세포 배양

갈색 지방세포는 이전에 설명한 대로 B. Spiegelman(Harvard University)이 친절하게 제공한 불멸의 갈색 전지방세포 마우스 세포주에서 분화되었습니다.¹⁹. 지방전구세포는 50% 소태아혈청(Sigma-Aldrich), 20mM HEPES(Sigma-Aldrich)가 보충된 성장 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 고글루코스(Gibco))에서 낮은 합류(<20%)로 유지되고 확장되었습니다. 및 100U ml^{- 1} 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)). 분화를 위해 지방전구세포를 인산염 완충 용액(PBS)(Gibco, pH 7.4, 1X)으로 23,000회 세척하고 TrypLE Express로 해리한 후 약 XNUMX 세포 cm 밀도로 접종했습니다.^{- 2} 성장 매체에서. 24시간 후에 배지를 분화 배지(Dulbecco's Modified Eagle's 배지, 고글루코스, 10% 태아 소 혈청, 20nM 인슐린, 1nM 삼요오드티로닌 및 100U ml가 보충된)로 교체했습니다.^{- 1} 페니실린-스트렙토마이신) 및 세포를 2일 동안 배양하였다. 이후 유도배지(0.125mM 인도메타신, 0.5μM 덱사메타손 및 0.5mM 이소부틸 메틸크산틴이 보충된 분화배지)를 2일 동안 첨가하여 세포 분화를 유도한 후, 추가로 8일 동안 배지를 분화배지로 교체하였다. 분화된 지방세포를 기아 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 저글루코스(Gibco), 최종 농도가 0.5 mM이 되도록 포도당이 보충된, 100% 소 혈청 알부민(Sigma-Aldrich) 및 XNUMX U ml)로 XNUMX회 세척했습니다.^{- 1} 페니실린-스트렙토마이신)을 사용하고, 본문에 표시된 시간 동안 기아 배지에 희석된 인슐린 NanoRods 또는 NanoRods로 처리하기 전에 기아 배지에서 2시간 동안 배양했습니다. 처리 후, 세포를 PBS에서 18회 세척하고 면역블롯을 위한 단백질 또는 유전자 발현을 위한 RNA를 분리하기 위해 수확했습니다. DNA-PAINT에 의한 IR 분석을 위해, 전지방세포는 다음과 같은 변형을 통해 위에서 설명한 대로 분화되었습니다. 유도 배지로 처리한 후, 세포를 TrypLE Express로 분리하고 μ-Slide 2 Well Glass Bottom 웰(ibidi)의 분화 배지에 접종했습니다. 2일 후, 세포를 기아 배지에서 10시간 동안 배양한 후, 기아 배지에서 10nM 인슐린으로 XNUMX분 동안 처리하였다. 대조 실험에서는 인슐린 첨가가 생략되었습니다. 치료 전 분화된 지방세포를 육안으로 분석하여 세포 표면밀도를 평가하고 세포의 분화도를 평가한 후 무작위로 치료군과 대조군으로 배정하였다.

세포는 5% CO를 함유한 가습된 대기에서 유지, 확장 및 분화되었습니다.₂ 37 °C에서.

IR의 DNA-PAINT

분화된 지방세포를 PBS 중 미리 데워진 12% 파라포름알데히드로 실온(RT)에서 4분 동안 고정하고, PBS로 90회 세척하고, 차단 용액(3.0% 소태아혈청/0.1% Triton X)으로 실온에서 100분 동안 차단했습니다. -4 in PBS) 토끼 항-IR β 항체(Cell Signaling(8B1); 차단 용액에서 300:2 희석)와 함께 4°C에서 1일 동안 배양했습니다. 그런 다음 세포를 PBS로 200회 세척하고 차단 완충액(Massive Photonics)에 1:80으로 희석된 나노바디 FluoTag-XM-QC 항토끼 IgG(Massive Photonics)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양했습니다. PBS로 세 번 세척한 후, 세포를 5nm 금 나노입자(Sigma-Aldrich; 차단 완충액에서 10:5 희석)와 함께 3분 동안 배양했습니다. 세포를 PBS로 XNUMX회 세척하고 이미지 버퍼(Massive Photonics)에 희석된 XNUMXnM CyXNUMXb 표지 가닥(Massive Photonics)과 함께 배양했습니다.

이미징은 Perfect Focus 시스템(Nikon Instruments)을 갖춘 Nikon ECLIPSE Ti-E 현미경에서 수행되었으며, 오일 침지 방식의 iLAS2 원형 전반사 형광 모듈(Gataca Systems)을 사용하여 대물렌즈형 내부 전반사 형광 구성을 적용했습니다. 1.49nm의 최종 픽셀 크기에 해당하는 ×100 보조 Optovar 배율이 장착된 1.5개 조리개 CFI Plan Apo 내부 전반사 형광 ×87 대물렌즈(Nikon Instruments). 사용된 레이저는 감소된 필드 초해상도 이미징에 최적화된 맞춤형 iLas 입력 빔 확장 광학 장치(Cairn)를 갖춘 OBIS 561nm LS 150mW(Coherent)였습니다. 먼저 여기 쿼드밴드 필터, 쿼드밴드 이색성 필터 및 쿼드밴드 방출 필터(ZET89901/405/488/561x, ZET640/405/488/561bs 및 ZET640)가 포함된 필터 큐브(405, Chroma Technology)에 형광등 광선을 통과시켰습니다. /488/561/640m, 크로마 기술). 그런 다음 형광등을 방출 필터(ET595/50m, Chroma Technology)를 사용하여 스펙트럼 필터링하고 iXon Ultra 888 전자 증배 전하 결합 장치 카메라(Andor)에서 이미지화했습니다. Micro-Manager 소프트웨어 v. 1.4를 사용하여 12,000MHz 판독 프레임, 10ms 노출 및 전자 증배 이득 없이 130개 프레임을 획득했습니다. 세 번의 독립적인 실험에서 얻은 총 XNUMX개의 세포가 각 조건에서 이미지화되었습니다(보주 및 보충 그림 1).

INS-DNA 생산 및 정제

인슐린 (머크, 1mg ml^{- 1})를 디벤조사이클로옥틴-설포-와 반응시켰다.N-690 mM Na 중 하이드록시숙신이미딜 에스테르(DBCO-sulfo-NHS, 클릭 화학 도구, 100 μM)₂CO₃ 실온에서 11.5분 동안 완충액(pH 20). 그런 다음 Tris 염기(Sigma-Aldrich, 5mM)를 첨가하여 반응을 100분 동안 켄칭했습니다. 용액을 400μl의 100mM Na로 XNUMX회 세척하였다.₂CO₃ 0.5 kDa 컷오프 멤브레인(Merck)이 있는 Amicon Ultra 3 ml 원심분리 필터 장치를 사용합니다. 각 세척 단계에서 컬럼을 10×에서 14,000분 동안 회전시켰습니다.g. 최종 세척 단계 후, 인슐린-DBCO(690μM)를 아지드 변형 DNA(Biomers, 35μM, 보충 표)와 혼합했습니다. 3) 100mM Na에서₂CO₃ 실온에서 3시간 동안 반응하도록 방치하였다. NaN을 첨가하여 반응을 중단시켰다.₃ (시그마-알드리치, 6.9mM). 샘플을 천연 폴리아크릴아미드 겔(6X TAE, 19분, 1V, TAE 실행 완충액 중 1% 20:200 폴리아크릴아미드)에서 실행하고 INS를 확인하기 위해 제조업체의 지침에 따라 SYBR Gold(Thermo Fisher)로 염색했습니다. DNA 형성. ImageQuant LAS 4000 젤 이미저를 사용하여 이미징을 수행했습니다. 인슐린-DBCO-설포-NHS 접합 프로토콜은 ssDNA 올리고의 B 사슬(B29 라이신)의 라이신-29에 대한 결합을 촉진하기 위해 최적화되었습니다. N 인슐린 A 및 B 사슬의 말단. B29 아민의 pKa 값은 두 아민의 pKa 값보다 높습니다. N 종단(11.2 대 8.6 및 6.8). 높은 pH에서 가교제의 NHS 그룹은 가장 기본적인 아민 그룹인 B29 라이신 아민과 우선적으로 반응할 것으로 예측됩니다.³². 따라서 단일 INS-DNA 생성물을 촉진하기 위해 pH 반응 조건이 최적화되었습니다.

INS-DNA 반응 혼합물을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 C로 정제했습니다.₁₈ 컬럼(Agilent Poroshell 120 EC-C₁₈) Amersham Pharmacia Biotech AKTA Ettan LC에서. 완충제 A(50mM 트리에틸아민 아세테이트) 및 완충제 B(90% 아세토니트릴 및 10% 완충제 A)를 구배 프로파일로 사용했으며, 여기서 완충제 B의 백분율은 30분에 걸쳐 50%에서 20%로 증가했습니다. 분획을 수집하고 진공 농축기(Thermo Scientific SpeedVac Savant DNA 120)에서 30분 동안 고열에서 회전시켜 고성능 액체 크로마토그래피 완충액의 휘발성 성분을 제거했습니다. 선택된 피크는 0.5 kDa 컷오프 멤브레인(Merck)이 있는 Amicon Ultra 3 ml 원심분리 필터 장치를 사용하여 10×에서 14,000분 동안 XNUMX회 회전하여 PBS로 완충제 교환되었습니다.g 매번 400μl PBS로 세척합니다. 정제된 분획의 샘플을 천연 폴리아크릴아미드 겔에서 실행하고 SYBR Gold(Thermo Fisher)로 염색하여 정제된 INS-DNA를 시각화했습니다. 접합체의 최종 순도는 세 가지 방법을 통해 모든 제조에 대해 분석되었습니다. 나트륨 도데실 황산염-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Invitrogen, 4-12% Bolt 겔)과 인슐린 표준(Merck)의 은 염색 밴드 강도(Pierce Silver Stain Kit) 비교 , DNA 표준(Integrated DNA Technologies)과 Qubit ssDNA 분석 키트(Qubit 4 Fluorimeter, Invitrogen)를 통한 기본 폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 SYBR Gold 밴드 강도 비교. INS-DNA의 최종 농도는 Qubit ssDNA 측정을 기반으로 계산되었습니다. 정제된 INS-DNA를 동결하고 추가 사용 전까지 -20°C에서 보관했습니다.

NanoRod 및 인슐린 NanoRod 생산

스캐폴드 플라스미드 DNA(p7560, Tilibit, 10nM)를 적절한 스테이플 가닥(Integrated DNA Technologies, 100nM)과 혼합하여 종이 접기 구조를 준비했습니다(보충 표). 4-9) 폴딩 완충액(pH 5.0에서 8.5mM Tris(Sigma-Aldrich), 1.0mM EDTA(Panreac AppliChem) 및 12.5mM MgCl₂ (시그마-알드리치)). 그런 다음 혼합물을 열 순환기(MJ Research PTC-225 Gradient Thermal Cycler)에 넣고 80.0분 동안 5°C로 가열하고 60.0분에 걸쳐 분당 1.0°C로 20°C로 냉각한 다음 천천히 20.0°C로 냉각하여 어닐링했습니다. 분당 0.5°C에서 °C. 0.5 kDa 컷오프 멤브레인(Merck)이 있는 Amicon Ultra 100 ml 원심분리 필터 장치를 사용하여 2×에서 14,000분 동안 XNUMX회 회전하여 과잉 스테이플을 제거했습니다.g 매번 400μl의 폴딩 완충액으로 세척합니다. 정제된 구조의 농도는 260 nm에서 DNA 흡광도를 측정하여 결정되었습니다(Thermo Scientific NanoDrop 2000). 그런 다음 정제된 INS-DNA를 NanoRod 구조의 이용 가능한 확장된 가닥 결합 부위에 3x 화학량론적 과잉으로 첨가하고 37.0시간 동안 1°C로 가열하고 분당 22.0°C로 0.1°C로 냉각하여 열순환기에서 어닐링했습니다. 22.0°C에서 14시간 동안 배양하고 분당 4.0°C로 0.1°C까지 냉각합니다. 결합되지 않은 INS-DNA는 0.5 kDa 컷오프 멤브레인(Merck)이 있는 Amicon Ultra 100 ml 원심분리 필터 장치를 사용하여 제거되었으며, 2×에서 14,000분 동안 XNUMX회 회전했습니다.g PBS + 400mM MgCl 10μl로 매번 세척₂. 인슐린 NanoRod는 추가 사용 전까지 4°C에서 보관되었습니다.

아가 로스 겔 전기 영동

NanoRod 구조는 4V에서 70시간 동안 얼음 위의 아가로스 겔에서 샘플을 실행하여 분석되었습니다. 겔은 2x TBE 완충액(Panreac AppliChem)과 0.5mM MgCl 중 10% 아가로스(Thermo Scientific TopVision Agarose)로 구성되었습니다.₂ (Sigma-Aldrich) 및 1× SYBR Safe DNA 염색(Invitrogen). ImageQuant LAS 4000 젤 이미저를 사용하여 이미징을 수행했습니다.

동적 광산란

NanoRod 및 인슐린 NanoRod 샘플은 PBS + 10mM MgCl에서 준비되었습니다.₂, 0.1 μm 멤브레인(Merck)을 사용하여 주사기로 여과하고 Zetasizer Ultra 기기(Malvern Panalytical)에서 분석했습니다. 저용량 셀(ZSU25)에서 1002°C에서 XNUMX회 측정을 수행한 후 평균을 냈습니다.

NanoRod의 oxDNA 시뮬레이션

NR, NR-1, NR-2, NR-4, NR-7 및 NR-15 구조는 oxDNA 거친 입자 모델링을 사용하여 분석되었습니다(https://oxdna.org/). 인슐린 통합 부위에서 확장된 dsDNA 가닥을 가진 NanoRod 구조는 vHelix를 사용하여 생성되었으며 tacoxDNA 웹 사이트를 사용하여 oxDNA 형식으로 변환되었습니다.http://tacoxdna.sissa.it/). 구조물은 oxDNA.org 37°C에서 시뮬레이션을 위한 웹 서버(염분 농도는 1, 1 × 10⁸ 광고가 포함된 시간 단계t 값은 0.0001이고 기본 매개변수를 사용하는 예비 완화 단계입니다. oxView 도구를 사용하여 시뮬레이션을 시각화하고 비디오를 제작했습니다.https://oxdna.org/).

음성 염색 TEM

정제된 NanoRod(10nM)를 글로우 방전 탄소 지지 구리 TEM 그리드(TEM-CF200CU50, Thermo Fisher Scientific)에 분배하고 용액을 제거하기 전에 60초 동안 배양했습니다. 그런 다음 그리드를 10μl의 5% w/v 우라닐 포르메이트로 2초 동안 염색한 후 제거했습니다. 염색 절차는 30회 반복되었으며 TEM 그리드는 이미징 전에 120분 동안 공기 건조되었습니다. 근거리 시야를 위해 Talos 2C G120(92,000kV, Ceta-D 검출기)에서 ×1.53으로 이미징을 수행했습니다. 원시 이미지는 ImageJ 소프트웨어(vXNUMX)를 사용하여 처리되었습니다.

AFM

NanoRod 구조는 에폭시 접착제로 현미경 슬라이드 중앙에 고정되고 Reprorubber를 사용하여 슬라이드에 부착된 플라스틱 링으로 둘러싸인 운모 디스크에 이미지화되었습니다. 나노구조물은 TE-Mg 완충액(1mM Tris 염기, 5mM EDTA, 1mM MgCl)에서 10nM로 희석되었습니다.₂, pH 8.0) 및 10 μl를 새로 절단된 운모에 피펫으로 주입했습니다. 30초 후, 4mM NiSO 5μl₄ 첨가하고 추가로 4.5분 동안 배양하였다. 그런 다음 표면을 1.0 μm 여과된 TE-Mg 완충액 0.1 ml로 헹구고 이미징을 위해 여과된 TE-Mg 완충액 1.5 ml를 운모 디스크에 첨가했습니다. 이미징은 ac 모드에서 Bruker AC3 캔틸레버를 갖춘 JPK Instruments NanoWizard 40 Ultra 원자력 현미경을 사용하여 액체에서 수행되었습니다.

인슐린 NanoRod 나노구조의 DNA-PAINT

μ-슬라이드 18 웰 유리 바닥 웰(ibidi)을 이소프로판올로 세척하고 NXNUMX로 건조시켰습니다.₂. 웰을 1 mg ml 와 함께 배양했습니다.^{- 1} 완충액 A(pH 10에서 100mM Tris-HCl, 0.05mM NaCl 및 20%(v/v) Tween 8.0)에 들어 있는 비오틴 소 혈청 알부민(Thermo Fisher)을 실온에서 5분 동안 완충액 A로 0.5회 세척하고 XNUMXmg/ml^{- 1} RT에서 5분 동안 완충액 A에 뉴트라비딘(Thermo Fisher)을 넣습니다. 그런 다음 웰을 완충액 A로 5회 세척한 후 완충액 B(10mM Tris-HCl, XNUMXmM MgCl)로 XNUMX회 세척했습니다.₂, 1mM EDTA 및 0.05%(v/v) Tween 20, pH 8.0). 그런 다음, 500개의 비오틴 표지 DNA 가닥을 포함하는 XNUMXpM NanoRod(확장 데이터 그림 XNUMX) 2a), 9-뉴클레오티드 PAINT 도킹 서열을 포함하는 INS-DNA 포함(DS1; 보충 표 3)를 각 웰에 5분 동안 첨가했습니다. 웰을 완충액 B로 1회 세척했습니다. 그런 다음, 647nM의 Atto-1N 이미저 가닥(ISXNUMX; 보충 표 10) 산소 제거제(프로토카테츄산(Sigma), 프로토카테츄에이트 3,4-다이옥시게나제(Sigma) 및 Trolox(Sigma))가 보충된 완충액 B 내를 각 웰에 첨가했습니다. 이중 교환 PAINT의 경우 세 가지 도킹 시퀀스(DS2, 보충 표) 10)이 NanoRod의 양쪽 끝에 추가되었습니다. 샘플은 이전에 설명한 대로 준비되었으며, 각 영상 획득 사이에 웰은 완충액 B로 647회 세척되었습니다. 각 이미징 획득은 서로 다른 Atto-1N 이미저 스트랜드(IS2 및 ISXNUMX, 보충 표)를 사용하여 수행되었습니다. 10). Micro-Manager 소프트웨어는 9,000MHz 판독 프레임, 10ms 노출 및 전자 증배 이득 없이 200프레임을 획득하는 데 사용되었습니다(보주 및 보충 무화과. 2 과 3).

SPR

Biacore T200 기기(Cytiva)를 사용하여 SPR 실험을 수행했으며 데이터는 Biacore T200 시스템 제어 소프트웨어 v. 2.01을 사용하여 획득했습니다. 비오티닐화 ECD-IR(Nordic BioSite)을 스트렙타비딘 센서 칩 SA(Cytiva)에 고정했습니다. 런닝 버퍼로는 HBS-P+ 버퍼(Cytiva)를 사용했습니다. ECD-IR의 고정화 후, 안정적인 기준선에 도달하기 위해 15분의 안정화 시간이 도입되었습니다. NR-1, NR-2, NR-4, NR-7, NR-15, NR-8 및 NR-8dsDNA를 런닝 버퍼에 11.4nM 농도의 인슐린으로 주입했습니다. 분석할 수 있는 결합 곡선을 얻기 위한 최소 농도인 55 nM에서 인슐린과 INS-DNA를 주입했습니다. NR은 인슐린 NanoRod 주입 내에서 사용된 NanoRod의 최고 농도(NR-1 = 11.4 nM)와 동일한 농도로 음성 대조군으로 주입되었습니다. 대안적으로, NR-2, NR-4, NR-7 및 NR-15는 5.7nM 농도의 나노구조로 주입되었습니다(확장된 데이터 그림 XNUMX). 4e) 및 NR-7^K-PEG 또한 50nM 농도의 인슐린을 주입했습니다(확장 데이터 그림 XNUMX). 9c). 각 샘플의 주입은 180초의 결합 단계와 300초의 해리 단계를 사용하여 수행되었습니다. 해리 평형 상수 (K_D), 결합율 상수(k_on) 및 해리 속도 상수(k_오프)는 BIAevaluation 3.0 소프트웨어를 사용하여 결정되었습니다. 그만큼 t_1/2 체류 시간을 정의하는 값은 공식 ln2/를 사용하여 결정되었습니다.k_오프. IR과 IGF7R 사이의 NR-1 구조의 결합을 비교하기 위해 제조업체의 지침에 따라 ECD-IR 및 ECD-IGF1R 단백질(Nordic BioSite)을 아민 커플링 반응을 통해 CM5 센서 칩의 두 개의 서로 다른 유동 셀에 고정했습니다. 인슐린과 INS-DNA의 결합은 다음과 같은 결합 단계를 사용하여 단일 주기 운동 모드에서 실행 완충액(HBS-P+)에 다양한 농도의 인슐린(6.2, 18.5, 55.6, 166.7 및 500.0nM)을 주입하여 테스트되었습니다. 140초 및 해리 단계 300초. NR-7의 결합은 11.4초의 결합 단계 및 180초의 해리 단계를 사용하여 단일 농도의 구조(인슐린 300nM)를 주입하여 테스트되었습니다.

쿠마시 젤

여기서 0.5μg의 재조합 ECD-IR(Nordic BioSite)을 Laemmli 샘플 완충액(Bio-Rad)에 재현탁했습니다. 환원 조건을 위해, 2-메르캅토에탄올을 최종 농도 2.5%로 첨가했습니다. 샘플을 80°C에서 10분간 변성시키고 나트륨 도데실 황산염-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석한 후 GelCode Blue 안전 단백질 염색(Thermo Fisher Scientific)으로 염색했습니다.

젤 이동 분석

7nM의 NanoRods(NR 및 NR-20)를 인간 IR(Nordic BioSite)의 300nM 재조합 세포외 도메인 또는 PBS와 함께 30°C에서 4분 동안 배양했습니다. 그런 다음 샘플을 2% 아가로스 겔에서 실행하고 SYBR Safe로 염색했습니다.

면역 블로 팅

세포를 PBS로 세척하고, 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일(Thermo Fisher Scientific)이 보충된 방사면역침전 분석 완충액(Sigma-Aldrich)에 용해시킨 후, 얼음 위에서 30분 동안 진탕하면서 배양했습니다. 원심분리(20,000×)로 용해물을 제거했습니다.g 20°C에서 4분 동안) 및 단백질 용해물을 Bradford 단백질 분석(Bio-Rad)을 사용하여 정량화했습니다. 단백질 용해물을 2.5%의 2-머캅토에탄올을 함유하는 Laemmli 샘플 완충액(Bio-Rad)에 재현탁시키고, 80°C에서 10분 동안 변성시키고, 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하고 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 옮겼습니다. 막을 차단 용액(1% Tween 0.1(TBST) 및 20% 무지방 분유를 함유한 트리스 완충 식염수)에서 5.0시간 동안 배양한 후 phospho-IR 베타/IGF4R에 대한 1차 항체를 사용하여 3024°C에서 밤새 배양했습니다. 베타(CST 1, 1,000:473), 포스포-AKT-S4058(CST 1, 1,000:1) 또는 GAPDH(Invitrogen PA987-1, 5,000:31460). TBST로 1회 세척한 후 막을 양 고추냉이-과산화효소가 결합된 5,000차 항체(Invitrogen, 1, XNUMX:XNUMX)와 함께 실온에서 XNUMX시간 동안 배양했습니다. 양 고추 냉이 퍼옥시다제의 검출은 ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad)에서 화학 발광 기질 Immobilon Forte에 의해 수행되었습니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 밴드 밀도 측정을 수행했습니다.

유세포 분석

분화된 혈청이 결핍된 지방세포는 위에서 설명한 대로 준비되었습니다. 이후 지방세포를 Hanks의 균형 염 용액(HBSS)으로 두 번 세척하고 콜라게나아제 D 용액(1.5 U ml^{- 1} 콜라게나아제 D(Roche) 및 10mM CaCl₂ HBSS에서) 20°C에서 37분 동안. 세포를 HBSS에 재현탁시키고, 35μm HBSS 평형 세포 여과기(BD Biosciences)를 통해 여과하고, 300X에서 펠렛화했습니다.g 5분 동안 염색 완충액(1× PBS 및 1% 소 혈청 알부민)에 재현탁시켰다. 제조사의 지시에 따라 죽은 세포를 LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher Scientific)로 표지한 후, 세포 현탁액을 300×g 5분 동안 염색 완충액에 재현탁시켰습니다. 여기에서 ~100,000개의 세포를 10nM ATTO-647로 표지된 NanoRod 구조와 함께 100°C에서 10분 동안 37μl의 최종 부피로 배양했습니다. NanoRod 구조 없이 배양된 세포는 미처리 대조군으로 사용되었습니다. 그런 다음 세포를 300×에서 원심분리하여 염색 완충액으로 두 번 세척했습니다.g 5분 동안. BD FACSDIVA 소프트웨어 v. 9.0(BD Biosciences)을 사용하여 BD FACSCANTO II에서 유세포 분석 측정을 수행했습니다. 살아있는 지방세포는 처음에 FSC-A 대 AmCyan-A의 세포를 게이팅한 다음 FSC-A 대 FSC-H의 게이팅을 통해 단일항을 검출함으로써 식별되었습니다. 획득된 데이터는 FlowJo 10.7.1 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 분석되었습니다. 처리되지 않은 대조군에 대한 표준화 후 형광 강도의 기하 평균을 사용하여 NanoRod에 의한 세포 표지 정도를 정의했습니다.

RNA-seq 라이브러리 준비 및 시퀀싱

Quick-RNA Microprep Plus Kit(Zymo Research)를 사용하여 분화된 지방세포로부터 총 RNA를 분리하였고, 제조업체의 low-sample 프로토콜에 따라 TruSeq RNA Library Prep Kit v500를 사용하여 mRNA-seq 라이브러리 준비에 2ng의 정제된 RNA를 사용했습니다. Varioskan LUX 다중 모드 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher)에서 제조업체의 다중웰 플레이트 프로토콜에 따라 QuantiFluor dsDNA 시스템(Promega)을 사용하여 라이브러리 정량을 수행했습니다. 라이브러리 크기와 품질은 Bioanalyser 2100 및 High Sensitivity DNA Kit(Agilent)를 사용하여 평가되었습니다. NextSeq 표준 정규화 프로토콜(Illumina)을 사용하여 라이브러리를 변성 및 희석하고 NextSeq 1 플랫폼( 일루미나).

RNA-seq 정량화, DEG 분석 및 GSEA

시퀀싱 읽기는 참조 전사체에 대해 매핑되었습니다. 근육 단백질 코딩 전사 서열(M29, GRCm39 방출; https://www.gencodegenes.org/mouse/) Salmon 1.7.0을 사용하여 정량화했습니다 (참조. ³³). tximport 패키지를 사용하여 카운트 테이블이 생성되었습니다.³⁴ DEG 목록은 DESeq2 패키지(v. 1.34.0)를 사용하여 얻었습니다.³⁵, 조정된 유전자만 P 0.001 이하의 값과 로그₂추가 분석을 위해 ±0.58의 배수 변화 컷오프를 고려했습니다. Heat map 및 UpSet 플롯은 ComplexHeatmap(v. 2.10.0)을 사용하여 생성되었습니다.³⁶. Gene Ontology 용어와 KEGG 경로가 모두 포함된 생물학적 프로세스에 대한 GSEA는 ClusterProfiler(v. 4.2.2)에 대한 입력으로 순위가 매겨진 유전자 목록을 사용하여 수행되었습니다.³⁷ 거짓 발견율 조정의 의미 P 각각 0.10과 0.05 미만의 값입니다.

Zebrafish 미세 주입 및 유리 포도당 정량화

NanoRod와 인슐린 NanoRod를 올리고리신-PEG(K₁₀-못_5K, Alamanda Polymers) K의 라이신 아민 간 비율이 1:1입니다.₁₀-못_5K 그리고 DNA의 인산염³⁰, 각 제브라피시 유충에 샘플 30nl를 미세 주입하기 전에 실온에서 2분 동안 배양했습니다. 주입용 샘플은 코팅된 NanoRod 샘플의 경우 최종 농도 100nM의 구조로, 코팅된 인슐린 NanoRod 샘플의 경우 최종 농도 100nM의 인슐린(NR-100.0의 경우 14.3 및 1nM의 NanoRods에 해당)으로 준비되었습니다.^K-PEG 및 NR-7^K-PEG, 각각). 제브라피시 유충에 1nM 농도의 인간 인슐린 100nl를 주입하면 유리 포도당 수준의 감소와 인슐린 신호 전달과 일치하는 전사 변화가 유도되는 것으로 나타났습니다.³⁸. 따라서 우리는 유리 포도당 수준에 대한 인슐린 매개 효과를 평가하기 위해 분석에 2nM 인슐린 농도 100nl을 주입했습니다. 2dpf 제브라피시의 총 혈액량은 60-89nl이므로(참조. ³⁹), 우리 분석에서 주입된 인슐린의 추정 농도는 약 2-3nM입니다. 이러한 분석에서 우리는 주입된 샘플의 양이 제한되어 주입 수준이 높을수록(3 및 4 nl) 유충 생존이 불량해졌습니다.

제브라피시(zebrafish)의 유지 및 교배(D.레리오) 라인은 Stockholms djurförsöksetiska nämnd가 승인한 동물 복지 규정에 관한 스웨덴 법률을 준수하여 수행되었습니다. β 세포 절제 및 유리 포도당 분석 실험에는 생후 5일 미만의 동물만 사용되었으므로 2010/63/EU에 따라 윤리적 허가가 필요하지 않았습니다. 사용된 Zebrafish 형질전환 계통은 이전에 설명되었습니다. Tg(인:CFP-NTR)^s892 (참조 ²⁷) and Tg(인:길드)^s949 (참조 ²⁸).

β-세포 절제는 이틀 된 아이에게 수행되었습니다. Tg(인:CFP-NTR) and Tg(인:CFP-NTR);Tg(인:길드) 10mM 1‐페닐‐3‐티오우레아(PTU, Acros Organics)가 보충된 계란 수용액(E0.2)에서 1% DMSO(VWR)에 희석된 2mM MTZ(Sigma-Aldrich)로 24시간 동안 처리하여 배아를 생성합니다. 베타세포 절제 후, XNUMX일 된 Tg(인:CFP-NTR) 유충(72 hpf)을 0.01% 트리카인으로 마취시키고 2 nl의 1X PBS, 비변형 인슐린 또는 코팅된 NanoRod/인슐린 NanoRod를 총기본정맥(Cuvier관)에 주사했습니다.⁴⁰. 0.1%의 최종 농도로 페놀 레드(Sigma-Aldrich)를 PBS, 인슐린 또는 코팅된 인슐린 NanoRod 샘플에 첨가하여 미세 주입 과정의 시각화 및 성공적으로 주입된 유충의 결정을 돕습니다. Zebrafish 유충을 치료 그룹에 무작위로 할당했습니다. 유리 포도당 수준은 다른 곳에 설명된 대로 측정되었습니다.⁴¹ 형광 기반 효소 키트(BioVision)를 사용합니다. 조건/복제별로 XNUMX~XNUMX개의 주입된 유충 그룹을 사용했습니다.

공초점 이미징

Tg(인:CFP-NTR);Tg(인:길드)-제거된 유충을 제거 처리 후 24시간 동안 수집하고, 이전에 언급한 프로토콜에 따라 마취 및 주입하고, 공초점 이미징으로 β 세포 수를 분석하기 전에 4% 파라포름알데히드 용액에 고정했습니다. 공초점 이미지는 Leica TCS SP8 현미경과 LAS X 소프트웨어(v. 3.5.5.19976)를 사용하여 획득했습니다. β 세포가 제거된 XNUMX차 췌장섬 Tg(인:CFP-NTR);Tg(인:길드) 유충은 ×40 수침 대물렌즈로 스캔되었으며 z 스택은 Fiji 소프트웨어(v1.53)를 사용하여 분석되었습니다. 표시된 모든 이미지는 동일한 실험에서 획득되었으며 시각화 목적으로 대비 값이 조정되었습니다. β-세포의 정량화는 수정되지 않은 원본 이미지에서 수행되었습니다.

통계 분석

표본 크기를 미리 결정하기 위해 통계적 방법은 사용되지 않았지만 표본 크기는 이전 간행물에서 보고된 것과 유사했습니다.^28,38,42. 세포 배양 샘플과 동물을 대조군과 치료군에 무작위로 배정했습니다. 데이터 수집 및 분석은 실험 조건에 대해 맹목적으로 수행되지 않았습니다. 대부분의 그래프에는 개별 데이터 포인트가 표시됩니다. 표본의 크기 (n) 실험적 생물학적 반복 횟수와 사용된 통계 방법은 해당 그림 범례에 표시되어 있습니다. 데이터 세트는 가우스 분포에 대해 테스트된 후 적절한 통계 테스트를 거쳤습니다. 데이터의 통계 분석 및 그래픽 표현은 GraphPad Prism 9.4.0을 사용하여 처리되었습니다. 대조군과 인슐린 처리 세포 사이의 클러스터 특성을 비교하기 위해 양측 Mann-Whitney 테스트가 수행되었습니다. 웨스턴 블롯 정량화를 위해 일원 분산 분석(ANOVA)과 Dunnett의 다중 비교 테스트를 수행했습니다. β 세포의 정량화를 위해 Kruskal-Wallis 테스트와 Dunn의 다중 비교 테스트를 수행했습니다. 유리 포도당 값의 분석은 Tukey의 다중 비교 테스트와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 수행되었습니다.

보고 요약

연구 설계에 대한 추가 정보는 Nature 포트폴리오 보고 요약 이 기사에 링크되어 있습니다.

• SEO 기반 콘텐츠 및 PR 배포. 오늘 증폭하십시오.
• PlatoData.Network 수직 생성 Ai. 자신에게 권한을 부여하십시오. 여기에서 액세스하십시오.
• PlatoAiStream. 웹3 인텔리전스. 지식 증폭. 여기에서 액세스하십시오.
• 플라톤ESG. 탄소, 클린테크, 에너지, 환경, 태양광, 폐기물 관리. 여기에서 액세스하십시오.
• PlatoHealth. 생명 공학 및 임상 시험 인텔리전스. 여기에서 액세스하십시오.
• 출처: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01507-y