. Web3 gegevensintelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
• Bron: https://www.nature.com/articles/s41598-023-36609-z