材料の準備と特性評価

GO水溶液を脱イオン水で希釈して0.15 mg mlの濃度を得ました^-1 溶液を抽出し、0.025 µmの細孔を持つニトロセルロース膜で真空濾過し、GOの薄膜を形成しました。次に、脱イオン水中での湿式転写を使用して薄膜をターゲット基板に転写し、さらに 100 °C で 2 min の熱アニールを行いました。 GO フィルムと基板のスタックを標準オートクレーブ内で 134 °C で 3 h の間水熱還元して EGNITE を形成しました。 EGNITE のすべての特性評価研究のベース基板は正方形 (1 × 1 cm) でした²)Si/SiOの₂ (400 μm/1 μm)。

（例：XPS

XPS 測定は、超高真空条件 (ベース圧力、150 × 5) で Phoibos 10 分析装置 (SPECS) を使用して実行されました。 ^{- 10} mbar）、単色Al Kα X線源（1,486.74 eV）を使用。概要スペクトルはパスエネルギー50 eV、ステップサイズ1 eVで取得し、高分解能スペクトルはパスエネルギー20 eV、ステップサイズ0.05 eVで取得しました。これらの最後の条件での全体の分解能は、Ag 0.58 の半値全幅を測定することで決定され、3 eV です。dスパッタリングされた銀の 5/2 ピーク。 XPS 分析では、水熱処理後に C-O ピーク (エポキシド基に関連) が大幅に減少していますが、ヒドロキシル、カルボニル、およびカルボキシルによる C-OH、C=O、および C(O)OH の寄与は小さいことが示されています。削減後も残ります。 O1 のデコンボリューションs ピークはそのような動作を確認します。 C1への主な貢献s ただし、熱水還元後の信号は、 sp² 混成C-C軌道^34,57.

X線回折

X線回折測定（θ-2θ スキャン）は、マテリアルズリサーチ回折計（Malvern PANalytical）で実行されました。この回折計には水平方向の ω-2θ 320 つの円の幾何学形状のゴニオメーター (半径 XNUMX mm) を使用し、Cu Kα 陽極を備えたセラミック X 線管で動作しました (λ = 1.540598 Å）。使用される検出器は、Medipix2 テクノロジーに基づく高速 X 線検出器である Pixcel です。

ラマン分光法

ラマン分光測定は、488 nm レーザー励起線を備えた Witec 分光器を使用して実行されました。測定では、50 倍の対物レンズと nm あたり 600 本の溝を備えた格子を使用してラマン スペクトルを取得しました。サンプルの加熱を避けるために、レーザー出力は 1.5 mW 未満に維持されました。

TEM

EGNITE サンプルの断面研究のために、Helios NanoLab DualBeam (LMA-INA) を使用して集束イオン ビーム ラメラが準備されました。構造解析は、HRTEM および高角度環状暗視野 STEM 技術を含む、20 kV で動作する Tecnai F200 顕微鏡を使用した TEM によって実行されました。 STEM-EELS 実験は、20 KeV、口径 200 mm、カメラ長 5 mm、収束角 30 mrad、集光角 12.7 mrad で動作する Tecnai F87.6 顕微鏡で実行されました。コア損失取得の開始エネルギーとして 0.5 ピクセルあたり 250 eV、1,839 eV を使用したため、予想される 2,122 eV の Si K エッジ、2,206 eV の Pt M エッジ、および 100 eV の Au M エッジは取得されませんでした。 XNUMX eV。相対的な C-O 原子組成は、還元された GO 層に注目し、分析されたエッジ (この場合は C と O) の合計が XNUMX% であると仮定することによって得られます。この仮定は、次の例で証明されているように、このケースでも有効です。 補足情報 地図。エネルギー微分断面積は Hartree-Slater モデルを使用して計算され、バックグラウンドは低電力モデルを使用して計算されました。

電気伝導性

電気伝導率の測定は、Keithley 2400 ソースメーターを 1 点構成で使用して実行されました。測定したサンプルは 1 × XNUMX cm の EGNITE フィルムで構成されていました² SiO の上に₂ 基板。

データ分析

X 線回折、ラマン、および XPS データは、Python 3.7 パッケージ (Numpy、Pandas、Scipy、Xrdtools、Lmfit、Rampy、Peakutils、Matplotlib) を使用して分析されました。平面間の距離は、スネルの法則に従って X 線回折測定から計算されました。データが空間領域に移動されると、ピークの最大値が適合されました。対応する距離により、平面間の距離の平均値が得られました。これらの平均値からの偏差は、空間領域上のピークのローレンツ フィッティングの半値全幅から計算されました。 XPS およびラマン分光法測定は、対応する特徴の予想される位置にピークの畳み込みを当てはめることによって分析されました。 GO と EGNITE の導電率の値は、 I–V 電気伝導率測定で測定された曲線はオームの法則に従っています。データは n 測定ごとに = 1。

柔軟なアレイ製造

デバイスの製造を補足図に示します。 4。デバイスは4 インチSi/SiO上に製造されました₂ (400 μm/1 μm)ウェーハ。まず、厚さ 10 µm の PI (PI-2611、HD MicroSystems) の層をウェーハ上にスピンコートし、窒素を豊富に含む雰囲気中で 350 °C で 30 分間ベークしました。金属トレースは、イメージ反転フォトレジスト (AZ5214、Microchemicals) の光リソグラフィーを使用してパターン化されました。電子ビーム蒸着を使用してチタンを20 nm、金を200nm蒸着し、リフトオフを実行しました。電気化学的性能とアレイの柔軟性の間のトレードオフとして、厚さ約 1 μm の EGNITE フィルムを使用しました。 GO フィルムを転写した後、アルミニウムを電子ビーム蒸着し、ネガティブ フォトレジスト (nLOF 2070、Microchemicals) を使用して将来の微小電極の上の領域を画定し、リフトオフしました。次に、酸素反応性イオンエッチング (RIE) を 5 W で 500 分間使用して、将来の微小電極以外のすべての GO 膜をエッチングし、保護アルミニウム柱をリン酸と硝酸の希釈溶液でエッチングしました。次に、厚さ 3 μm の PI-2611 層をウェハ上に堆積し、前述のようにベークしました。次に、後続の酸素 RIE のマスクとして機能するポジ型の厚いフォトレジスト (AZ2611、Microchemicals) を使用して、微小電極上の PI-9260 開口部を定義しました。その後、再び AZ9260 フォトレジストと RIE を使用して、デバイスが PI 層上にパターン化されました。次いで、フォトレジスト層をアセトン中で除去し、ウェハをイソプロピルアルコール中で洗浄し、乾燥させた。最後に、デバイスをウェハから剥がし、滅菌パウチに入れて標準的なオートクレーブで 134 °C で 3 h の間水熱処理する準備が整いました。

微小電極の電気化学的特性評価

微小電極の電気化学的特性評価は、128 mM リン酸緩衝液、1 mM NaCl、および 4417 mM KCl、pH 10 を含む 137× PBS (Sigma-Aldrich、P2.7) 中で、Metrohm Autolab PGSTAT7.4N ポテンショスタットを使用し、45093 電極構成を使用して実行されました。 Ag/AgCl 電極 (FlexRef、WPI) を参照として使用し、白金ワイヤ (Alfa Aesar、XNUMX) を対電極として使用しました。

性能評価の前に、電極に 10,000 回の電荷平衡パルス (1 ms、15 µA) でパルスを与えました。電極を連続パルスプロトコルに曝露し、100 mV sで0.9回のサイクリックボルタンメトリーサイクル(-0.8〜+50 V)を実行^-1、20 パルス (5,000 ms) を 1 回繰り返し、開路電位を再決定します。

データ分析

電気化学的特性データは、Python 3.7 パッケージ (Numpy、Pandas、Scipy、Pyeis、Lmfit、Matplotlib) を使用して分析されました。インピーダンス分光法データは、抵抗 (R) 定位相要素 (CPE) と直列に接続されています。そこから、CPE 値を静電容量に近似し、微小電極の幾何学的面積で割って、EGNITE の界面静電容量と同等の値を取得しました。微小電極の電荷蓄積容量（CSC）は、測定された電流のカソードおよびアノード領域を統合し、スキャン速度で正規化することにより、サイクリックボルタンメトリー測定から計算されました。 EGNITE のスキャン速度 100 mV におけるカソードおよびアノードの電荷蓄積容量 (cCSC および aCSC) は、45.9 ± 2.4 および 34.6 ± 2.8 mC cm です。^-2、それぞれ（n = 3)。他の資料で報告されているとおり⁵⁸、取得されたCSCはスキャンレートに依存します（補足図。 5）。酸素還元反応の存在を評価するために、窒素パージした電解質下で CV 波形を測定しました。⁵⁹ 波形に大きな違いは観察されませんでした（補足図）。 6）。ただし、私たちの結果は、EGNITE の電荷注入能力における酸素還元反応の影響を完全には扱っていないため、これを適切に調査するには追加の作業を行う必要があります。微小電極の電荷注入容量 (CIC) は、電極の電気化学的な水ウィンドウ (Ag/AgCl に対して陰極では -0.9 V、陽極では +0.8 V) に一致する電圧差 (抵抗降下の除去後) を引き起こす電流パルス振幅を決定することによって確立されました。 ) (補足図。 17)⁶⁰.

統計分析

データは平均 ± 標準偏差、 n EIS の場合は = 18、 n = 3 クロノポテンショメトリーの場合。陰極容量性電圧変動のマップのデータは、各パルス形状の XNUMX つのイベントの陰極容量性電圧変動の平均です。 n = 3 電極。

機械的安定性評価

超音波処理

EGNITE 電極アレイを、超音波水槽 (Elmasonic P 180H) 内の水を満たしたビーカー内に配置しました。 37 kHz、15 Wで200 分間超音波処理を行った後、出力を15 Wに上げて37 kHzでさらに300 分間超音波処理を行いました。超音波処理ステップの前後で電極の画像を取得しました。

曲げ試験

曲げのセットアップ (図 2) 2k) 700 本の円筒形ロッドで構成されています。中央のもの（直径、131 µm）は下に下げられ、18°の曲げ角度が得られました。曲げ試験には 50 つの柔軟な微小電極アレイを使用しました。各アレイには、直径 10 µm の微小電極 20 個が含まれていました。 10 つのアレイは 10 サイクルと 10 サイクル後に測定されましたが、10 つのデバイスは測定後の取り扱い中に損傷したため、20 サイクルのみ測定されました。曲げ試験サイクルは、XNUMX 秒間の荷重適用と XNUMX 秒間の無負荷で構成されました。デバイスは、XNUMX 回および XNUMX 回の曲げサイクルの前後で電気化学的に特性評価されました (EIS および CV)。

皮質上神経記録

皮質上移植

すべての実験手順は、欧州共同体評議会の推奨事項および実験動物の管理と使用に関するフランスの法律に従って実行されました。プロトコールはグルノーブル倫理委員会 (ComEth) によって承認され、フランス省によって認可されました (番号 04815.02)。 Sprague-Dawley ラット (雄、生後 4 ヶ月、体重測定) 〜600 g）をケタミン（50 mg/kg（体重））とキシラジン（10 mg/kg（体重））で筋肉注射し、定位固定ホルダーに固定しました。側頭頭蓋骨を除去すると、聴覚皮質が露出しました。硬膜は皮質組織の損傷を避けるために保存されました。頂点に参照電極を挿入するための穴を開け、最初の穴から前方に 7 mm 離れた位置に 0.5 番目の穴をあけて接地電極を挿入しました。電極は、集積回路ソケットに使用される厚さ XNUMX mm のピンでした。それらは硬膜と電気的に接触するように配置され、歯科用セメントで頭蓋骨に固定されました。次に、図に示すように、表面微小電極リボンを聴覚皮質に取り付けました。 3b。静脈パターンは、クリーグのラットの脳地図の領域 41 にある聴覚皮質を特定します。皮質信号は同時に 1,000 のゲインで増幅され、33 kHz のサンプリング レートでデジタル化されました。ラットの耳の前20 cm、露出した皮質の反対側にあるスピーカーが音響刺激を伝えました。与えられた刺激は、耳の近くに配置された 0.25 インチのマイク (Brüel & Kjaer、4939) で監視され、音圧レベル (dB SPL re 20 μPa) で表示されました。 80 dB SPLでの交互のクリックと70 dB SPLでのトーンバースト刺激、5〜40 kHzの範囲の周波数、5 msの立ち上がり時間と立ち下がり時間、および持続時間は200 msです。

データ分析

電気生理学的データは、Python 3.7 パッケージ (Numpy、Pandas、Scipy、Neo、Elephant、Sklearn Matplotlib) とカスタム ライブラリ PhyREC (https://github.com/aguimera/PhyREC）。実効値値は、20 Hzを超える周波数で200 msのスライディングウィンドウを使用して計算されました。スペクトログラムは 70 Hz から 1.1 kHz までの範囲で計算されました。 PSDは60 秒の連続録画にわたって計算されました。所定の電極アレイについて、生体内 (IV) と死後 (PM) の 20 つの PSD が計算されました。 SNR は dB (20 × ln(r.m.s.(IV)/r.m.s.(PM))) で表され、10 Hz から 1 kHz までの対数間隔の XNUMX ポイントで補間されます。

統計分析

図に示される皮質上神経データ。 3 単一の動物の個別の測定値から取得されます。図では、 3c、64 個の電極からのデータが表示されます。図では、 3d、選択した 2 つの電極からのデータが表示されます。図では、 3f、PSD と SNR は 64 個の EGNITE 電極から計算され、mean ± s.d として表示されます。補足図では、 12c、d 中央値データは、192 個の EGNITE 電極について示されています。 n = 3 つの実験と 60 個のプラチナ電極 n = 1 回の実験。

皮質内神経記録

皮質内移植

動物はケタミン/キシラジンの混合物(75:1、0.35 ml/28 g腹腔内)で麻酔され、この状態は1.5%イソフルランを提供する吸入マスクで維持されました。インプラントを安定させるためにいくつかのマイクロネジが頭蓋骨に配置され、小脳の上にあるマイクロネジが一般的な接地として使用されました。プローブは前頭前皮質に埋め込まれました（座標：AP、1.5 mm、ML、±0.5 mm、DV、ブレグマから-1.7 mm）。移植は、一時的なプローブの剛性を提供し、プローブの挿入を容易にするために、プローブをマルトースでコーティングすることによって実行されました（以下のプロトコルを参照）。プローブは歯科用セメントで密閉されました。 TDT-ZifClip コネクタを使用して、小型ケーブルを介してプローブを電気生理学的システムに接続しました。手術後、マウスは鎮痛剤 (ブプレノルフィン) と抗炎症剤 (メロキシカム) 治療を受けて 1 週間の回復期間を経ました。神経活動は、Intan RHD30 アンプを使用し、サンプリング レート 2132 kHz のマルチチャンネル Open Ephys システムで記録されました。聴覚課題の実験は、前述の研究に基づいたプロトコルを使用して、内部に XNUMX つのスピーカーを備えた防音ボックス内で実施されました。⁶¹。音刺激は、15 ミリ秒の長さのホワイト ノイズ クリックで構成され、各回の間隔は 100 秒 (刺激間隔) で 5 回 (サイクル) 繰り返されました。課題中、動物は自由に動くことができた。

マルトース補強材プロトコル

マルトース水溶液をガラス転移点（T_g)、ホットプレートまたは電子レンジを使用して、130〜160 °Cの間で加熱します。マルトースが粘性を帯びると、プローブの裏側はマルトースとのみ接触します。マルトースが冷えると、プローブが硬くなり、硬くなります。

データ分析

各電極からの神経信号はオフラインでフィルタリングされ、SUA と LFP が抽出されました。 SUA は 450 ～ 6,000 Hz の信号をフィルター処理することで推定され、個々のニューロンからのスパイクは Offline Sorter v.4 (Plexon) による主成分分析を使用して分類されました。 LFP を取得するために、Python で作成したカスタム スクリプトを使用して信号を 1 kHz にダウンサンプリングし、トレンド除去とノッチ フィルター処理を行ってノイズ ライン アーティファクト (50 Hz とその高調波) を除去しました。 AEP SNR は、ピーク N1 振幅と標準偏差の比として計算されました。刺激前の 20 ms 期間。

統計分析

データを図に示します。 3時間、私 は平均値 ± 標準偏差、 n = 30 は平均試行回数です。同じ電極から記録されたデータは、30、60、および90日目に示されています。単一の動物からのデータが表示されています。

慢性外皮質生体適合性

デバイスの外科的埋め込み

この研究には、合計 27 匹の成体雄の Sprague-Dawley ラットを使用しました (Charles River)。動物は、周囲温度 21 ± 2 °C、湿度 40 ～ 50%、12 h 明/12 h 暗サイクルで飼育されました。ラットをグループで飼育し、実験期間中、食餌と水を自由に摂取させた。実験手順は、英国内務省および地元の動物福祉倫理審査機関 (AWERB) の承認の下、動物福祉法 (1998 年) に従って実施されました。手術中、動物はイソフルラン（2～3％）で麻酔され、麻酔の深さはつま先つまみ反射テストによってモニタリングされました。動物を定位固定フレーム (Kopf、900LS) に置き、体温を維持するためにサーマルブランケットの上に配置しました。開頭手術の穴 (〜5 mmのバリドリルビットを備えた歯科用ドリルを使用して、正中線から4 mm離れた位置に1 mm ×0.9 mm）の切片を作成し、硬膜を除去し、上皮質デバイスを脳の皮質表面に配置しました。開頭術の穴を Kwik-sil で密閉し、続いて歯科用セメントで固定し、皮膚を縫合して閉じました。失われた体液を補充し、術後の痛みを軽減するために、生理食塩水（1 ml/kg（体重））とブプレノルフィン（0.03 mg/kg（体重））の皮下注射が行われ、麻酔が解除されました。

組織の収集と処理

動物は、実行される分析の種類に応じた適切な方法により、移植後 2、6、または 12 週間で殺処分されました。

組織学および免疫組織化学

移植後 2、6、または 12 週間で、ヘパリン添加 (10 U ml) による心臓灌流によってラットを終了させました。^-1、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）ＰＢＳ、続いてＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。脳を4% PFAで4 時間後固定し、その後少なくとも24 時間PBS中の30%スクロースに移した後、イソペンタンで凍結しました。その後、脳は 48 µm で凍結切片化されるまで、-80 °C で保存されました。次に、組織をイオン化カルシウム結合アダプター分子 25 (Iba-1) で染色して、ミクログリアの活性化レベルを測定しました。簡単に説明すると、組織切片を、1% Triton-Xを含むPBS中の5%ヤギ血清で0.1時間ブロックした後、一次抗体抗Iba-1（4:1、1-1,000; Wako）とともに019 ℃で一晩インキュベートしました。次に、切片を二次抗体である抗ウサギ Alexa Fluor 19741 (594:1、A-400; Thermo Fisher) で室温で 11012 時間染色しました。 1-ジアミジノ-4,6-フェニルインドール（Thermo Fisher）を含むProlong Gold退色防止封入剤を使用して、スライドをカバースリップで封入しました。プローブは 2 × 3 mm の領域をカバーしました² 脳の皮質表面上。染色のために選択された組織切片は、この領域の長さ 3.2 mm をカバーしていました。 3DHistech Pannoramic-250 顕微鏡スライド スキャナーを使用して 20 倍でスライドを画像化し、CaseViewer v.2.4 (3DHistech) を使用して画像を分析しました。ミクログリアの活性化を評価するために、3.2 mmの領域がカバーされ、100 μmごとに8.5枚の画像が分析されました。画像は3倍の倍率で撮影され、脳の正中線からXNUMX mmの位置にある、プローブ部位の直下の領域を含む外皮質プローブ部位のセクションの詳細が撮影されました。

画像処理

顕微鏡データは、ミクログリア表現型の特徴付けのためのアルゴリズムを使用して画像処理されました（補足図）。 13）。ミクログリアの活性化は、カスタム CellProfiler* (Broad Institute、v.3.1.9 より) を使用して分析されました。 https://cellprofiler.org/) パイプライン。まず、EnhanceOrSuppressFeature モジュールを使用して、チューブネス強化方法を適用することで神経突起のような繊維状構造を強化しました。強化された画像から、IdentifyPrimaryObjects モジュールを使用してセルがセグメント化されました。細胞の予備測定では、適切な物体直径の範囲は 3 ～ 40 ピクセルであることが示唆されました。この直径範囲外のオブジェクト、または画像の端に触れているオブジェクトは破棄されました。セルは、適応ウィンドウ サイズ 50 ピクセルの XNUMX クラス Otsu 適応閾値戦略を使用してセグメント化されました。 IdentifyPrimaryObjects モジュールによって識別されたオブジェクトは、MeasureObjectSizeShape モジュールに入力され、セル分類に必要なプロパティが計算されます。 ClassifyObjects モジュールでは、分類の基礎となるカテゴリが AreaShape に指定され、範囲が対応する測定値として選択されました。細胞は次のように分類されました。 '範囲プロパティ (セルが占める領域とその境界ボックスが占める領域の比率) に基づいて、「アクティブ化」または「非アクティブ化」が決まります。この分類アプローチは、活性化ミクログリアは細胞体が大きく突起を持たないため、非活性化ミクログリアよりも境界ボックスのはるかに大きな割合を占めるという事実によって合理化されました。最後に、CalculateMath モジュールと ExportToSpreadsheet モジュールを使用して、必要な統計を計算して出力しました。

統計分析

データセットは n 各デバイスタイプ（PI のみのインプラント（PI）、露出した微細加工された金を含む PI（金）、およびすべての時点で微細加工された金と EGNITE（EGNITE）を含む PI）で = 3。ただし、6 週のゴールドは例外です。 n ELISA データの場合は = 2。対側の半球を各時点で組み合わせて、 n 移植後 9 週間および 2 週間で = 12、および n 移植後 8 週間で = 6。データの分析は、GraphPad Prism v.8 ソフトウェアを使用して行われました。統計分析は、必要に応じて Tukey の多重比較検定を使用した二元配置分散分析 (ANOVA) を使用して完了しました。 P < 0.05 は有意であるとみなされます。

ELISA

移植期間の後、動物は頸椎脱臼により終了させられた。脳組織は脳の右半球と左半球の両方から抽出され、液体窒素中で急速冷凍され、さらに使用されるまで-80 °Cで保存されました。プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail、Thermo Fisher）を含む NP-40 溶解バッファー（150 mM NaCl、50 mM Tris-Cl、1% Nonidet P40 代替品、Fluka、pH 7.4 に調整）を使用して組織を溶解しました。続いて組織を機械的に破壊します（TissueLyser LT、Qiagen）。次にサンプルを10 rpmで5,000 分間遠心分離し、上清をさらに使用するまで4 ℃で保存しました。ビーズベースのマルチプレックス ELISA キットである LEGENDplex Rat Inflammation Pannel (カタログ番号 740401、BioLegend) を実行して、以下のサイトカインを定量しました。 IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IL-18、IL-33、CXCL1 (KC)、CCL2 (MCP-1)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロンγおよび腫瘍壊死因子。キットはメーカーの指示に従って、タンパク質を 15 µl の固定容量でロードして実行されました。上清とのインキュベーション後、ビーズを BD FACSVerse フローサイトメーターで実行し、LEGENDplex データ分析ソフトウェアを使用してデータを分析しました。

神経刺激

筋膜内移植

すべての動物実験は、欧州共同体評議会指令 2010/63/EU に従って、バルセロナ自治大学の倫理委員会によって承認されました。動物は22 ± 2 ℃、12 時間の明/12 時間の暗サイクル下で飼育され、餌と水は自由に摂取できました。麻酔をかけたメスのSprague-Dawleyラットの坐骨神経（250〜300 g、 〜生後18 週）を外科的に露出し、10-0ループ糸に取り付けた真っ直ぐな針の助けを借りて、坐骨神経を横断してTIME電極を埋め込みました。⁴⁶。このプロセスは、神経束内の活性部位の正しい位置を確認するために、解剖顕微鏡下で監視されました（図2）。 4b）。実験中、動物の体温は加熱パッドで維持されました。

神経刺激は、各相100 μsの固定持続時間の二相電流パルス列を適用し、0 Hzで150 秒間、1または3 μAステップで3から33 μAまで振幅を増加させることにより、異なるEGNITEを介して実行されました（刺激装置DS4、デジタイマー）。微小電極。同時に、各筋肉に配置された小さな針電極（長さ 13 mm、直径 0.4 mm、ステンレス鋼針電極 A-03-14BEP、Bionic）を使用して、GM、TA、および PL 筋肉から CMAP を記録しました。⁶²。活性電極は筋肉の腹部に配置され、参照電極は腱のレベルに配置されました。筋電図記録は増幅され（GM および TA では ×100、PL では ×1,000、P511AC アンプ、Grass）、バンドパス フィルター処理（3 Hz ～ 3 kHz）され、PowerLab 記録システム（PowerLab16SP、ADIstruments）を使用して 20 kHz でデジタル化されました。

データ分析

各 CMAP の振幅は、ベースラインから最大の負のピークまで測定されました。電圧ピーク測定値は、実験で各筋肉について得られた最大 CMAP 振幅に正規化されました。選択性指数 (SI) は、1 つの筋肉、CMAP の正規化された CMAP 振幅間の比率として各活性部位について計算されました。_i、式 SI に従う 3 つの筋肉の正規化された CMAP 振幅の合計_i = nCMAP_i/∑nCMAP_j、機能的に関連する最小限の筋肉反応を誘発する最小刺激電流振幅（事前に決定されている筋肉の 5 つの筋肉の最大 CMAP 振幅に対して少なくとも XNUMX% の CMAP 振幅として定義）。次に、XNUMX つの筋肉のそれぞれについて最も高い SI を持つ活性部位が、所定の実験における各筋肉の SI として選択されました。

慢性神経内生体適合性

以前に報告された手順に従って^50,63、麻酔をかけたSprague-Dawley雌ラットの坐骨神経（250〜300 g、 〜生後18 週）が曝露され、EGNITEの有無にかかわらず生体内生体適合性を確保するためのデバイスが坐骨神経の脛骨枝に縦方向に埋め込まれました（n = 6グループあたり8〜10）。簡単に説明すると、0-6 ループ糸 (STC-XNUMX、Ethicon) に取り付けられた直線針で神経の三分岐点を刺します。糸が曲がった電極ストリップの矢印の形をした先端を引っ張ります。先端は糸を取り除くためにカットされており、各アームの先端はデバイスの抜け落ちを防ぐためにわずかに曲がっています。縦方向のインプラントが選択されたのは、神経内部の異物反応をよりよく研究できるためです。⁵⁰.

神経および動物の機能評価

移植後の追跡調査中に、動物は神経伝導、代数測定、および歩行路運動試験によって評価されました。⁶²。伝導試験では、移植された足と反対側の足の坐骨神経を坐骨切痕の針電極で刺激し、PL筋のCMAPを上記のように記録しました。 CMAP の潜時と振幅を測定しました。代数測定試験では、ラットを金網プラットフォームに置き、電子フォンフライ代数計 (Bioseb) に接続された金属チップを使って機械的非有害な刺激を加えました。移植された足と反対側の足の侵害受容閾値（動物が足を引っ込めるグラム単位の力）を測定した。歩行路試験では、後足の足底表面に黒いインクを塗り、各ラットを廊下に沿って歩かせた。足跡が収集され、坐骨機能指数が計算されました⁶².

組織学

2 週間または 8 週間後、動物に PFA (4%) を灌流し、坐骨神経を採取し、後固定し、凍結保存し、組織学的分析のために処理しました。 FBRの評価のために、坐骨神経をクライオスタット(Leica CM15)を用いて厚さ190μmの横断切片に切断した。サンプルを、有髄軸索（ニューロフィラメント 97K を標識する抗 RT200、1:200; Developmental Studies Hybridoma Bank）およびマクロファージ（抗 Iba-1、1:500; Wako）に対する一次抗体で染色しました。次に、切片を二次抗体ロバ抗マウス Alexa Fluor 1 およびロバ抗ウサギ Alexa Fluor 488 (555:1、Invitrogen) とともに室温で 200 時間インキュベートしました。脛骨神経のインプラントの中央部分から代表的な切片を選択し、デジタル カメラ (DS-Ri2、Nikon) に取り付けられた落射蛍光顕微鏡 (Eclipse Ni、Nikon) で画像を撮影し、ImageJ ソフトウェア (National Institutes) で画像解析を実行しました。健康）。脛骨神経の全領域における Iba-1 陽性細胞の量を定量化し、組織被膜の厚さをインプラントの各側面から最も近い軸索までの平均距離として測定しました。

統計分析

データの統計分析には、一元配置分散分析または二元配置分散分析を使用し、その後、グループ間または時間間の差異についてボンフェローニ事後検定を使用しました。グラフ表現と分析には、GraphPad Prism ソフトウェアを使用しました。統計的有意性が考慮されたのは次の場合です。 P <0.05。

レポートの概要

研究デザインの詳細については、 ネイチャー ポートフォリオ レポートの概要 この記事にリンクされています。

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• 情報源： https://www.nature.com/articles/s41565-023-01570-5