ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびペプチド-オリゴヌクレオチド結合体の合成と特徴付け

すべてのペプチドおよびオリゴヌクレオチドは、それぞれ CPC Scientific および Integrated DNA Technologies (IDT) によって合成および HPLC 精製されました。 ペプチド-オリゴヌクレオチド複合体は、銅を含まないクリックケミストリーによって生成されました。 コンジュゲートをＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣで精製した。 コンジュゲートの質量スペクトル分析は、Bruker モデルの MicroFlex マトリックス支援レーザー脱離/イオン化 - 飛行時間分析法で実行されました。 利用されたすべての分子の配列は、補足表に記載されています 1 & 3.

Cas12a 蛍光切断アッセイ

LbaCas12a (最終濃度、100 nM; New England Biolabs (NEB)) を 1 × NEB Buffer 2.1、crRNA (250 nM; IDT)、および相補的 DNA 活性化因子 (4 nM (特に記載のない限り、溶液中または尿に添加); IDT) とともにインキュベートしました。 ) または実験動物から採取した尿サンプルを、50 °C で 37 分間 30 μl 反応させます。 反応物を 4 × NEB Buffer 1 および ssDNA T で 2.1 倍に希釈しました。₁₀ FQ レポーター基質 (30 pmol; IDT) を 60 ウェルあたり XNUMX μl の反応量に加え、XNUMX 回実行します。 LbaCas12aの活性化は、Tecan Infinite Pro M37プレートリーダーで蛍光を測定することにより、2°C​​で3分ごとに200時間検出されました(λ_ex = 485nm、 λ_em = 535 nm)。 すべてのオリゴヌクレオチドの配列は補足表に記載されています 1. バックグラウンド条件（DNAアクティベーター入力なしまたはcrRNA条件なし）の蛍光をネガティブコントロールとして使用しました。 Cas12a ssDNase 活性は、プレート リーダーによって生成された反応速度曲線 (合成プローブの蛍光対時間) から計算されました。 初期反応速度 (V₀) 運動曲線の線形フェーズ (8 ~ 10 の初期時点) の勾配に対応します。 分析は Python v.3.9 で実行されました。

ラテラルフロー読み出しによる Cas12a 切断アッセイ

上記のCas30a活性化アッセイと同様に、サンプルを37°Cで12分間インキュベートしました。 次に、反応物を 4 × NEB Buffer 1 と ssDNA T で 2.1 倍に希釈しました。₁₀ FAM-ビオチン レポーター基質 (1 pmol; IDT) を反応量 100 μl に加え、37 °C で 1 ～ 3 時間インキュベートします。 HybriDetect 1 ラテラル フロー ストリップを溶液 (20 μl の Milenia Hybridetect バッファーを含む 80 μl のサンプル) に浸しました。 バンドの強度は、ImageJ v.1.49 で定量化されました。

Cas12a ssDNase 活性の DNA アクティベーター濃度または長さの特徴付け

Cas12a での検出に最適な長さを特定するために、10 ～ 34 nt の切り捨てられたネイティブおよび修飾された DNA アクティベーターの長さをテストしました。 in vivo での堅牢性を判断するために、さまざまな長さのホスホロチオエート修飾 DNA 活性剤を 1 nmol で BALB/c マウスに注射し、注射の 1 時間後に尿サンプルを採取しました。 尿サンプルは、Cas12a 蛍光切断アッセイで DNA 活性化因子として使用されました。 各 DNA 活性化因子によって引き起こされる Cas12a ssDNase 活性は、24-mer 修飾 DNA 活性化因子の活性に対して正規化されました。

Fluidigm の検出とデータ分析

Cas12検出反応は、マイクロ流体遺伝子発現（GE）96.96統合流体回路（IFC）（Fluidigm）にロードするために、アッセイミックスとサンプルミックスの10つの別々のミックスにしました：アッセイミックスにはXNUMXμMが含まれていました LbaCas12a (NEB)、1× Assay Loading Reagent (Fluidigm)、1× NEB Buffer 2.1、および 1 μM crRNA で、反応あたりの総容量は 16 μl。 サンプル ミックスには、25.2 U RNase 阻害剤 (NEB)、1 × NEBuffer 2.1、1 × ROX Reference Dye (Invitrogen)、1 × GE Sample Loading Reagent (Fluidigm)、9 mM MgCl が含まれていました。₂ および 500 nM 消光合成蛍光 DNA レポーター (FAM–T₁₀–3IABkFQ、IDT) 12.6 μl の総量。 次に、シリンジおよび4μlのアッセイまたはサンプル混合物を、マイクロ流体GE 96.96 IFCのそれぞれの位置にロードし、製造元の指示に従って実行しました。 IFC は、'Load Mix' スクリプトが実行された Juno (Fluidigm) にロードされました。 IFC を適切にロードした後、Biomark HD のカスタム プロトコルを使用して 3 時間にわたって画像を収集しました。

Fluidigm システムによって生成されたデータを分析するために、ガイドとターゲットのペアについて、参照正規化されたバックグラウンドを差し引いた蛍光をプロットしました。 ガイドとターゲットのペアの場合 (特定の時点で、 t、およびターゲット濃度)、最初に参照正規化値を (中央値 (P_t  -  P₀）/（R_t  -  R₀）） どこ P_t はその時点での誘導信号 (FAM) であり、 P₀ は反応前のバックグラウンド測定値です。 R_t はその時点での基準信号 (ROX) であり、 R₀ はそのバックグラウンド測定値であり、中央値は複製全体で取得されます。 データは、Python 3、R 4、および Prism 9 を使用して視覚化されました。

組換えナノボディのクローニングと発現

NcoI および BlpI 制限部位に隣接する目的のナノボディをコードする二本鎖 gBlocks 遺伝子フラグメントは、IDT に注文しました。 遺伝子断片は、NcoI および BlpI 制限部位で Novogen pET-28a(+) 発現ベクターにクローニングされ、SHuffle T7 コンピテントに形質転換されました。 大腸菌 (ネブ)。 正しい遺伝子挿入をコードする細菌コロニーは、サンガーシーケンシングで確認されました。 その後の組換えタンパク質生産のために、SHuffle T500 コンピテントの 7 ml 二次培養 E. 大腸菌の. 目的のナノボディ遺伝子をコードする は、37 nm での光学密度 (OD3) が約 600 ～ 600 に達するまで、一晩 0.6 ml の初代培養から 0.8 °C のカナマイシン添加 LB ブロスで増殖させました。 次に、イソプロピルβ-を添加してナノボディの発現を誘導しました。d-1-チオガラクトピラノシド (IPTG) (最終濃度 0.4 mM)。 培養物を27°Cで24時間インキュベートしました。 細菌ペレットをB-PER完全細菌タンパク質抽出試薬（Thermo Fisher Scientific）で溶解し、Ni-NTAアガロース（Qiagen）を使用した標準の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）で精製しました。 ナノボディ生成物は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析によって確認されました。 この研究で利用されたナノボディの配列は、補足表に記載されています 3.

ナノボディコアを用いたDNAコード合成尿バイオマーカーの合成

ナノボディ (2 mg) を Pierce 固定化 TCEP ジスルフィド還元ゲル (7.5% v/v) (Thermo Fisher Scientific) で室温で一晩インキュベートし、以前に確立されたプロトコルに従って C 末端システインを選択的に還元しました。³⁷. 還元型 C 末端システイン (1 当量) を PBS (pH 4、6.5 mM EDTA) 中のスルホ DBCO-マレイミド架橋剤 (1 当量) (Click Chemistry Tools) と室温で 6 時間反応させた後、過剰な架橋剤を使い捨ての PD-10 脱塩カラム (GE Healthcare Bio-Sciences) で除去しました。 DBCO官能化ナノボディは、ÄKTA高速タンパク質液体クロマトグラフィー（GE Healthcare）によってさらに精製されました。 DNAレポーター結合は、DBCO官能化ナノボディ（1当量）をアジド官能化DNAレポーター（1.1当量）とPBS（pH 7.4）中で室温で24時間インキュベートすることによって行った。 サイズ排除クロマトグラフィーにより、過剰なDNAレポーターを除去した。 生成物は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析によって確認され、Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit で定量化されました。 この研究で利用されたDNAバーコード合成尿バイオマーカーの配列は、補足表にリストされています 4.

高分子コアを用いたDNAコード合成尿バイオマーカーの合成

マレイミド反応性ハンドル（JenKem Technology）を含む多価PEG（40 kDa、100アーム）を7.0 mMリン酸緩衝液（pH 0.2）に溶解し、ろ過しました（孔径、2μm）。 ろ過後、システイン末端ペプチド-DNAコンジュゲートを4倍モル過剰でPEGに加え、室温で少なくとも200時間反応させました。 非結合分子は、ÄKTA高速タンパク質液体クロマトグラフ（GE Healthcare）でSuperdex 10 Increase 300/10 GLカラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーを使用して分離されました。 精製されたナノセンサーをスピンフィルター（分子量カットオフ、200 kDa; Millipore）で濃縮し、Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit（Thermo Fisher Scientific）で定量化しました。 Tecan Infinite Pro MXNUMX Quant-iTプレートリーダーで蛍光を読み取った λ_ex = 485nm、 λ_em = 535 nm。 粒子は、PBS で 4 ° C で保存されました。 動的光散乱 (Zeta Sizer Nanoseries、Malvern Instruments) を使用して、ナノ粒子の流体力学的直径を特徴付けました。 DNAバーコード化された合成尿バイオマーカーの配列は、補足表に記載されています 4.

極低温透過型電子顕微鏡

5プレックスポリマーコアベースのDNA-SUBをプールし、0.5 mg ml に濃縮しました^-1 DNA濃度による。 サンプルは、連続炭素フィルムでコーティングされたレース状の銅グリッドにロードされました。 次に、グリッドを、透過型電子顕微鏡カラムに配置された Gatan 626 シングルチルト クライオホルダーに取り付けました。 サンプルを液体窒素で冷却し、顕微鏡に移す間は低温に保ちました（2100 kVに設定されたJEOL 200 FEG顕微鏡、倍率10,000〜60,000）。 すべての画像は、Gatan 2kx2k UltraScan 電荷結合素子カメラを使用して記録されました。

トランスクリプトームおよびプロテオーム解析

ヒト結腸腺癌の RNA-Seq データは、Cancer Genome Atlas Research Network (http://cancergenome.nih.gov）。 差次的発現分析は、DESeq2 1.10.1 を使用して実行されました。 ヒト結腸癌および正常結腸組織における細胞外マトリックスの組成に関するプロテオミクス データは、細胞外マトリックス成分の質量分析分析によって得られ、Matrisome (http://matrisomeproject.mit.edu/).

細胞培養

マウス細胞株 MC26-LucF (ホタルルシフェラーゼを保有、Kenneth K. Tanabe Laboratory、マサチューセッツ総合病院から) を、10% (v/v) ウシ胎児血清 (Gibco)、1% ( v/v) ペニシリン/ストレプトマイシン (CellGro) 37 ° C、5% CO₂. ヒト細胞株 PC-3 (ATCC CRL-1435) は、1640% (v/v) ウシ胎児血清および 10% (v/v) ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した RPMI1 (Gibco) で増殖させました。 RWPE1 (ATCC CRL-11609) 細胞は、2.5 μg のヒト組換え上皮成長因子と 25 mg のウシ脳下垂体抽出物を添加したケラチノ サイト無血清培地 (Gibco) で培養しました。 すべての細胞株は、マイコプラズマ汚染について陰性でした。

動物モデル

すべての動物研究は、マサチューセッツ工科大学 (MIT) の動物管理委員会 (MIT プロトコル 0420-023-23 および 0220-010-23) によって承認されました。 すべての実験は、機関および国のガイドラインに準拠して実施され、MIT スタッフの比較医学部門 (DCM) によって監督されました。

女性の BALB/c (BALB/cAnNTac、生後 6 ～ 8 週、Taconic Biosciences)、女性の NCr ヌード (CrTac:NCr-Foxn1)^nu、生後 4 ～ 5 週、Taconic Biosciences)、および女性と男性 Kras^LSL−G12D/+;TRP53^{fl / fl} C57L/B6 (KP) マウス (8 ～ 16 週齢、MIT の Tyler Jacks Laboratory から寄贈) を実験に使用しました。 マウスは、コッホがん研究所の動物施設で、12 時間の明/12 時間の暗サイクル (07:00–19:00)、~18~23 °C、~50% の湿度で維持されました。 オートクレーブされた水と標準的な固形飼料はいつでも利用可能でした。 ＮＣｒヌードマウスは、免疫不全専用の部屋、オートクレーブされたケージおよび紙製の寝具に収容され、無菌技術で取り扱われた。 腫瘍の直径が 5 mm を超える場合、マウスの健康状態を毎週および毎日チェックしました。 獣医師の基準に従ってマウスを安楽死させた (たとえば、腫瘍サイズ > 1 cm、体調不良)。 グループごとに少なくともXNUMX匹のマウスのサンプルサイズを使用しました。 尿中のバーコード レベルを比較すると、グループ サイズは XNUMX 以上です (両側 t-test、α を 0.05 に設定)。 同性の同腹子は、実験群と対照群に無作為に割り当てられました。

CRC 肺腫瘍を確立するために、ルシフェラーゼ発現 MC26-Fluc 細胞株 (マウスあたり 100,000 細胞) を静脈内注射によって BALB/c 雌マウスに接種しました。 IVISイメージングシステム（PerkinElmer）を使用して腫瘍の進行を毎週監視し、Living Image（PerkinElmer）で定量化しました。 PCa 異種移植モデルを確立するために、イソフルラン麻酔下で、NCr ヌード雌マウスにヒト PC-3 細胞株 (側面あたり 5 万個の細胞、マウスあたり 2 つの側面) を接種しました。 細胞は、30% Corning Matrigel Membrane Matrix (Thermo Fisher Scientific) および低血清培地 (Opti-MEM、Gibco) で調製しました。 腫瘍を毎週測定し、側腹部腫瘍の長さまたは幅が約 5 mm (約 200 mm) に達したら実験を実施しました。³）または接種後3週間。 腫瘍体積は、側腹部の長さと幅をキャリパーで測定することによって計算されました。 体積計算は式に従った f_x = (幅² × length)/2、ここで長さは長いセグメントです。

自発性肺腫瘍を誘発するために、我々は最初に Kras^LSL−G12D/+;TRP53^{fl / fl} C57L/B6 (KP) マウス^42,43 の発癌性対立遺伝子の活性化 クラス 腫瘍形成プロセスを開始するのに十分であり、追加の欠失または点突然変異 TRP53 腫瘍の進行を大幅に促進し、より進行した疾患の特徴を持つ腺癌のより急速な発生につながります。 肺腫瘍は、50μlのアデノウイルス-SPC-Cre（2.5×10⁸ イソフルラン麻酔下で、10〜8週齢の雌または雄のKPマウスで16 mM塩化カルシウムを含むOpti-MEMでプラーク形成単位。 対照コホートは、AdenoCre の気管内投与も受けた、年齢と性別が一致したマウスで構成されていました。 KP マウスは、実験が行われるまで腫瘍の成長を可能にするために、さらに介入することなく維持されました。

尿中 DNA バーコード活性化 Cas12a 切断アッセイの分析

ssDNA (1 nmol)、5 プレックス DNA バーコード PEG センサー (それぞれ 0.2 nmol、合計 DNA バーコード濃度で 1 nmol)、または DNA バーコード ナノボディ センサー (DNA バーコード濃度で 1 nmol) を実験用マウスに静脈内注射しました。 尿サンプル (マウスあたり 100 ～ 200 μl) を毎日 12:00、DNA またはセンサー注入の 1 時間後に収集し、初期反応速度を決定するために Cas12a 活性化についてアッセイしました (V₀）。 平均正規化は V₀ 尿濃度の動物間の変動を説明する値。 蛍光レポーターを利用したCas12a切断アッセイでは、 y 軸は正規化された平均を表します V_{0_担癌動物}/正規化された平均 V_{0_コントロール動物}. 次に、同じ尿サンプルを利用して、LFA 読み出しによる Cas12a 切断アッセイを実行しました。 得られた紙片は、整列とスキャンを同時に行いました。 ImageJ v.1.49vでバンド強度を定量化しました。

体内分布および薬物動態研究

近赤外色素標識剤を使用して、in vivo での自己蛍光バックグラウンドからの干渉を最小限に抑えました。 BALB/c マウスに Cy5 標識修飾またはネイティブ DNA 分子 (1 nmol) を静脈内注射し、注射後 30 分および 1、2、3、4 時間後に尿サンプルを採取しました。 ナノボディ-DNA コンジュゲートをスルホシアニン 7 NHS エステル (Lumiprobe、タンパク質の 2 色素当量) と結合させ、一晩反応させ、スピンろ過によって精製し、PC-3 担癌ヌードマウスに静脈内注射しました。 24時間後、マウスを安楽死させ、剖検を行って腫瘍、肺、心臓、腎臓、肝臓、および脾臓を取り除いた。 IVIS および Odyssey CLx イメージング システム (LI-COR) を使用して、尿、血液、臓器をスキャンしました。 臓器の蛍光は、Odyssey CLx の ImageStudio によって定量化されました。 マウスあたり 10 nmol の色素で Cy30 標識 DNA または PEG を静脈内注射した後、2 分、3 分、5 時間、および 1 時間の連続採血により、BALB/c マウスの血液循環動態をモニターしました。 薬物動態測定用の血液は、尾静脈採血を使用して収集されました。 血液は、凝固を防ぐために 5 mM EDTA を含む PBS で希釈し、5 で 5,000 分間遠心分離しました。g、および蛍光レポーター濃度は、Odyssey CLx の標準と比較して 384 ウェルプレートで定量化されました。

組織学、免疫組織化学および免疫蛍光研究

パラフィン包埋組織を 4% パラホルムアルデヒドで一晩保存し、パラフィンに包埋する前に 70% エタノールで保存しました。 急速冷凍組織を2％パラホルムアルデヒドで2時間保存し、30％スクロースで一晩保存し、最適切断温度（OCT）化合物で-80°Cで凍結しました。 動物がイソフルランの過剰摂取によって安楽死させられた直後に、ＰＢＳ中の５０：５０ ＯＣＴの気管内注射によって急速冷凍された肺を処理した。 肺は、イソペンタン/液体窒素浴に埋め込まれたOCTでゆっくりと凍結されました。 サンプルは 50 μ m のスライスに分割されました。 免疫組織化学研究では、製造元の指示に従ってスライドを一次抗体で染色し、続いてRabbit-on-Rodent HRP-Polymerを受け取ったまま使用しました(Biocare Medical)。 免疫蛍光研究では、PBS 中の 50% ヤギ血清、6% BSA および 5% Triton X-2 で 0.1 時間ブロックした後、切片を PBS 中の 100% BSA 中の一次抗体で 1 °C で一晩染色しました。 Alexa Fluor 結合二次抗体を 1 μg ml でインキュベートしました^-1 室温で 1 分間 PBS で 30% BSA で。 スライドを ProLong Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific) で密封し、デジタル化して 3D Histech P250 大容量スライド スキャナー (PerkinElmer) を使用して分析しました。 組織学的毒性は、治療グループを知らされていない獣医病理学者によって評価されました。 使用される一次抗体と希釈液は、補足表に記載されています 5.

RNA 抽出とリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応

PC-3 および RWPE1 細胞を培養し、トリプシン処理後に回収しました。 マウスを安楽死させた後、剖検によって組織サンプルを収集し、すぐにRNAlater RNA Stabilization Reagent（Qiagen）に保管しました。 RNeasy Mini Kit（Qiagen）を使用して、細胞ペレットまたは凍結組織サンプルからRNAを抽出しました。 Bio-Rad iCycler で Bio-Rad iScript Reverse Transcription Supermix を使用して RNA を cDNA に逆転写しました。 ｃＤＮＡの定量的ポリメラーゼ連鎖反応増幅は、Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現プローブおよびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と製造業者の指示に従って混合した後に測定した。 定量的ポリメラーゼ連鎖反応は、Bio-Rad CFX96 Real Time System C1000 Thermal Cycler で実行されました。

組換えプロテアーゼ基質および組織ライセートのタンパク質分解切断アッセイ

蛍光 (FAM) および消光剤 (CPQ2) を含む蛍光プロテアーゼ基質は、CPC Scientific によって合成されました。 組換えプロテアーゼは、Enzo Life Sciences および R&D Systems から購入しました。 組織サンプルを PBS でホモジナイズし、4 °C、5 で 6,000 分間遠心分離しました。g. 上清をさらに 14,000 で遠心分離したg 25 ° C で 4 分間。 タンパク質濃度は、Thermo Fisher BCA Protein Assay Kitを使用して測定し、2 mg ml で調製しました^-1. アッセイは、ペプチド（384 µM）およびプロテアーゼ（組換えプロテアーゼアッセイでは1 nM）/細胞溶解物（40 mg ml^-1 組織ライセートアッセイ用) 30 °C で 37 µl。 蛍光は λ_ex = 485nm、 λ_em = Tecan Infinite 535pro マイクロプレート リーダーで 200 nm。 酵素とバッファー条件は補足表に記載されています 6.

PSA 酵素免疫測定法

約 200 μl の血液を実験動物の横伏在静脈から採取し、14,000 ℃ で遠心分離して血球を直ちにペレット化しました。g 25 ° C で 4 分間。 PSA定量化の前に、血漿を-80°Cで保存しました。 ＰＳＡレベルは、ＰＳＡ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットを製造元のプロトコル（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って使用して測定した。

統計分析と再現性

統計分析は、GraphPad Prism 9 で実施されました。データは、sem の平均値として表示されました。複数の仮説検定の調整が適切な場合、パラメトリックおよびノンパラメトリックのグループ比較を使用して、グループ間の差異を評価しました。 具体的には、データ グループの正規性について、Dallal-Wilkinson-Lillie 検定を使用した Kolmogorov-Smirnov 正規性検定によって最初に検定されました。 P 価値。 結果は、対になっていない両側検定によって統計的有意性についてテストされました。 tXNUMX 群比較の検定 (パラメトリック) と、複数群比較の分散分析。 ノンパラメトリック分析は、対応のない両側マン・ホイットニー検定によって実施されました。 サンプルサイズと統計検定は、図の凡例に指定されています。 すべての実験は、少なくとも XNUMX 回独立して繰り返され、同様の結果が得られました。 代表的な実験 (組織学的または蛍光顕微鏡写真など) の結果が示されている場合、実験は XNUMX 人の独立した研究者によって繰り返され、視覚化されていることに注意してください。

レポートの概要

研究デザインの詳細については、 ネイチャー ポートフォリオ レポートの概要 この記事にリンクされています。

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• 情報源： https://www.nature.com/articles/s41565-023-01372-9