参照プラスミドの設計と合成

前臨床研究用の RNA 治療薬の生産を最適化することを目的として、最初に参照構築物が設計されました。 eGFPのコード配列³⁰ そのタンパク質産物はフローサイトメトリーやその他の蛍光分析法によって簡単にアッセイできるため、コード領域のレポーターとして選択されました。 転写は、mRNA IVT 中の共転写キャッピング用の CleanCap AG 試薬 (TriLink BioTechnologies) と互換性のある修飾 T7 プロモーター (5'-TAATACGACTCACTATAAGG-3') を使用して開始され、5' および 3' UTR 配列は以下から選択されます。ヒトαグロビンとAES-mtRNR1はそれぞれ、mRNAの安定性と発現に対する効果が実証されているため^31,32,33。 126nt セグメント化されたポリ (A) テールが選択されました。これは、細胞内でのプラスミド組換えの発生を減少させると予測されたためです。 E. 大腸菌の 哺乳動物細胞における mRNA の半減期と翻訳効率を損なうことなく、プラスミドの増殖とクローニング中に¹⁷。 私たちの構築物を合成し、複製起点とカナマイシン耐性遺伝子を含む pUC57-Kan バックボーン (GenScript) にクローニングしました。

プラスミド DNA を熱ショックを使用して NEB Stable コンピテントに形質転換しました E. 大腸菌の セル (NEB、C3040H)。 次に、プラスミドを含む単一コロニーを、30 μg/mL カナマイシンを含む LB 培地で増幅しました。 E. 大腸菌の 遠心分離を使用して 2500 mL の培養物から回収し、アルカリ溶解を使用して溶解しました。 次に、スーパーコイルプラスミド DNA を、最初に陰イオン交換クロマトグラフィーを使用し、次にバッファーを TE に交換する脱塩カラムを使用する多段階 FPLC 精製を使用して精製しました。 2 mg のスーパーコイル プラスミド DNA を Bsal-HFv3733 制限酵素 (NEB、R3) を使用して直線化し、ポリ (A) テールの端で終わる単一フラグメントを生成しました。 この線状化により、in vitro 転写のランオフが保証され、ポリ (A) テールの 3' ですぐに終了します。 線状化後、プラスミド DNA を疎水性相互作用クロマトグラフィー (HIC) でさらに精製しました。 線状化したプラスミド DNA を 4 倍量の 500 M 硫酸アンモニウムで希釈し、HIC を使用して精製してプラスミド DNA の他のアイソフォームを除去しました。 線状プラスミドDNAに対応するプールされた画分を、脱塩カラム上でTE緩衝液と緩衝液交換して、硫酸アンモニウムを除去した。 精製した直鎖状プラスミド DNA をイソプロパノール沈殿を使用して約 XNUMX ng/μL の濃度まで濃縮しました。

私たちは、さまざまな分析方法を使用して、線状化したプラスミドテンプレートの長さと純度を評価しました。 まず、アガロースゲル電気泳動を使用して、線状プラスミドのサイズ分布をスーパーコイルプラスミドと比較しました。 これにより、調製物中の線状プラスミドの割合の分析が可能になります。 第二に、スーパーコイル化および線状化されたプラスミド DNA の純度を、CIMac™ を使用する HPLC によって分析しました。 pDNA を、PATfix® 分析 HPLC システム (Sartorius、Goettingen、Germany) に接続した 0.3 mL (1.4 mm) ジエチルアミノエチル (DEAE) 弱陰イオン交換カラム (BIA Separations、Adjovščina、スロベニア) で分析しました。 HPLC は、移動相バッファー A (0.1 M トリス、0.3 M グアニジン-HCl、1% Tween-20 (w/v)、pH 8.0) およびバッファー B (0.1 M トリス、0.3 M グアニジン-HCl、0.7 M NaCl) を使用して実行しました。 、1% Tween-20 (w/v)、pH 8.0)。

オックスフォード ナノポア プラスミド シーケンス

オックスフォード ナノポア シークエンシングを使用して、プラスミドテンプレート調製物の精度と純度を測定しました。 ライゲーション シーケンシング ライブラリー (SQK-LSK109) は、直線化されたプラスミド テンプレート (上記) から調製され、PCR フリー ネイティブ バーコード (EXP-NBD104) で標識されました。 ライブラリーは、推奨される 2 μg ではなく 1 μg のテンプレートをインプットとして使用したことを除いて、製造業者 (Oxford Nanopore Technologies) の指示に従って調製しました。 得られたライブラリーを、dsDNA HS キットを使用して Qubit 機器 (Invitrogen) で定量化し、断片長分布の定性分析を D5000 ScreenTapes (Agilent Technologies, USA) で完了しました。 定量的分析と定性的分析の結果を使用して、プールとローディングに必要なライブラリー濃度を計算しました。 バーコード化されたライブラリーは、高精度ライブベースコールを有効にして (Guppy v9.4.1 および MinKNOW Core 106)、R5.1.13 (FLO-MIN4.5.4D) または Flongle フロー セルでシーケンスされました。 品質スコア >9 のすべてのナノポアリードを使用して連結された FASTQ ファイルを形成し、さらなる分析に進みました。

オックスフォード ナノポア プラスミド シーケンスのバイオインフォマティクス分析

まず、Porechop v0.2.4 Oxford Nanopore を使用してバーコードを削除し、次にカスタム パイプラインを使用して pDNA 配列データをマッピングして分析しました。 品質フィルタリングされ、連結された FASTQ リードは、Nanopore の -ax map-ont を使用して Minimap2 (リリース 2.20-r1064​​XNUMX) を介してプラスミドリファレンスにアライメントされました。³⁴。 結果として得られた SAM アライメント ファイルは、SAMtools v1.15 によって処理され、ソートおよびインデックス付けされた BAM ファイルやその他のさまざまなマッピング分析ファイルが生成されました。³⁵。 生成された BAM ファイルは、Integrative Genomics Viewer (IGV v2.12.3) を利用して表示および分析されました。³⁶。 さらに実行およびサンプル品質統計は、NanoPlot v1.38.1 および pycoQC v v2.5.2 を介して取得されました。^37,38.

マッピングされたリードのヌクレオチドごとのエラー プロファイルは、pysamstats v 1.1.2 をオプション –max- Depth=300000000 –FASTA –typevariation (https://github.com/alimanfoo/pysamstats）。 単純なエラー修正を実行するために、プラスミド配列のヌクレオチドごとのエラー プロファイルが、cDNA/dRNA 配列内の対応するヌクレオチドから差し引かれました。 プロットと統計分析は、Excel (Mac 版 v 16.67) および GraphPad Prism (Mac 版 v 9.3.1) ソフトウェアを使用して実行されました。

汚染の可能性についてアンマップ読み取りの内容を調査するために、SAMtools view -S -b -f 1.15 を使用して SAMtools (v4) 経由でアンマップ読み取りの BAM ファイルが生成され、これが SAMtools FASTA 経由で FASTA ファイルに変換されました。 この FASTA ファイルは、 大腸菌 Minimap2 を利用した参照配列は、BAM ファイルのソートとインデックス付けが行われ、前述したように SAMtools を使用してアライメント統計が生成されました。 配列に一致しなかったリードの配列相同性 大腸菌 参照は、国立バイオテクノロジー情報センターが提供する Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Nucleotide Collection nr/nt を使用して調査されました。

バリアントの呼び出しとコンセンサス シーケンスの生成は、bcftools (v1.15) を使用して完了しました。³⁵ 次の一連のコマンドを使用して、BAM ファイルを参照と比較し、VCF を生成します。 bcftools mpileup -d 300000000 –no-BAQ –min-BQ 0 -Ou -f | bcftools は -c -M –ploidy 1 -Oz -o *.vcf.gz を呼び出します。 結果として得られた VCF にインデックスが付けられ、参照に対して正規化され、BCF が生成されました。 consensus.fa シーケンスは、コマンド bcftools consensus とオプション -a – VCF にない位置 (カバレッジゼロ) を文字で置き換えて、VCF を参照シーケンスと比較した後に生成されました。

イルミナのプラスミド DNA シーケンス

次に、プラスミド DNA テンプレートを Illumina MiSeq 機器で配列決定しました。 バーコード付き Illumina DNA PCR フリー ライブラリーは、製造元 (Illumina) の指示に従って、ONT シークエンシングに使用したのと同じ線状プラスミド テンプレートから調製しました。 得られたライブラリーは、2 塩基ペアエンドに設定された v150 化学を使用して、オーストラリアン ゲノム研究施設の MiSeq 機器で配列決定されました。

Illumina MiSeq で生成された BCL ファイルは、Illumina DRAGEN BCL Convert 07.021.609.3.9.3 パイプラインで処理され、FASTQ.gz ファイルが生成されました。 これらのファイル内の読み取りの品質は、FastQC (v0.11.9) でチェックされました。 その後、読み取りはアダプタで行われ、TrimGalore (v0.6.8dev) を利用して品質がトリミングされ、Q20 しきい値を超える読み取りを含む FASTQ.gz ファイルが作成されました。³⁹。 アダプターは、–steaded_illumina –paired を使用して Illumina PCR-Free ライブラリからトリミングされました。 さらに、T オーバーハングは、–clip_r1 1 –clip_r2 1 を使用してイルミナ鎖 mRNA ライブラリから削除されました。結果として得られたトリミングされたファイルは FastQC でチェックされ、インデックス付きプラスミド参照ファイルに合わせて調整されました。⁴⁰ BWA-MEM (bwa-0.7.17-r1188) を使用します。

mRNA の in vitro 転写

修飾ヌクレオチドを含むキャップ付き mRNA は、Henderson et al. に記載されているプロトコールに従って、T7 RNA ポリメラーゼを使用したインビトロ転写 (IVT) によって生成されました。⁴¹ メーカーの指示に従ってください (NEB、E2080S)。 簡単に説明すると、50 μg/mL の精製線状プラスミド DNA を、32 μg/mL T3 RNA ポリメラーゼ (NEB M16)、リボヌクレオチド (7 mM ATP、0251 mM CTP、6 mM) を使用した 5 °C で 5 時間の IVT 反応のテンプレートとして使用しました。 GTP; NEB、N0450)、5 mM N1-メチルプソイドウリジン-5'-三リン酸 (TriLink BioTechnologies、TRN108110)、または対応する非修飾コントロール用の 5 mM UTP、転写バッファー (40 mM Tris・HCl pH 8.0、16.5 mM 酢酸マグネシウム、10 mM ジチオスレイトール (DTT)、20 mM スペルミジン、0.002% (v/v) Triton X-100)、2 U/mL 酵母無機ピロホスファターゼ (NEB、M2403) および 1000 U/mL マウス RNase 阻害剤 (NEB、M0314)。 Cap1 類似体は、5 mM CleanCap AG 試薬 (TriLink、TRN4) を反応液に添加することにより、mRNA 711310' 末端に共転写的に組み込まれました。 mRNA IVT 反応は、IVT 反応液 200 mL あたり 0303 単位の DNaseI (NEB、M37) を添加し、15 °C で 2050 分間インキュベートすることによって停止しました。 得られた mRNA を、製造業者の指示に従って Monarch RNA クリーンアップ キット (NEB、T10977015) を使用し、最終溶出は蒸留超純水 (ThermoFisher Scientific、XNUMX) として精製しました。

さまざまな分析方法を使用して、IVT mRNA の収量、長さ、純度を評価しました。 mRNAは、NanoPhotometer N120 (Implen)を使用したUV分光光度分析によって定量され、RNA ScreenTapes (Agilent Technologies、米国、5067-5576)を備えたTapeStation電気泳動を使用してサイズ分布を評価しました。

ドットブロット分析によるdsRNA夾雑物の検出

IVT mRNA サンプルをヌクレアーゼフリー水で最終濃度 200、500、1000、および 2000 ng/μL まで希釈しました。 希釈サンプルから、5 μL のアリコートを正に帯電したナイロン膜 (Roche、バーゼル、スイス) にロードし、各ブロット上の IVT mRNA サンプルの総ロード量はそれぞれ 1000、2500、5000 および 10,000 ng となりました。 dsRNAは社内で製造されました⁴² をポジティブコントロールとして使用し、ヌクレアーゼフリー水をネガティブコントロールとして使用しました。 メーカーの指示に従って、サンプルを Bio-Dot® 精密濾過装置 (Bio-Rad、カリフォルニア州、米国) にロードしました。 メンブレンを風乾し、浸漬によりブロッキングし、TBS-T (5 mM Tris-HCl、50 mM NaCl、150% Tween (w/v)) 中の 0.05% 脱脂粉乳を含むブロッキング緩衝液とともに室温でインキュベートしました。撹拌しながら１時間。

dsRNA を検出するために、膜をクローン 4G3 および 1G2 (Mozzy Mabs、ブリスベン、オーストラリア) に由来する 4 つの異なる dsRNA 特異的マウスモノクローナル抗体 (mAb) とともに 1 °C で一晩インキュベートしました。 両方の抗体を、インキュベーション緩衝液(TBS-T中の5%脱脂粉乳)で希釈した1:3希釈で別々に一晩インキュベートした。 次いで、膜を３回リンスし、次いで、ＴＢＳ－Ｔで各洗浄１５分間、３回洗浄した。 次に、メンブレンを、インキュベーションバッファーで希釈した 3:15 希釈のホースラディッシュペルオキシダーゼ (HRP) 結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン G (IgG) 二次抗体 (Abclonal, MA, USA) とともに撹拌しながら 1 時間インキュベートしました。 次いで、膜を３回リンスし、次に各洗浄で１５分間３回洗浄した。 化学発光検出は、Novex™ ECL 化学発光基質キット (Invitrogen、マサチューセッツ州、米国) を使用して実行し、ドットのシグナル強度は ChemiDoc MP イメージング システム (Bio-Rad、カリフォルニア州、米国) を使用して視覚化しました。

ONT cDNA-PCR シーケンス

cDNA-PCR シーケンスを使用して、IVT mRNA の精度と純度を決定しました。 まず、Qubit RNA BR kit (ThermoFisher Scientific) を使用して mRNA 濃度を計算しました。 mRNA をヌクレアーゼフリー水でライブラリー調製に適切な濃度 (約 1 ng/μL) まで希釈し、Qubit RNA HS キット (ThermoFisher) を使用して濃度を確認しました。 バーコード化された ONT cDNA-PCR ライブラリー (SQK-PCB109 および SQK-PCS111) は、以下の例外を除き、製造業者 (Oxford Nanopore Technologies) の指示に従って調製されました。 cDNA合成ステップ中の蒸発は、反応量を測定することによって評価し、必要に応じてチューブにヌクレアーゼを含まない水を補充しました。 cDNA は 14 ～ 16 サイクルで増幅されました (推奨は 14 ～ 18 サイクル)。 最後に、ライブラリの最終濃度を高めるために、ライブラリを (推奨量 8 µL ではなく) 12 µL の溶出バッファーで溶出しました。 修飾された塩基を含むテンプレートを使用して調製されたライブラリーは、修飾されていない塩基を使用して調製されたライブラリーよりも出力が低いライブラリーを生成すると思われるため、これは必要でした。

得られたライブラリーは、dsDNA HS キット (ThermoFisher Scientific) を備えた Qubit 機器 (Invitrogen) を介して定量され、D5000 ScreenTapes (Agilent Technologies, USA) を使用して断片長分布の定性分析が行われました。 定量的および定性的分析の結果を使用して、プールとローディングのライブラリー濃度を調整しました。 高精度ライブベースコーリングを有効にして（Guppy v10 および MinKNOW Core 9.4.1）、各 R106 (FLO-MIN5.1.13D) フローセルで最大 4.5.4 個のバーコード化ライブラリをシーケンスしました。 品質スコア >9 のすべてのナノポアリードは合格として割り当てられ、さらなる分析に進みました。

ONT cDNA-PCR シーケンスのバイオインフォマティクス分析

cDNA-PCRデータは、ONT pDNA配列決定について記載したように分析した(上記参照)。 さらに、以下の分析が行われました。 SSP および VNP プライマーを正しい向きで含む全長 FASTQ 転写物を同定するために、ツール pychopper (v.2.5.0) を利用しました (デフォルトのパラメーターを使用)。 これらのアダプターはトリミングされ、新しい FASTQ ファイルが生成されました。 レスキューされたフォルダーと全長フォルダーからトリミングされたリードがマージされ、これらのリードは、上記のように Minimap2 を使用してプラスミド参照にマッピングされました。 BAM ファイルも上記のように生成され、これらは cDNA 読み取り長の分析に使用されました。 SAMtools view -F 1.15 を利用する SAMtools (v2048) を使用して、BAM ファイルからプライマリ アライメントされたリードのリード長分布を抽出しました。 GraphPad Prism (v9.4.1 for Mac) ソフトウェアを使用してプロットと統計分析を実行し、各サンプルのリード長分布プロファイルを作成しました。

次に、cDNA-PCR データセットからのオンターゲットリード (つまり、正しく転写され、機能的タンパク質に翻訳される可能性が高いリード) の割合を分析しました。 まず、BEDtools (v2.27.1) intersect を利用して、ソートされた BAM ファイルを分析し、オンターゲット読み取りとオフターゲット読み取りの割合を特定しました。 BED ファイルが生成され、Kozak シーケンスの開始と 3' UTR の終了を含むターゲット座標が示されました。 リードはオンターゲットとしてビニングされ、開始座標と終了座標が重複する場合は BAM ファイルが生成され、他のすべてのリードはオフターゲットとしてビニングされました。 オフターゲットリードは、3' または 5' 分解を示す開始または停止座標の重複に応じてさらにフィルタリングされました。 生成された BAM ファイルは、Integrative Genomics Viewer (IGV v2.12.3) を利用して表示および分析されました。

mRNA コード領域のバリアント呼び出しとコンセンサス配列の生成は、オプション -targets を使用してパイルアップを上で指定した開始座標と終了座標に制限することを除いて、前述したように完了しました。

ONT cDNA-PCR シーケンスを使用したポリ (A) テール長の計算

ポリ (A) テールの長さは、オリゴ dT プライマーを 111' 末端に固定する cDNA-PCR データ (SQK PCS3) から推定され、以下を使用しました。 テールファインダー (v1.3) Kraus et al. に記載されているプロトコルを使用します。²¹。 簡単に説明すると、アライメントされていない FAST5 ファイルが入力され、その後、シーケンス アダプター、スプリント アダプター、ポリ (A) テール、および遺伝子本体に分割されます。 次に、細孔移動時間の推定値に基づいて、poly(A) テールの長さが計算されます。 ポリ (A) テールの長さは、元の cDNA-PCR キット (SQK PCB5) および更新バージョン (SQK PCS109) から生成された Fast111 ファイルから推定されました。 ここでは、両方のキットの Fast5 ファイルが、次の構成 dna_r9.4.1_450bps_hac.cfg (Guppy v5.1.13 および MinKNOW Core 4.5.4) を利用して高精度でベースコールされました。 次に、find_tails 関数は、 テールファインダー (v1.3) はデフォルト設定を使用して実行されました²¹。 SQK PCB5 キットから生成された Fast109 ファイルでは、推定を可能にするためにカスタム cDNA 5' (TTTCTGTTGGTGCTGATATTGCT) および 3' (ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTC) プライマー詳細の仕様が必要でした。

イルミナ cDNA シーケンス

バーコード付きイルミナ鎖 mRNA ライブラリーは、製造業者 (イルミナ) の指示に従って、ONT シークエンシングに使用したのと同じ IVT mRNA テンプレートから調製しました。 得られたライブラリーをプラスミド DNA ライブラリーと多重化し、2 塩基対末端に設定した v150 化学を使用して、オーストラリアン ゲノム研究施設の MiSeq 機器で配列決定しました。 イルミナ cDNA シーケンス データのトリミングとマッピングは、イルミナ pDNA シーケンスについて説明したパイプラインに従いました (上記を参照)。

マッピング統計の生成、ヌクレオチドごとのエラー計算、バリアントの呼び出し、コンセンサス配列の生成、およびマッピングされていないリード分析を、ONT シーケンシングについて上で説明したように実行しました。 Illumina プラットフォームでシーケンスされたサンプルの場合、リードの長さが短いため、オンターゲットリードとオフターゲットリードは異なる方法で計算されました。 コマンド SAMtools view (さまざまな座標) を備えた SAMtools (v1.15) を利用して、リファレンスの mRNA コード領域の下流および上流のリードを抽出し、対応する BAM ファイルを生成しました。 SAMtools flagstat を利用して、これらの BAM ファイル内に含まれるプライマリ リードをカウントし、この数をプライマリ リードの合計と比較して、ターゲット リード数を計算しました。

アンチセンスリードを特定するために、SAMtools ビューを使用して、順方向鎖 (順方向鎖のペアの 128 番目、-b -f 16 -F 80、および逆方向鎖のペアの 144 番目、-b -f 64) または逆方向鎖に由来するリードを分離しました。 (逆方向ストランドにマッピングされる場合はペアの 16 番目、-b -f XNUMX、順方向ストランドにマッピングされる場合はペアの最初、-b -f XNUMX -F XNUMX)。 逆鎖に由来するリードはアンチセンスリードとして指定されました。

修正されたポリアデニル化プロトコル

合成 RNA でポリ (A) テールが欠如しているフラグメントを検出するために、eGFP mRNA に酵素的にポリ (A) テールを追加しました。 これは、Oxford Nanopore プロトコルに従って調製されました。 E. 大腸菌の ポリ(A)ポリメラーゼ。 簡単に説明すると、最大 10 μg の RNA を NEB とインキュベートしました。 E. 大腸菌の ポリ(A) ポリメラーゼ (M0276) および 1 mM ATP 1.5 分間。 EDTA (最終濃度 10 mM) を使用して反応を停止し、最終容量を 25 μL にしました。 次に、72 μL の Agencourt RNAClean XP ビーズ (Beckman Coulter A63987) を使用してポリ (A) テール付加 RNA をクリーンアップし、12 μL のヌクレアーゼフリー水で溶出しました。 次に、Qubit BR または HS RNA キットを使用して溶出液を定量しました (反応に投入された RNA の量に応じて)。 次に、適切な量の RNA を SQK-PCB109 または SQK-RNA002 ライブラリー調製のテンプレートとして使用しました。 ライブラリーを上記のように調製し、配列決定した。

Oxford Nanopore を使用したダイレクト RNA シーケンス

ダイレクト RNA シーケンスを使用して、IVT mRNA の精度と純度を決定しました。 ライブラリーは、以下の例外を除き、製造業者 (Oxford Nanopore Technologies) の指示に従って ONT SQK-RNA002 キットを使用して調製しました。 まず、ONT ダイレクト RNA シーケンス プロトコールで推奨されている 400 ng または 500 ng ではなく、50 ng のテンプレートを使用して各ライブラリーを調製しました。 テンプレートの安定性を向上させる cDNA 合成ステップを利用しました。 さらに、効率が高いため、推奨されている Superscript III ではなく Superscript IV を使用しました。 ライブラリーは、Qubit RNA BR キット (ThermoFisher Scientific) を使用して定量されました。 各ライブラリーは、個別の R9.4.1 (FLO-MIN106D) フローセルで 72 時間シーケンスされました。 Fast5 ファイルは、後に次の構成 rna_r9.4.1_70bps_hac.cfg (Guppy v5.1.13) を利用して高精度でベースコールされました。 品質スコア >9 のすべてのナノポアリードは合格として割り当てられ、さらなる分析に進みました。 ダイレクト RNA シーケンシング データは、Pychopper を使用したバーコード検出とオンターゲットおよびオフターゲット検出計算を除き、cDNA と同様に分析されました。 さらに、SQK PCS111 ライブラリー (上記) について説明したように、ポリ (A) テール長の計算を実行しました。

次に、ダイレクト RNA シーケンスデータ (SQK-RNA002) からポリ (A) テールの長さを推定しました。 Poly(A) テールの長さは次を使用して推定されました。 テールファインダー (v1.3)、Kraus et al. で説明されているプロトコルを使用します。²¹. テールファインダー (v1.3) は、Fast5 ファイルを利用してテールの長さを推定します。このツールは最初、Nanopolish v0.13.3 Poly(A) と同じダイレクト RNA データセット上で実行されました。 推定されたポリ (A) テールの長さを比較した後、さらにサンプルを分析しました。 テールファインダー デフォルト設定で実行され、出力として .tsv ファイルが生成されました。 この .tsv ファイルはカスタム R スクリプトで調べられ、各リードの推定ポリ (A) テール長の密度プロットが生成されました。

統計と再現性

このペーパーに示されているデータは主に概念実証であり、その範囲は次のとおりです。 n = 1 ～ n = 4. 実験の再現に関する詳細は、個々の結果セクションに含まれています。 サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。 分析から除外されたデータはありません。 シーケンス品質の最も重要な決定要因は代替の共変量ではなく、テンプレートの品質であるため、実験はランダム化されませんでした。 サンプルの同一性に関する知識が結果の解釈に偏りをもたらす可能性は低いため、研究者は実験および結果の評価中に割り当てについて盲目になることはありませんでした。

レポートの概要

研究デザインの詳細については、 ネイチャー ポートフォリオ レポートの概要 この記事にリンクされています。

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• 情報源： https://www.nature.com/articles/s41467-023-41354-y