マウス

若齢 (生後 2 ～ 4 か月) および老齢 (生後 18 ～ 26 か月) の雄と雌の野生型 C57BL6/J、Lgr5-ki-eGFP-creER、および Olfm4-ki-eGFP-creER マウスを集団で飼育し、維持しました。フリッツ・リップマン研究所の特定日和見病原菌除去（SOPF）動物施設で、12時間の明暗サイクルを行い、温度20±2℃、rlH 55％±15で標準的なマウスの餌を与えた。実験は承認されたプロトコールに従って行われた。チューリンゲン州政府 Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz (TLV) 当局による (ライセンス番号: TG/J-0002858/A; TG/J-0003616/A; TG/J-0003681/A; FLI-17-109; FLI- 18-005、FLI-20-005）。

小腸陰窩の分離

確立されたプロトコルを使用して小腸陰窩を分離しました⁶⁰ いくつかの変更を加えて。 簡単に言うと、マウスの小腸を解剖し、冷PBSで洗浄した。 絨毛のない腸片 (2 cm) を冷 PBS で洗浄し、5 mM EDTA/PBS に移し、ローテーター上で 30 °C で 4 分間インキュベートを 30 回行いました。 組織を新鮮な冷PBSに移し、手動で70秒間振とうしました。 陰窩溶液を 450 µm のセルストレーナーを使用してろ過し、XNUMX × で遠心分離しました。 g 5℃で4分間。 分離された陰窩はすぐに使用されるか、液体窒素中で瞬間凍結され、さらなる実験のために-80℃で保存されました。 RNA を単離するために、陰窩を QIAzol Lysis Reagent (Qiagen) に直ちに再懸濁し、-80 °C で保存しました。

腸幹細胞の分離と選別

Lgr5-eGFP および Olfm4-eGFP ISC を単離するために、新たに単離した陰窩を 18 ml TrypLE Express、2 ml の 10× DNase I バッファー (100 mM Tris-HCl pH 7.5、25 mM MgCl) の混合物で解離させました。₂、5 mM CaCl₂) および 1 ml DNase I (10 mg/ml) を 30 °C で 37 分間、10 分ごとに軽くボルテックスします。 次に、単細胞懸濁液を 20 µm セル ストレーナーに通し、800 × で遠心分離しました。 g 5℃で4分間。 細胞ペレットを、２％ウシ胎児血清、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μＭ Ｙ２７６３２およびＤＡＰＩ（１：１０００）を補充したＰＢＳを含有する３ｍｌのＦＡＣＳ染色培地（ＦＳＭ）に再懸濁した。 単一細胞懸濁液を FACS LSRII (BD Biosciences) および Lgr3-eGFP に適用しました。^hi または、前述のように Olfm4-eGFP ISC を下流分析用にソートしました⁶¹.

オルガノイド培養

小腸オルガノイドは確立されたプロトコールに従って培養されました⁶²。 簡単に説明すると、単離された陰窩をマトリゲルと混合し、24 ウェル プレートにプレーティングしました。 マトリゲルの重合後、陰窩培養培地 (Advanced DMEM/F12、1× Glutamax、10 mM HEPES、N2 サプリメント (1:100)、B27 サプリメント (1:50)、0.5 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン、50 ng/mLマウス組換え上皮増殖因子、100 ng/mL マウス組換え Noggin、および 500 ng/mL ヒト組換え R-spondin1) を添加しました。 IFNγ処理では、3週間増殖させたオルガノイドを継代し、2日目にIFNγ(24ng/ml)をそれらに添加した。 1 時間後、オルガノイドを収集し、PBS で洗浄し、単一細胞 RNA 配列のために処理しました。 Stat2 シグナル伝達をブロックするために、オルガノイドをルキソリチニブ (10 μM) の存在下または非存在下で IFNγ 3 ng/ml で 0.2 日間処理し、FACS または qRT-PCR 分析のために収集しました。 再播種実験およびバリシチニブ (2 μM) 実験には、IFNγ を XNUMX ng/ml の濃度で使用しました。

アネキシン V 染色

上記のようにオルガノイドから単一細胞を調製した後、RTで200分間インキュベートした後、細胞を1μlの1×結合緩衝液およびBD Bioscienceのアポトーシス検出キットからの15μlのAPCアネキシンVに再懸濁した。 1×結合バッファーで洗浄した後、細胞を1×結合バッファー（100μl）に再懸濁し、FACSAriaII（BD Biosciences）を使用して分析し、FlowJoソフトウェアを使用してデータを分析しました。

BrdU増殖解析

BrdU (10 μM) を回収の 6 時間前にオルガノイドに添加しました。 上記のようにオルガノイドから単一細胞を調製した後、BD Bioscience の BrdU フロー キットを使用して、オルガノイド培養物中の増殖細胞の割合を定量しました。 細胞はFACSAriaIIを使用して分析され、FlowJoソフトウェアが分析に使用されました。

共培養実験

IFNγ処理（0.2 ng/ml、2日間）または未処理のオルガノイドを、新たに単離および選別したCd45と共培養しました。⁺ 若いマウスからの細胞を 3 日間培養した。 約2×10⁵ Cd45⁺ 細胞を100個のオルガノイドと混合し、マトリゲルに再懸濁しました(最終濃度30%)。 次に、培養物から免疫細胞を分離し、染色後、FACSAriaIIを使用して分析しました。 FlowJo ソフトウェアを使用して、さまざまな免疫細胞集団のパーセンテージを計算しました。

IFNγ の in vivo 遮断

老マウスに抗マウス IFNγ (25 mg/kg) または抗 IgG1 抗体を 3 週間腹腔内注射しました (週に 4 回注射)。 最後の注射から４日後に、マウスを臓器採取のために屠殺した。 再生実験のために、IFNγをブロックした後、最後の注射の5日後に、対照として5-フルオロウラシル(150-FU)(7mg/kg)またはDMSOを腹腔内(ip)注射し、XNUMX日後に臓器採取のためにマウスを屠殺した。

RNA と DNA の分離

陰窩からの全ＲＮＡを、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、続いてイソプロパノール沈殿を行った。 Lgr5-eGFP からの RNA^hi FACS によって選別された ISC は、ZR-Duet™ DNA/RNA MiniPrep Plus Kit (Zymo Research) を製造業者の指示に従って使用して単離されました。 単離された RNA は、Nanodrop 8000 (Thermo Fisher Scientific) および Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific) で定量されました。 単離された RNA の品質は、Fragment Analyzer (Agilent) によって分析されました。

RNAシーケンスライブラリの調製

Total ribo-depleted RNA-seq ライブラリーの調製は前述のように実行されました。⁶³。 簡単に説明すると、Ribo-Zero™ Gold Kit H/M/R Kit (illumina) を製造元の指示に従って使用し、50 ～ 500 ng の全 RNA からリボソーム RNA を除去しました。 リボ除去RNAを17μlのEFPバッファー（イルミナ）に再懸濁し、94℃で8分間加熱し、製造元の指示に従ってTruSeq™ RNAライブラリー調製キットv2（イルミナ）を使用して、第一鎖合成のインプットとして使用しました。

scRNA シーケンスのための細胞の準備

実験によると、近位小腸陰窩または腸オルガノイドを 1 ml の単細胞分離溶液 (1 mg/ml DNase I、5 mM MgCl を添加した TrypLE) に再懸濁しました。₂、80 μM Y27632) を加え、最初の 20 分間のインキュベーション後に短時間ボルテックスしながら 37 °C で 10 分間インキュベートしました。 29 mlの氷冷PBSを加えて反応を停止させ、細胞を800×で遠心分離した。 g 5℃で4分間。 細胞ペレットを、80 μM Y27632 を添加した FSM に再懸濁しました。 メーカーの仕様書に従って、細胞をTruStain FcX抗マウス抗体で事前にブロックしました。 次に細胞を、CD326 (EpCAM) (G8.8)、PE-Cyanine7 結合ラットモノクローナル抗体、およびさまざまな TotalSeq 抗マウス ハッシュタグ抗体で、暗所の氷上で 30 分間処理しました。 次に細胞を450×で遠心分離しました。 g 5℃で4分間、500μlの新鮮なFSMに再懸濁し、FACSでソートしました。 EpCAM⁺ 若いマウスと老マウスからの単一細胞を、1.5% BSA を含む 0.04 μl の PBS を含む BSA コートチューブにフローソートしました。

固有層 免疫細胞は近位腸組織から単離されました。 簡単に説明すると、陰窩分離後、組織を切り刻み、インキュベーターシェーカー（3 rpm）中、1% FBSを添加したRPMI培地中の1 mg/ml コラゲナーゼ-Dおよび2 mg/ml DNase I 80 ml中で50℃で37分間インキュベートしました。 ℃。 組織をｐ１０００チップで数回上下にピペットで移した。 上清を1000μmのストレーナーに通して、100% FBSを補充したRPMI培地に入れた。 残りの組織をシリンジプランジャーで粉砕し、2% FBS を補充した RPMI 培地で洗浄して、最大数の細胞を収集しました。 上清を2×で遠心分離した。 g、4℃で5分間。 ペレットを、２％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地中の４０％パーコールに再懸濁した。 勾配を作成するために、ファルコン チューブ内の 40% パーコールを含む細胞懸濁液を慎重にピペットで取りました。 ファルコンチューブを 2 × で遠心分離しました。g、２０分間室温で放置する（遠心分離機の停止は無効）。 免疫細胞を 20 つのパーコール濃度の境界から慎重に収集し、2% FBS を添加した PBS で洗浄しました。 懸濁液を450×で遠心分離した。 g、4℃で5分間。 ペレットを２％ＦＢＳを補充したＰＢＳに再懸濁し、染色を行った。 製造業者の仕様書に従って、細胞をTruStain FcX抗マウス抗体でブロックした。 染色とハッシュタグ付けは、各コンパートメントに対して FITC 結合 CD2 および異なる TotalSeq 抗マウス ハッシュタグ抗体を使用して同時に実行されました。 抗体の詳細は補足表を参照してください。 S2.

液滴ベースの scRNA シーケンス

scRNA-seqは、10X Genomicsプロトコルに従って実行されました。 簡単に説明すると、調製した単一細胞懸濁液を、Chromium Single Cell 3' Library & Gel Beads Chemistry v2 (10x Genomics) を使用して逆転写ミックスと注意深く混合し、Chromium Single Cell A Chip (10x Genomics) にロードしました。

10X Genomics Chromium システムでのカプセル化プロセス中に、細胞は液滴内で溶解し、ポリアデニル化 RNA を放出し、その後細胞で捕捉されたバーコード付きビーズに結合しました。 10x Genomics のユーザー マニュアルのガイドラインに従って、液滴を直接逆転写し、エマルジョンを破壊し、Dynabeads MyOne Silane (Thermo Fisher Scientific) を使用して cDNA を精製しました。 XNUMX サイクルで cDNA を PCR 増幅した後、フラグメント アナライザー (Agilent) で精製および品質管理チェックを受けました。

cDNA を 10 分間断片化し、dA テールを付加した後、アダプターライゲーションステップと 500 サイクルのインデックス PCR を行ってライブラリーを生成しました。 定量後、PE モード (R1: 26 サイクル、I1: 8 サイクル、R2: 57 サイクル) の高出力フローセルを使用して、NextSeqXNUMX プラットフォーム (イルミナ) でライブラリーの配列を決定しました。

ハイスループットシーケンス

ゲノムワイド実験のためのすべてのサンプルは、HiSeq2500 および NextSeq500 プラットフォーム (Illumina、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) で配列決定されました。

定量的リアルタイムPCR

cDNA合成は、製造業者のプロトコールに従ってiScript cDNA Synthesis Kit (Biorad)を使用して、1μgの全RNAを用いて行われました。 定量的リアルタイム PCR 分析は、SYBR GreenER qPCR SuperMix (Thermo Fisher Scientific) を使用して Corbett RotorGene 6000 (Qiagen) で実行されました。 各反応は 19 μl の qPCR ミックスと 1 μl の 1 で実行されました。：10 希釈 cDNA。 qRT-PCR条件は10℃で95分間、その後50℃で10秒、95℃で10秒、56℃で20秒、68℃で3秒を68サイクルでした。 アンプリコン データを取得するために、各 PCR 実行後に融解曲線分析を実行しました。各サンプルを XNUMX 回分析しました。 サンプルの濃度は、相対標準曲線法を使用して計算されました。 分析されたすべての遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子ベータ アクチンに対して正規化されました。 プライマーは NCBI Primer-BLAST ツールを使用して設計され、その配列は補足表にリストされています。 S1.

クロマチン免疫沈降 (ChIP)-qRT-PCR 分析

前述のように、IFNγ処理および未処理のオルガノイドに対してクロマチン免疫沈降を実行しました。⁶³。 簡単に説明すると、IFNγ (2 ng/ml) で 24 時間処理したオルガノイドを洗浄、破壊し、室温で 1 分間 10% までホルムアルデヒドを添加して架橋し、室温で 0.125 分間 5 M グリシンでクエンチし、その後冷ＰＢＳで２回洗浄した。 架橋オルガノイドを SDS ChIP バッファー (20 mM Tris-HCl pH 8.0、10 mM EDTA、1% SDS およびプロテアーゼ阻害剤) に再懸濁し、ローテーター上で 30 °C で 4 分間インキュベートし、高速で 18 サイクル超音波処理しました。 Bioruptor Next Gen (Diagenode) を使用して出力設定 (30 秒オン、30 秒オフ) し、12,000 × で遠心分離 g 10℃で4分間。 単離したクロマチンを ChIP 希釈バッファー (10 mM Tris-HCl pH 16.7、8.0% SDS、0.01% Triton X-1.1、100 mM EDTA、1.2 mM NaCl) で 167 倍に希釈し、4 μg の抗体とともに一晩 4 ℃でインキュベートしました。回転子上では °C。 プロテイン G 結合磁気ビーズ (Dynal、Thermo Fisher Scientific) を PBS/1% BSA で飽和させ、サケ精子を 4 °C で一晩超音波処理しました。 翌日、サンプルを飽和ビーズとともに回転装置上で 4 °C で 1 時間インキュベートし、その後 20 ml の冷低塩緩衝液 (8.0 mM Tris-HCl pH 0.1、1 % SDS、100% Triton X-2) で洗浄しました。 、150 mM EDTA、1 mM NaCl）、20 mlの冷高塩緩衝液（8.0 mM Tris-HCl pH 0.1、1 % SDS、100% Triton X-2、500 mM EDTA、1 mM NaCl）、10 mlの冷緩衝液LiCl バッファー (8.0 mM Tris-HCl pH 1、250% DOC、1 mM LiCl、1 mM EDTA、40% NP-1)、および 10 ml の冷 TE バッファー (8.0 mM Tris-HCl pH 1、200 mM) で 10 回EDTA）。 免疫沈降したクロマチンを、回転装置上、室温で 8.0 分間、溶出バッファー (1 mM Tris-HCl pH 1、150 mM EDTA、5 mM EDTA、30% SDS、65 mM NaCl、2 mM DTT) 1 μl で溶出し、1°で脱架橋しました。 C一晩。 脱架橋したＤＮＡを、ＱｉａＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用して精製した。 免疫沈降した DNA を、SYBR GreenERkit (Invitrogen) および以下のプライマーを使用した定量的リアルタイム PCR によって分析しました: H9172-Ab12 (フォワード: CAGGTCCTGACCCCTGTTTA、リバース: GTTTCAGGAAGGGACAGCCA)、Wars (フォワード: CTGGCTGTGTAGTCCAAGGG、リバース: GAAAGGGTGTGGCAAAGCAG)。 ChIP に使用した抗体は、ウサギ抗 Stat370 (1、Cell Signaling)、ウサギ抗 IgG (250-XNUMX、Millipore) でした。 すべての抗体は XNUMX:XNUMX の濃度で使用されました。 抗体の詳細は補足表を参照してください。 S2.

凍結組織切片の免疫蛍光

近位腸 (十二指腸) の小片 (2 cm) を、回転装置上で 4 °C で一晩、PBS 中の 4% PFA で固定しました。 固定後、組織を室温で 15 分間 PBS で 20 回洗浄し、ローテーター上で 4 °C で一晩 80% スクロース中で脱水しました。 続いて、固定組織を最適切断温度 (OCT) 化合物を使用してギプスに固定し、液体窒素を使用してゆっくりと凍結させ、-14 °C で保存しました。 免疫蛍光染色では、0.1 μm 切片を切り出し、組織を 100% Triton X-10 を添加した PBS で 15 分間透過処理し、RT で 1 分間 PBS で 10 回洗浄しました。 透過処理された組織を、0.1% Tween 20 を添加した PBS (T-PBS) 中の 2% FBS で 4 時間ブロックし、次に 15% FBS を添加した T-PBS 中の一次抗体とともに 1 °C の湿潤チャンバー内で一晩インキュベートしました。 。 一次抗体とのインキュベーション後、組織を室温で 1000 分間 PBS で 1 回洗浄し、次に DAPI (15:200) を補充した PBS 中で二次抗体とともに室温で 200 時間インキュベートしました。 二次抗体とのインキュベーション後、組織を室温で XNUMX 分間、PBS で XNUMX 回洗浄し、マウントしました。 イメージングは​​フリッツ・リップマン研究所のイメージング中核施設で行われました。 画像は、光学切片作成用の ApoTome スライダー モジュールを備えた Axiovert XNUMX 倒立顕微鏡を使用して取得されました。 画像化は合計倍率 XNUMX 倍で実行されました。

免疫蛍光に使用した一次抗体は次のとおりです。ウサギモノクローナル抗 EpCAM [EPR20533-63] (Abcam; 1:250)。 ラットモノクローナル抗マウス MHC クラス II (IA) (NIMR-4)、PE (Thermo Fisher Scientific; 1:250)。 免疫蛍光法に使用した二次抗体は次のとおりです。Alexa Fluor 488 ロバ抗ウサギ IgG (H + L) (Thermo Fisher Scientific; 1:500)。 Alexa Fluor 568 ヤギ抗ラット IgG (H + L) (Thermo Fisher Scientific; 1:500)。 抗体の詳細は補足表を参照してください。 S2.

パラフィン包埋組織切片の免疫蛍光

5 μm パラフィン切片をキシレンに 5 回浸漬して (各回 100 分間) 脱パラフィンし、一連の段階的エタノール希釈液 90%、70%、および 5% に各 5 分間浸漬して再水和しました。 エピトープの回復は、切片を沸騰するまで900 mMクエン酸ナトリウム緩衝液pH 10中で全出力マイクロ波(6.5 W)で10分間予熱し、その後沸点以下の温度(600 W)で20分間予熱することによって行った。 ２０分間冷却した後、切片をＰＢＳで洗浄し、湿潤チャンバー内で室温で１時間、１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロックした。 切片を一次抗体:抗Olfm1 (Cell Signaling、D1Y4A、#6)、抗Muc5 (abcam、ab39141)、および抗Chga (abcam、ab2)で90007% BSA/PBS中で15160℃で1時間染色しました。湿気の多い部屋の中。 続いて、PBST (16% Tween 4、0.1 × 20 分) で洗浄し、AF3 と結合した二次抗ウサギ IgG と 5 分間インキュベートしました。 すべての抗体は 30:488 の濃度で使用されました。 スライドを T-PBS (1% Tween 250、0.1 × 20 分) で洗浄し、DAPI を含む封入剤で封入しました。 染色切片の画像は、Zeiss の Axio Imager を使用して取得し、ZEN blue ソフトウェア v3 (Zeiss) によって分析しました。 さらなる画像分析のために、ZEN ソフトウェアのカウントおよび測定用のグラフィック ツールが使用されました。 抗体の詳細は補足表を参照してください。 S2.

RNA配列データ解析

Fastq ファイルの品質チェックは、FastQC v0.11.5 を使用して実行されました。 fastq ファイルは、TopHat v9 を使用し、パラメータ –bowtie2.1.0 –no-coverage-search -a 1 を使用して mm5 ゲノムにマッピングされました。各遺伝子によってカバーされるリード数は、-s を指定した HTSeq-Count 0.11.2 によって計算されます。 no -a 0 -t exon -m 交差部分が空でないパラメータ。 さらに分析する前に、すべての rRNA 遺伝子がカウント データから削除されます。 DEG と正規化されたカウントを計算するには、DESeq2 R パッケージ v1.20.0 をデフォルトのパラメーターとともに使用しました。 ピアソン相関分析と式のプロットには、正規化されたカウントが使用されました。

遺伝子セット濃縮分析

遺伝子セット濃縮分析では、R のスケール関数 (center = TRUE、scale = TRUE パラメーター) を使用して、正規化されたカウント (すべてのサンプルの各遺伝子) をスケーリングしました。 の平均 Z スコアはグループごとに計算され、プロットの描画と下流の分析に使用されました。 の p 値は、Wilcoxon 対応検定 (両側検定) を使用して計算されました。 箱ひげ図は、データの四分位分布を示します。 四分位範囲 (Q1.5 ～ Q3) の 1 倍の距離が下位四分位の下で測定され、この距離内にあるデータセットから下位の観察点までひげが描画されます。 他のすべての観測点は外れ値としてプロットされます。

腸陰窩細胞の scRNA シーケンス データ分析

生の配列決定データは、Cell Ranger ソフトウェア (v2.1.0、10X Genomics) の「count」コマンドをデフォルトのオプションで使用して処理されました。 必要な参照は、マウスゲノム mm10 および入力として Ensembl (v87) からの遺伝子アノテーションに基づいて、Cell Ranger の「mkref」コマンドを使用して構築されました。 アノテーションは、Cell Ranger の「mkgtf」コマンドでフィルター処理され、タンパク質コーディング、lincRNA、およびアンチセンス遺伝子の特徴のみが含まれます (「–attribute=gene_biotype:protein_coding –attribute=gene_biotype:lincRNA –attribute=gene_biotype:antisense」)。 カウント ファイルは、cellrangerRkit パッケージ v2.0.0 を使用して R に直接アップロードされました。 カウントデータをさらに分析する前に、発現していない遺伝子を除去し、カウントを各セルの合計カウント数に正規化し(cellrangerRkitパッケージのnormalize_barcode_sums_to_median関数を使用)、すべての下流分析でlog 10に変換しました。 PCA は、center = TRUE,scale の prcomp 関数を使用して計算されました。 = TRUE パラメータ。 細胞のクラスタリングは、kmean クラスタリング (center = 9、nstart = 10) を使用して実行され、定義された各クラスターの細胞タイプは、各細胞タイプの既知のマーカーを使用して決定されました。 9 つのクラスターを使用すると、タフト細胞と腸内分泌細胞が同じクラスター内に存在するため、kmean (center = 2、nstart = 10) を使用して再クラスター化することでこれらの細胞タイプを分離しました。 各クラスターのマーカーを定義するには、order_cell_by_clusters と priority_top_genes (method = “sseq”、min_mean = 0.1) をそれぞれ使用しました。 マーカーの発現を、目的のクラスターと他のすべての細胞（priority_top_genes 関数を使用）との間で比較し、log2 倍率変化が 2 以上で調整された遺伝子を比較しました。 p 値 < 0.05 がマーカーとして選択されました。

固有層免疫細胞および腸オルガノイド細胞の scRNA シーケンス データ解析

Cell Ranger Software Suite (バージョン 3.1.0) を使用して、サンプルの逆多重化、バーコード処理、および mm3-10 を参照ゲノムとして使用した単一細胞 3.0.0' UMI カウントを実行しました。 生のリードをダウンサンプリングすることにより、各サンプルのセルあたりの有効リード (UMI) が同じレベル (セルあたりの UMI 数の中央値: 1330) にスケールされました。 ハッシュタグが読み取られたセルは、各セル内のハッシュタグの比率によって「単一ハッシュタグ」、「二重ハッシュタグ」、「トリプルハッシュタグ」、「複数ハッシュタグ」の異なるカテゴリーに定義されました。 ハッシュタグにマッピングされたリードが 10 未満のセルは廃棄され、「単一ハッシュタグ」として定義されたセルのみが下流分析用に保持されました。 その後、すべてのサンプルの遺伝子バーコード マトリックスが Seurat v3 に統合されました。 次いで、以下の基準を各細胞、すなわち免疫細胞に適用した。遺伝子数が200～1500、UMIカウントが5000未満、ミトコンドリア遺伝子の正規化カウントが8未満である。 腸オルガノイド細胞の場合: ミトコンドリア遺伝子の正規化数は 20 未満。フィルター処理後、合計 8997 個の免疫細胞 (若いサンプルでは 4423 細胞、古いサンプルでは 4574 細胞) と 13,054 個の腸オルガノイド細胞 (対照群では 5843 細胞、対照群では 7211 細胞) が残りました。 IFNγ処理グループ)は次の分析のために残されました。 バッチ効果は、コントロールオルガノイドおよびIFNγ処理オルガノイドからの単一細胞を統合するときに「正準相関分析（cca）」補正によって除去されました。

次元削減、グラフクラスタリング、UMAP/t-SNE の可視化

免疫細胞の場合、データセット内で高い細胞間変動を示す特徴のサブセット (7425 個の遺伝子) が、スーラの「mvp」方法 (平均カットオフ 0.0125 ～ 2、分散カットオフ > 0.9) で選択されます。これにより、変動性と平均発現の間の強い関係を制御しながら、変動する特徴を識別できます。 基本的に、特徴は平均表現に基づいて 20 のビンに分割され、 z 各ビン内の分散についてスコアが計算されました。

腸オルガノイド細胞の場合、データセット内で高い細胞間変動を示す特徴のサブセット (2000 個の遺伝子) が、スーラの「vst」方法を使用して選択されます。 特徴値は、log(分散)とlog(平均)の近似線モデルによって与えられる観察平均と期待分散を使用して標準化されました。 次に、最大値までクリップした後の標準化された値に基づいて特徴の分散が計算されます。

下流解析で可変遺伝子に焦点を当てることは、単一細胞データセット内の生物学的シグナルを強調するのに役立ちます。 データセット内のほとんどの変動性が確実に維持されるように、次元削減のために「mvp」または「vst」法によって特定されたすべての可変遺伝子を保守的に使用しました。 フィルタリングされたハッシュタグ分離遺伝子バーコード マトリックスの次元縮小は、これらの可変遺伝子に対して PCA によって適用されました。 次に、腸オルガノイドについては均一多様体近似および投影 (UMAP)、免疫細胞については t 分布確率的近傍埋め込み (t-SNE) を、細胞を視覚化するために上位 20 の主成分に対して実行しました。 一方、グラフベースのクラスタリングは、Seurat v3 を使用して次元削減されたデータに対して実行されました。

クラスターの鑑別解析とクラスター特異的遺伝子の同定

Seurat v3 で実装されている Wilcoxon 順位和テストを採用して、差分分析を実現しました。 各クラスターについて、老化における DEG は、各クラスター内のすべての細胞の平均遺伝子発現から生成されました。 同様に、各クラスターの各遺伝子の平均発現を他のすべてのクラスターの細胞の平均発現と比較して、特定のクラスターに豊富に含まれる遺伝子を特定しました。 各クラスターからの発現差に基づくランクの上位数個のクラスター特異的遺伝子を調べました。 各遺伝子の中心にある発現をヒートマップによる視覚化に使用しました。 免疫細胞サブセットの分類は、クラスター特異的遺伝子の注釈から推測されました。 さまざまな細胞型は、既知のマーカーを参照して手動で指定されました（補足データ） S4).

免疫細胞および腸オルガノイドの細胞比率の変化を検査する

オッズ比を計算して、老化または治療における各細胞タイプの相対存在量の変化を表しました。 これら XNUMX つのデータセットでは、いくつかの細胞タイプの頻度の劇的な変化が観察されました。 これらのシフトの統計的有意性は、各条件比較および細胞タイプに関して、観察された細胞数の変化の正確な超幾何確率 (置換なし) を計算することによって評価されました。

具体的には、（すべての細胞型の）合計 m 個と n 個の細胞がそれぞれ治療条件と対照条件で配列決定されたとすると、特定の細胞型について、観察された C 型の細胞の合計数が k と q であるかどうかをテストします。治療条件はそれぞれ、超幾何分布によって与えられるヌルモデルから大きく逸脱します。 これらの値が観測される確率は、「stats」パッケージの R 関数「phyper」を使用し、次のコマンドを使用して計算されました。 p = phyper(q, k, m, n) であり、超幾何として報告されました。 p 価値。 オッズ比の信頼区間は、R 関数「fisher.test」を使用して計算されました。

遺伝子機能アノテーション

統計的に有意な DEG (調整済み) p 値 < 0.05) は、Canonical Pathway および Upstream Regulator 分析用に QIAGEN IPA ソフトウェアにアップロードされました (Qiagen 2020、ver. 01-18-06)。 豊富な経路および上流調節因子の候補は IPA から取得できます。

モチーフの予測

モチーフ予測は、「-start -4.9.1 -end 1000 -len 500 -p 8,10 -b」の設定でソフトウェア HOMER-v4 によって実行されました。 計算には二項分布が使用されました p 豊かなモチーフの価値観。 分析は、腸内の分泌細胞のマーカーとして知られている遺伝子のプロモーターと腸細胞のマーカーとして知られている遺伝子のプロモーターに対して行われました。

統計と再現性

サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。 分析から除外されたデータはありません。 研究者らは、実験と結果の評価中に割り当てについて知らされていませんでした。

レポートの概要

研究デザインの詳細については、 ネイチャー ポートフォリオ レポートの概要 この記事にリンクされています。

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• 情報源： https://www.nature.com/articles/s41467-023-41683-y