Integratie van celstrekking in biomedisch onderzoek
,
]. Bij veel fysiologische functies, zoals ademhaling, spijsvertering, spiercontractie, hartslag en hersenontwikkeling, worden cellen voortdurend uitgerekt en/of samengedrukt. Een centraal element in deze processen is het vermogen van cellen om deze mechanische krachten waar te nemen ('mechanosensing') en mechanische informatie over te brengen als reactie ('mechanotransductie') (Box 1). Cellen kunnen bijvoorbeeld actief de stijfheid van de ECM waarop ze zijn verankerd onderzoeken door deze uit te rekken, dat wil zeggen door er trekkrachten op uit te oefenen via cel-ECM-adhesiecomplexen [
], hoewel niet alle sondeermechanismen waarmee cellen ECM mechanische eigenschappen kunnen waarnemen, zijn opgehelderd. Mechano-sensatie en -transductie van informatie produceert een reeks biochemische en biomechanische reacties die celveranderende cellulaire processen herprogrammeren, zoals motiliteit en afstammingsdifferentiatie, en zo een kritische impact hebben op de menselijke (patho)fysiologie [
,
,
] (Figuur 1, Sleutel figuur).
]. Van de vele materiële eigenschappen van het cytoskelet is het meest opvallende het vermogen om autonoom en actief te worden gereorganiseerd door cellen als reactie op veranderingen in de fysieke eigenschappen van hun extracellulaire omgeving [bijv. ECM-stijfheid of mechanisch rekken (MS)]. De kern van dit mechanische aanpassingsvermogen is een reeks biochemische en mechanische processen waarmee cellen de geometrie van hun omgeving en fysieke krachten die op hun omgeving worden uitgeoefend voelen door middel van focale adhesies, een proces dat 'mechanosensing' wordt genoemd.
,
]. Cellen hebben een groot aantal verschillende receptoren op hun oppervlak waarvan wordt aangenomen dat ze mechanosenserende elementen zijn die in staat zijn om mechanische informatie intracellulair over te brengen, wat leidt tot activering van verschillende biochemische signaalroutes. MS wordt bijvoorbeeld door cellen waargenomen via door rek geactiveerde eiwitten, zoals integrines, die fungeren als verankeringspunten waardoor cellen zich aan hun ECM kunnen hechten en er krachten op kunnen overbrengen [
]. Dit activeert de calciuminstroom als reactie op MS, samen met verschillende kinasen die uiteindelijk het cytoskelet reorganiseren en zijn vermogen om krachten en contractiliteit te genereren. Dit wordt gedeeltelijk bereikt dankzij het krachtgenererende vermogen van moleculaire motoren (myosine II), die langs actinefilamenten langs elkaar glijden om contractiliteit te genereren, terwijl actine actief polymeriseert op een polaire manier. De motorische activiteit van myosine II wordt opgewekt door een krachtslagmechanisme dat wordt aangewakkerd door ATP-hydrolyse. Met behulp van TFM kan men de krachten meten die cellen op hun omgeving uitoefenen, wat kan worden beschouwd als een indicatie van hoe goed focale adhesies zijn georganiseerd en verbonden met het onderliggende cytoskelet [
,
]. Het begrijpen van de onderliggende ontwerpprincipes van de cellulaire machinerie, zijn aanpasbare netwerken en zijn verschillende reacties op extracellulaire krachten is dus van het grootste belang, niet alleen om te begrijpen hoe de cel werkt bij gezondheid en ziekte, maar ook voor het beter ontwerpen van gemanipuleerde weefsels en voor regeneratieve geneeskunde. . Afhankelijk van de gestelde onderzoeksvraag kunnen de tijdschalen van belang variëren van seconden tot minuten (bijv. dynamiek van cellulaire verklevingen of veranderingen in celstijfheid bij acute statische MS-toepassing [
,
]) tot uren of zelfs dagen (bijv. veranderingen in het cytoskelet en de trekkracht als reactie op infectie van zoogdiercellen door intracellulaire bacteriële pathogenen [
]).
Figuur 1Sleutel figuur. Mechanische rek (MS) kan veel aspecten van cellulair gedrag en functie veranderen.
]. Wanneer de cel statisch wordt uitgerekt bij een bepaalde spanning, vindt er versterking van het cytoskelet plaats, de cel spreidt zich uit (verandert van vorm) en oefent verhoogde trekkrachten uit op zijn matrix via zijn gereorganiseerde cytoskelet [
,
]. Bijkomende celfuncties en gedragingen die kunnen veranderen tijdens statische versus cyclische MS die op cellen wordt toegepast, zijn onder meer (A) proliferatie [
,
]; (B) cellulaire migratie [
]; (C) afstammingsdifferentiatie [
,
]; (D) apoptose [
]; (E) cellulaire uitlijning en veranderingen in 3D-organisatie; (F) corticale stijfheid, hoeveelheid en samenstelling van oppervlaktereceptoren, glycocalyx-organisatie; (G) intercellulaire communicatie voor cellen in monolaag- en signaaldynamiek; (H) barrière-integriteit en intercellulaire krachtoverbrenging; (I) interacties met pathogenen, inclusief met commensale microben; en (J) interacties met andere celtypen, inclusief immuun- of kankercellijnen. Al deze veranderingen zouden in principe kunnen worden gevolgd via videomicroscopie. Afkortingen: ERK, extracellulair signaalgereguleerd kinase.
Aangezien mechanische rek (MS) alomtegenwoordig is in weefsels en samenstellende cellen, is het van cruciaal belang om er tijdens het experimenteren rekening mee te houden in vitro. Om de spatiotemporele veranderingen die optreden op cellulaire en moleculaire schaal tijdens MS bloot te leggen, worden CSD's gebruikt die toepassing van MS op meercellige assemblages mogelijk maken. Ondanks enige compatibiliteit met microscopie, is langdurige beeldvorming van levende cellen tijdens MS nog steeds beperkt. In deze review benadrukken we eerst het belang van het verder ontwikkelen van CSD's voor biologische en biomedische toepassingen door achtergrondinformatie te geven over het belang van MS bij gezondheid en ziekte. Vervolgens verdiepen we ons in het werkingsmechanisme van veelgebruikte CSD's, hun beperkingen, toepasbaarheid en compatibiliteit met live-cell videomicroscopie en benadrukken we verder de ontdekkingen die naar voren zijn gekomen in de basiscelbiologie en daarbuiten. Ten slotte bespreken we open vragen en manieren om de biomedische aantrekkelijkheid en toepasbaarheid van CSA's te verbeteren. We hopen dat we met deze kritische beoordeling zullen inspireren tot verdere ontwikkelingen in CSD's om langdurige beeldvorming tijdens stretching mogelijk te maken, om gemakkelijker de rol van MS bij het moduleren van cellen en weefsels te onderzoeken. (mechanische) biologie.
MS in weefsels en hun samenstellende cellen in gezondheid en ziekte
,
]. Veranderingen in fysiologische MS kunnen de oorzaak of het gevolg zijn van pathologieën (Box 2). In het myocardium leidt MS bijvoorbeeld de ontwikkeling en regulatie van periodieke hartcontracties, terwijl misregulatie van de reactie van cardiomyocyten op rek in verband wordt gebracht met verschillende hartaandoeningen [
] (Box 2). Het is niet verrassend dat MS onder ontwikkelingsomstandigheden de stamceldifferentiatie begeleidt in vitro, terwijl in de regeneratieve geneeskunde MS de sterkte en functionaliteit van gemanipuleerde hartspierweefsels verbetert [
]. Interessant is dat residente macrofagen ook MS kunnen waarnemen dankzij hun interacties met naburige cardiomyocyten. Beeldvorming onthulde dat macrofagen geactiveerd worden bij MS, waardoor het falende hart wordt beschermd door cardiale remodellering te bevorderen [
]. Evenzo kan MS in de darm darmepitheelcellen (IEC's) herprogrammeren, waardoor hun genexpressie verandert [
] en het genereren van verzadigingssignalen voor voerregulatie [
] (Box 2). Beeldvorming van IEC's na blootstelling aan MS onthulde dat laatstgenoemde wekenlang co-cultuur van IEC's met commensale microben mogelijk maakt, iets wat moeilijk is in statische culturen als gevolg van bacteriële overgroei die de dood van IEC's veroorzaakt [
,
]. Consequent ervoeren patiënten met een prikkelbare darmziekte, waarbij MS is aangetast, bacteriële overgroei [
]. Tijdens infectie beschermt de aanwezigheid van MS en cocultuur met commensalen het epitheel tegen infectie en letsel [
]. De precieze bijdragen van individuele soorten en de mechanismen die ze gebruiken om infectie te reguleren, werden echter niet beoordeeld, mogelijk vanwege onverenigbaarheid met videomicroscopie. Het loskoppelen van het effect van extracellulaire fysieke signalen van dat van het microbioom zou een ondubbelzinnige bepaling van hun bijdragen mogelijk kunnen maken. (Zien Box 3.)
MS tijdens hartslag
].
MS tijdens darmperistaltiek
], wat invloed heeft op de samenstelling van het microbioom en de IEC-gevoeligheid voor infectie als gevolg van IEC-herprogrammering, inclusief veranderingen in genexpressie [
]. Dit benadrukt het belang van bloot in vitro cellen naar MS om hun beter na te bootsen in vivo toestand. De IEC-barrière-integriteit en 3D-architectuur lijken ook meer op die van in vivo weefsels wanneer MS wordt toegepast [
].
MS tijdens ademhaling
]. Bij patiënten met acute respiratoire insufficiëntie die mechanische beademing krijgen, kan de spanning echter oplopen tot 15-25%, wat reeds bestaande aandoeningen kan verergeren (Figuur I). Onder normale omstandigheden vormen BEC's een fysieke barrière die bestaat uit robuuste cel-celadhesies, die de luchtwegen van de longen beschermen tegen geïnhaleerde irriterende stoffen en ziekteverwekkers.
]. Allergenen en ziekteverwekkers kunnen vernauwing van de luchtwegen veroorzaken, waardoor het epitheel wordt blootgesteld aan een orde van grootte hogere spanning [
], waardoor structurele, biofysische en moleculaire veranderingen in het epitheel worden veroorzaakt die kunnen leiden tot hermodellering van de ECM en verlies van barrière-integriteit [
].
MS tijdens het pompen van bloed in bloedvaten
] reageren op veranderingen in de cyclische MS die ze ervaren als gevolg van bloedpompen, waardoor hun proliferatie en barrière-integriteit veranderen (Figuur I) [
]. Bij weefselmanipulatie leidt het primen van stamcellen tot MS tot weefselmanipulatie van vasculaire transplantaten met een hogere mechanische sterkte en een betere functie na implantatie in dieren [
].
Figuur IIllustratie van menselijke weefsels die differentiële mechanische rek (MS) ervaren bij gezondheid en ziekte.
], terwijl acuut toegepaste statische (zoals bij longletsel) versus chronische cyclische MS duidelijke effecten heeft op de AEC-functies en het lot [
] (Box 2). Dit onderstreept het belang van CSD's die onafhankelijke afstemming van parameters zoals rekomvang (geïnduceerde spanning), frequentie en richting mogelijk maken. Net als bij AEC's, verlengen endotheelcellen (EC's) die het binnenste lumen van bloedvaten bekleden zich loodrecht op de MS-richting en veranderen cel-ECM en cel-celadhesies op een spannings- en tijdsafhankelijke manier [
,
]. Blootstelling aan grote hoeveelheden (18%, zoals tijdens bronchospasmen van astmapatiënten) in vergelijking met fysiologische belasting (5%) brengt endotheliale schade in gevaar barrière integriteit als gevolg van de activering van extracellulaire signaalgereguleerde kinase (ERK) signalering en veranderingen in celcontractiliteit die ook verschillen wanneer MS statisch versus cyclisch wordt toegepast op cellen [
] (Figuur 1). Grote hoeveelheden, in vergelijking met fysiologische belasting, kunnen ook het transcriptieprofiel van EC's en hun glycocalyx (beschermende suikerzeefbekledingscellen) veranderen en ECM-remodellering induceren, wat kan bijdragen aan de vorming van atherosclerotische plaques [
]. Door de aandrijfmechanismen in realtime te onderzoeken, zou een beter begrip kunnen ontstaan van hoe bloedvaten beschadigd raken en hoe atherosclerose ontstaat. MS beïnvloedt mogelijk ook de dynamiek van vesiculaire transportprocessen, waaronder endocytose, en de daaropvolgende toename van celmembraanspanning [
,
]. Interessant is dat een recente in vivo studie toonde aan dat endocytische routes worden gereguleerd door rek-geactiveerde kanalen en kunnen worden geremd door MS [
]. Dit kan belangrijk zijn voor het ontwikkelen van betere methoden voor medicijnafgifte en voor het bestrijden van infecties, aangezien veel ziekteverwekkers vesiculair gemedieerde handel kapen om cellen te infecteren. Bovendien herprogrammeert blootstelling aan MS het EC-geheugen, dat behouden blijft, zelfs wanneer cellen post-MS op niet-elastische matrices worden geplaatst [
,
]. In overeenstemming met het idee van mechanisch geheugen, verbetert preconditionering van EC's met MS hun barrière-integriteit, een eigenschap die wordt benut voor het creëren van goed implanteerbare vaattransplantaten [
]. Om de (patho)fysiologie van weefsel en cellen beter te begrijpen, is het echter van het grootste belang om levende cellen in beeld te brengen tijdens blootstelling aan MS en niet pas daarna, zoals gewoonlijk wordt gedaan in onderzoekslaboratoria. De later gepresenteerde literatuur richt zich op CSD's die compatibel zijn met microscopie. CSD's die live-cell-beeldvorming mogelijk maken tijdens cyclisch uitrekken, worden ook benadrukt.
Stretching-platforms voor live-cell-beeldvorming van meercellige assemblages: technische overwegingen
], zijn er verschillende platforms voor het uitrekken van cellen ontwikkeld op basis van een reeks van bediening principes, inclusief in de handel verkrijgbare, met name de Flexcell (van Flexcell International) en StrexCell (van STREX Inc.) bioreactoren [
]. Die CSD's zijn gebruikt om biologische vragen van steeds toenemende complexiteit te beantwoorden, waaronder hoe MS verschillende cellulaire functies beïnvloedt [
]. Afhankelijk van de biologische vragen die worden gesteld, moeten verschillende parameters worden overwogen in termen van CSD-ontwerp, mogelijkheden en automatisering, waaronder: (i) compatibiliteit met live-cell beeldvormingsmodaliteiten met hoge resolutie; (ii) compatibiliteit met specifieke testen (bijv. infectietesten die specifieke toegang vereisen); (iii) compatibiliteit met (bio)mechanische karakteriseringsmethoden; (iv) biomimetische vermogens (bijv. richting(en) van uitgeoefende rek); en (v) mogelijkheid om tegelijkertijd andere fysieke signalen te integreren (bijv. afschuifvloeistofstroom) (Box 3). Later richten we ons specifiek op CSD-compatibiliteit met microscopie, met een speciale interesse in live-cell imaging. Wat het ontwerp van het apparaat betreft, vereist compatibiliteit met live-cell imaging (voornamelijk uitgevoerd met behulp van omgekeerde fluorescentie of confocale microscopen) een transparant, dun, uitrekkend membraan. Dergelijke membranen worden vervaardigd met behulp van elastomeer materialen, met name polydimethylsiloxaan (PDMS) of andere siliconen, en worden geactiveerd met behulp van motor bediening or pneumatische bediening vacuüm gebruiken. Andere bedieningsmodi (bijv. piëzo-elektrisch, elektromagnetisch) zijn aangetoond, maar deze worden niet vaak gebruikt [
,
].
Motorisch aangedreven celuitrekkende platforms
]. De onafhankelijk bestuurde motoren zijn aanpasbaar uniaxiaal en/of biaxiaal strekken patronen (Figuur 2A) op subconfluente interstitiële cellen van een hartklep. Cellen gekweekt in PDMS-putjes op dunne membranen (trekkrachtmicroscopie (TFM). Beeldvorming werd alleen uitgevoerd na uitrekken (in de zero-strain-configuratie). Vanwege de flexibiliteit van het membraan, de kleine dikte en de grote diameter van de celkweekput (22 mm), was een aangepaste puthouder met een dekglaasje nodig om het membraan tijdens de beeldvorming te ondersteunen en om te voorkomen dat het gewicht van de vloeistof wegglijdt. beeldvervorming veroorzaken. Dit zou het apparaat uiteindelijk incompatibel kunnen hebben gemaakt met live-cell-beeldvorming tijdens het strekken, aangezien de auteurs TFM uitvoerden in de configuratie zonder spanning (dwz na stopzetting van cyclisch strekken). Voordat ze hun eigen stretchplatform ontwikkelden, probeerde dezelfde groep soortgelijke onderzoeken met behulp van het STREX Cell Stretching System en Flexcell® Tension System [
]. STREX maakt gebruik van een op PDMS gebaseerde celkweekkamer en een uiterst nauwkeurige stappenmotor voor een consistent bewegingsbereik bij verschillende snelheden en rekverhoudingen. STREX biedt twee belangrijke CSD's: apparaten die langdurig uitrekken met hoge doorvoer mogelijk maken en apparaten die op een microscoop kunnen worden gemonteerd voor live-cell imaging. Echter, net als bij andere PDMS-apparaten, wordt beeldvorming meestal uitgevoerd voor en na het uitrekken en real-time beeldvorming is alleen mogelijk bij een lage (~ 10×) vergroting [
,
,
]. Uniaxiaal en biaxiaal strekken kunnen niet op één enkel platform worden gecombineerd. Flexcell®-apparaten worden pneumatisch aangedreven, maar zijn niet compatibel met omgekeerde microscopen, aangezien flexibele siliconenmembranen worden ondersteund door laadpalen [
]. Tot slot worden er ook membraanvrije apparaten ontwikkeld, zoals het voorbeeld van Duda c.s.., waarbij een handmatige CSD werd gebruikt om a Drosophila melanogaster vleugelschijf opgehangen tussen twee PDMS-microkanalen gevuld met vloeibare media. Dynamisch strekken werd niet uitgevoerd (één strekcyclus per enkele minuten en tot 2 uur), waardoor live beeldvorming met behulp van een confocale microscoop met draaiende schijf mogelijk was [
].
Figuur 2Veelgebruikte activeringsprincipes in celuitrekkende apparaten (CSD's) en manieren van uitrekken.
(A) Wijzen van uitrekken. Van links, uniaxiaal, biaxiaal, equibiaxiaal. Deze illustratie is niet bedoeld om de celuitlijning bij het uitrekken te tonen in vitro. (B) Voorbeeld van pneumatisch aangedreven CSD. In dit apparaat worden celkweekputten geflankeerd door (of omgeven door, in het geval van circulaire apparaatarchitecturen) aandrijfkamers. Elastomeer celkweekmembranen zijn aan de apparaten gehecht. Wanneer vacuüm wordt aangebracht op de aandrijfkamers, wordt het celkweekmembraan samen met de daarop gekweekte cellen uitgerekt. (C) Voorbeeld van een door een motor aangedreven CSD. In dit apparaat is een elastomeer membraan via een klem aan een elektromotor bevestigd. De elektromotor trekt aan het celkweekmembraan en rekt het uit, waardoor de cellen die eraan vastzitten, worden belast.
Pneumatisch aangedreven celuitrekkende platforms
]. Deze CSD bestond uit een celkweekkamer geflankeerd door twee aandrijfkamers en werd afgesloten met een 125 μm dik celkweekmembraan (Figuur 2B). Bij vacuümtoepassing werd de celmonolaag die zich in de celkweekkamer bevond continu (in tegenstelling tot cyclisch) uniaxiaal uitgerekt bij toenemende spanning en werd gelijktijdig waargenomen met behulp van doorvallend licht, time-lapse-microscopie gedurende ~ 7 uur met tussenpozen van 1 uur. De optische focus werd echter handmatig aangepast tijdens het uitrekken, een niet-optimaal kenmerk, vooral als langere/kortere beeldacquisitie-intervallen gewenst zijn. Soortgelijke configuraties worden gebruikt op organ-on-chip-platforms, waar gesuspendeerde elastomeermembranen uniaxiaal pneumatisch worden aangedreven via flankerende kamers die intestinale peristaltiek of ademhaling nabootsen [
]. Ondanks de biomimetische aard van organ-on-chips, worden beeldvormingsmogelijkheden belemmerd door de grote afstand tussen het microscoopobjectief en de cellen, meestal meer dan 200 μm. Een andere beeldgerelateerde beperking van apparaten die zwevende membranen gebruiken, komt voort uit de meerdere materiaalinterfaces die de cellen en het microscoopobjectief scheiden (bijv. Interfaces tussen vloeibare media en elastomeren) [
]. Naast uniaxiaal uitgerekte celkweekkamers, zijn ook circulaire CSD's aangetoond die compatibel zijn met live-cell-beeldvorming met hoge resolutie, waarbij gebruik wordt gemaakt van celkweekputten omgeven door aandrijfringkamers die zijn afgedicht met dunne elastomere celkweekmembranen. Wanneer vacuüm wordt toegepast op de aandrijfringkamer, wordt een uniforme equibiaxiale spanning geproduceerd over de celmonolaag. Equibiaxiaal strekken, in tegenstelling tot eerder besproken uniaxiaal, kan vaak de spanningspatronen die cellen ervaren beter nabootsen in vivo, afhankelijk van het weefsel van belang (bijv. IEC's tijdens peristaltiek). Kreutzer c.s.. rapporteerde zo'n cirkelvormig rekplatform en gebruikte het om cardiale differentiatie van pluripotente stamcellen te induceren [
]. Live-cell imaging werd uitgevoerd met behulp van een omgekeerde microscoop. Toen echter vacuüm werd aangebracht op de bedieningskamer, werd het celkweekmembraan met ~ 315 μm verplaatst in de z-richting. Hoewel een verplaatsing buiten het vlak te verwachten is bij pneumatische bediening van elastomeermembranen, wordt deze beperking niet vaak besproken in de literatuur, ondanks dat deze schadelijk is voor microscopie met levende cellen. Om dit probleem op te lossen, Kreutzer c.s.. handmatig opnieuw scherpgesteld tussen rekcycli en gebruikte objectieven met een lage vergroting om het effect van verplaatsing op de beeldkwaliteit te minimaliseren [
], vergelijkbaar met wat Hart c.s.. gemeld [
].
Live-cell imaging tijdens cyclisch uitrekken
]. In een eerder werk werd een vergelijkbare circulaire pneumatische CSD gebruikt om homogene equibiaxiale spanning uit te oefenen op epitheelcellen en celmatrixspanningen in kaart te brengen vóór, tijdens en na uitrekking [
]. De auteurs merkten ook op dat uitrekken resulteerde in laterale celverplaatsing en onscherpte. Voor TFM- en live-cell-beeldvorming werd elke 2 minuten handmatige herpositionering/herfocussering uitgevoerd (dwz na elke rekcyclus). In een andere studie werd een vergelijkbare CSD gebruikt om de mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan epitheelfracturen tijdens het strekken, aangezien dit relevant is in veel weefsels, waaronder de huid [
]. De CSD bestond uit een PDMS-membraan (80-100 μm dik) geklemd tussen twee teflonringen en bovenop een ronde laadpaal geplaatst. Aanbrengen van vacuüm op het buitenste ringvormige gebied van het membraan veroorzaakte een uniforme equibiaxiale spanning over het membraan. Het celkweekgebied was groot genoeg om objectieve toegang aan de boven- en onderkant mogelijk te maken, waardoor het compatibel was met omgekeerde en rechtopstaande optische microscopie. Interessant is dat, ondanks de gebruikte circulaire pneumatische CSD, live-cell beeldvorming werd aangetoond tijdens cyclisch uitrekken en dat veelvoorkomende problemen zoals beeldvervorming als gevolg van mediagewicht of verplaatsing van het membraan buiten het vlak tijdens het uitrekken niet werden besproken. Gezien de relatief lage reksnelheid (10 min rekpuls uitgevoerd elke 30 min) en de vrij korte lengte van experimenten (enkele rekpulsen getoond), is het mogelijk dat de focus na elke rekcyclus opnieuw werd aangepast om te corrigeren voor membraanafbuiging. Tabel 1 geeft een overzicht van belangrijke kenmerken van enkele van de besproken CSD's.
Tabel 1Apparaatvoorbeelden en hun compatibiliteit met microscopie
Beeldvorming van cellen onder MS om de overspraak van celbiochemie en -mechanica te onderzoeken
Hoewel technisch uitdagend, zijn er pogingen gedaan om blootstelling van cellen aan MS te koppelen in vitro met beeldvorming. Dergelijke studies leverden belangrijke inzichten op in hoe cellen functioneren als reactie op MS, hoe ze biomechanische input omzetten in signalering, en hoe dit relevant is in biologische en biomedische contexten. Later schetsen we enkele baanbrekende onderzoeken in de hoop de verdere ontwikkeling van CSD's aan te moedigen voor een betere koppeling met live-cell imaging tijdens stretching.
]. Dit werd toegeschreven aan pendelen van motoreiwit myosine II van het cytoplasma naar de celcortex, terwijl herstel werd gemedieerd door een toename van actinecontractiliteit van myosine, waarschijnlijk doordat myosine II terug in het cytoplasma wordt getransporteerd. Hoewel niet onderzocht, kunnen veranderingen in cel-cel- en cel-ECM-krachten, waartussen een hoge mate van overspraak bestaat, de oorzaak zijn van de veranderingen in celsnelheid [
,
,
]. Het meten van deze krachten kan tijdsafhankelijke veranderingen in barrière-integriteit aan het licht brengen wanneer het epitheel wordt uitgedaagd door MS. Inderdaad, cel-celovergangen worden hermodelleerd op een spanningsafhankelijke manier en kunnen de spanningsopbouw bij lage spanningssnelheden verminderen om het falen van knooppunten te voorkomen [
]. Wanneer de omvang en duur van de rek echter hoog is, veroorzaakt het uitrekken van het epitheelweefsel scheurvorming bij het loslaten van de rek, waarvan de oorsprong niet trekkracht is, maar eerder hydraulisch.
]. Dat wil zeggen, epitheelscheuren zijn het gevolg van drukopbouw in de ECM tijdens rek, wat de hypothese ondersteunt dat epitheelintegriteit afhangt van een sterke koppeling tussen weefselrek en ECM-hydraulica. Met behulp van een vergelijkbare pneumatisch aangedreven CSD toonde een eerdere baanbrekende studie (samen met verdere studies die volgden) aan dat wanneer MS tijdelijk wordt toegepast op cellen met hoge spanning of snelheid, cellen universeel fluïdisatie ondergaan, waardoor hun stijfheid vermindert en hun cytoskelet uiteenvalt, maar later stadia die ze opnieuw kunnen stollen [
,
,
]. Tegelijkertijd neemt de tractiespanning die door cellen wordt uitgeoefend op hun ECM toe bij acute statische MS, maar daalt tot onder de basislijnniveaus bij het loslaten van MS, wat impliceert dat potentiële energie door cellen wordt gebruikt om hun cytoskelet te reorganiseren en spanning te herverdelen [
]. De grootte- en reksnelheidafhankelijke veranderingen in de mechanische responsiviteit van weefsels en samenstellende cellen bij MS zijn ook waargenomen in vivo [
]. Of deze tijdsafhankelijke overgangen die cellen ondergaan tijdens MS voldoende zijn om een blijvend mechanisch geheugen op te bouwen, blijft een actief onderzoeksgebied, deels vanwege de relevantie ervan voor weefselmanipulatie [
,
].
]. Post-MS-beeldvorming werd gebruikt om het effect van MS op de overleving van getransformeerde kankercellen uit verschillende weefsels te onderzoeken in vitro. Het werk was gemotiveerd door eerdere studies met muizen met kanker, die werden onderworpen aan MS of lichaamsbeweging en een mechanische krachtafhankelijke remming van tumorgroei vertoonden [
,
]. Met behulp van een pneumatisch aangedreven CSD werd ontdekt dat MS de groei van kankercellen remt en apoptose ('mechanoptose') veroorzaakt, tegengesteld aan wat in normale cellen gebeurt. Deze bevindingen zouden verder kunnen worden benut om op MS gebaseerde kankertherapieën te ontwikkelen. In tegenstelling tot deze studie, wanneer epitheelcellen in monolaag werden gemengd met oncogeen getransformeerde cellen onder stationaire omstandigheden, konden ze de getransformeerde cellen verwijderen via extrusie. Wanneer ze echter werden uitgerekt in een pneumatisch aangedreven CSD, bleven getransformeerde cellen in de monolaag als gevolg van veranderingen in hun focale adhesie dynamiek en actomyosine-contractiliteit, wat een invasief kankerachtig fenotype bevordert [
]. De discrepantie tussen deze bevindingen zou kunnen worden verklaard door het feit dat in het laatste geval celconcurrentie plaatsvond in een 'overvolle' monolaag en niet in subconfluente cellen. Beeldvorming tijdens MS zou kunnen helpen verduidelijken hoe deze celdichtheidsafhankelijke veranderingen ontstaan. Desalniettemin benadrukken beide studies het belang van het overwegen van MS tijdens in vitro experimenten met betrekking tot kanker.
]. Bij weefselrek en op korte tijdschalen vormde myosine II asymmetrische kabels gerelateerd aan actine-remodellering. Auteurs stelden voor dat dit een snelle reactie is om het weefsel te verstijven in een poging mechanische verstoringen te bufferen en de vorm te behouden. Toekomstige ontwikkelingen zouden het mogelijk kunnen maken om te onderzoeken hoe variatie in MS-omvang en -frequenties de weefselontwikkeling kan beïnvloeden. Bovendien, in het kader van ontwikkeling [
] en tijdens wondgenezing [
], MS-gevoelige ERK-activering die sneller in golven van de ene cel naar de andere reist dan alleen diffusie, is naar voren gekomen als een belangrijk mechanochemisch proces dat cellulaire motiliteit en weefselorganisatie orkestreert. Mechanische krachten zijn nauw gekoppeld aan cellulaire signalering, waardoor celpolarisatie en collectieve celmigratie worden gestuurd [
,
]. Deze onderzoeken zijn gebaseerd op Förster resonantie energieoverdracht (TOBBEN)-gebaseerde biosensoren ontworpen om ERK-activering in tijd en ruimte te volgen met behulp van microscopiemodaliteiten. Het combineren van dergelijke metingen met biomechanische technieken (bijv. TFM) bewees ondubbelzinnig het belang van het ondervragen van de overspraak tussen mechanica en biochemische signalering om te begrijpen hoe weefsels worden gevormd en hoe ze terugkeren naar homeostase na beledigingen (bijv. een wond). Aangezien ERK wordt geactiveerd door MS, zouden toekomstige ontwikkelingen het mogelijk kunnen maken de rol van cyclische MS te bepalen, aangezien het in zoveel weefsels voorkomt en deelneemt aan het reguleren van de dynamiek van signaalgebeurtenissen in meercellige samenstellingen, zoals die worden gezien bij ERK-activering in stationaire culturen.
Slotopmerkingen en toekomstperspectieven
]. Ten slotte moeten voor time-lapse-beeldvorming, en afhankelijk van de complexiteit en frequentie van rekpatronen, automatiseringsvereisten worden overwogen.
Een grote verscheidenheid aan biologische en biomedische vragen zou kunnen worden beantwoord met behulp van celuitrekkende platforms in combinatie met gelijktijdige of daaropvolgende live-cell imaging. Hun toepassing is echter beperkt, ondanks enkele commerciële mogelijkheden. Wat houdt de huidige CSD tegen van brede toepassing? Hoe kunnen CSD's zo worden gebouwd dat ze ook experimenten met hoge doorvoer en compatibiliteit met videomicroscopie mogelijk maken? De meeste live-cell microscopie-beeldvorming tijdens cyclisch uitrekken wordt uitgevoerd met behulp van lage reksnelheden en lange intervallen tussen beeldacquisities van cellen die zich op 2D-matrices bevinden. Kunnen we de processen achter verschillende ziekten die verband houden met defecten in mechanotransductie beter begrijpen door betere celuitrekkende platforms te ontwikkelen die live-cell-beeldvorming mogelijk maken tijdens cyclisch uitrekken met hoge snelheden op zowel 2D- als 3D-matrices? Welke beperkingen met betrekking tot live-cell imaging tijdens het strekken kunnen worden losgekoppeld van het gebruikte strekapparaat en worden gecompenseerd door gespecialiseerde microscoopapparatuur? Wat zou een ideale microscoop bevatten voor beeldvorming van levende cellen tijdens het strekken? Zou een dergelijk systeem het mogelijk maken om FRET-beeldvorming of andere soorten meer geavanceerde beeldvormingsmodaliteiten uit te voeren om informatie te extraheren over de dynamiek van biochemische celsignaleringsprocessen tijdens MS-toepassing? Zou men tegelijkertijd de tractiekrachten kunnen meten die door cellen worden uitgeoefend op hun ECM (bijv. met behulp van TFM) en op naburige cellen in monolaag, wat kan worden beschouwd als een proxy voor barrière-integriteit? Zou men verder kunnen onthullen hoe cellulaire biomechanica overspraak maakt met biochemische signalering tijdens MS, waardoor het gebied van mechanobiologie wordt versneld? De meeste elastomeermembranen die bij rekexperimenten worden gebruikt, zijn op silicium gebaseerd. Kunnen rekexperimenten baat hebben bij niet op siliconen gebaseerde membranen? Zijn er veelbelovende kandidaat-materialen die ook langdurige beeldvorming van levende cellen mogelijk maken? Zouden dergelijke ontwikkelingen het gebied van weefselmanipulatie ten goede kunnen komen door de mechanische sterkte en werking van gemanipuleerd weefsel verder te vergroten om uiteindelijk succesvolle implantatie bij patiënten te verbeteren?
Begrippenlijst
actine
belangrijk eiwit van het cytoskelet dat (de)polymeriseert om lange, dynamische filamenten in cellen te vormen, die celvorm en krachttransductie ondersteunen, die essentieel zijn voor bijvoorbeeld celmotiliteit.
Aansturing
verwijst naar actuatoren, onderdeel van een apparaat of systeem dat het helpt om fysieke beweging te bereiken door energie om te zetten in mechanische kracht.
Barrière integriteit
mechanisme van regulatie van intercellulaire adhesies voor cellen in monolaag, dat de doorlaatbaarheid van bijvoorbeeld essentiële ionen, voedingsstoffen en water mogelijk maakt, maar de toegang van beledigingen (bijv. pathogenen) beperkt.
Cel-stretching platform
compleet celreksysteem dat een CSD omvat, evenals alle andere gerelateerde hardware en software die nodig is om een celrekexperiment uit te voeren.
Elastomeer materialen
polymeren die rubberachtige elasticiteit vertonen, zijn maatvaste, maar elastisch vervormbare kunststoffen met een lage Young-modulus.
Extracellulaire matrix (ECM)
groot netwerk van eiwitten en andere moleculen die cellen en weefsels in het lichaam omringen, ondersteunen en structuur geven.
Extracellulaire signaalgereguleerde kinase (ERK)
rekgevoelige proteïnekinase die, na activatie, celprocessen zoals proliferatie, differentiatie, migratie en celcyclus reguleert.
Focale verklevingen
complexen aan de basale zijde van cellen die verankering aan de ECM mogelijk maken en die grotendeels zijn samengesteld uit transmembraan heterodimere eiwitten die integrinen worden genoemd.
Förster resonantie energieoverdracht (FRET)
de overdracht van energie van een fluorescerende donor in de aangeslagen toestand naar een acceptor in de grondtoestand, die kan worden gekwantificeerd via FRET-microscopie met behulp van geschikte sensoren.
hysteresis
een verandering in de toestand van een systeem die niet alleen afhangt van huidige inputs, maar ook van eerdere inputs (dwz de geschiedenis ervan).
Omgekeerde microscoop
omgekeerde of rechtopstaande microscopen hebben objectieven onder of boven de tafel die het monster vasthoudt (dwz het monster wordt respectievelijk van onderaf of van bovenaf afgebeeld).
Mechanobiologie
veld op het grensvlak van biologie en mechanica, onderzoek naar de overspraak tussen biologische en mechanische eigenschappen van cellen en weefsels en hoe deze cel- en weefselfuncties reguleren.
Motorische bediening
elektrische signalen omzetten in beweging met behulp van een motor.
Myosine II
moleculair motoreiwit dat cellulaire vrije energie kan omzetten in biologisch werk door langs actinefilamenten in de cel te glijden.
Pneumatische bediening
omzetting van perslucht- of vacuümenergie in mechanische krachten die beweging tot gevolg hebben.
Spanning
in de natuurkunde, een maat voor vervorming. Het meet de verandering in configuratie ten opzichte van de oorspronkelijke toestand wanneer er spanning wordt uitgeoefend (bijv. tijdens uitrekken).
Trekkrachtmicroscopie (TFM)
techniek om de krachten te meten die cellen op hun ECM uitoefenen, wat kan worden beschouwd als een proxy voor hoe goed focale adhesies zijn georganiseerd en verbonden met het onderliggende cytoskelet.
Uniaxiaal en/of biaxiaal strekken
uniaxiaal, zich uitstrekkend langs één as; biaxiaal, zich uitstrekkend langs twee assen; equibiaxiaal, zich gelijkmatig langs alle assen uitstrekkend.
- Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
- Platoblockchain. Web3 Metaverse Intelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
- Bron: https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(22)00332-8?rss=yes
