ゼファーネットのロゴ

生成的データ インテリジェンス

幹細胞

ブタとヒトの胆管系における共肝幹/膵幹/前駆細胞の生後ネットワーク – npj 再生医療

プラトン再発行
プラトン再発行

日付：

閲覧数： 64

機器、試薬および/または消耗品を提供する会社: マサチューセッツ州ケンブリッジのアブカム。 ACD Labs、カリフォルニア州トロント。 Acris Antibodies, Inc)、カリフォルニア州サンディエゴ; Advanced Bioscience Resources, Inc (ABR)、メリーランド州ロックビル。 アジレント・テクノロジー、カリフォルニア州サンタクララ。 Alpco Diagnostics、ニューハンプシャー州セーラム、 Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ。 BD ファーミンゲン、カリフォルニア州サンノゼ。 ベクトン・ディキンソン、ニュージャージー州フランクリン・レイクス。 ベチル研究所、テキサス州モンゴメリー。 BioAssay Systems、カリフォルニア州ヘイワード。 ケンブリッジアイソトープ研究所、マサチューセッツ州テュークスベリー。 Biotime, Inc、カリフォルニア州アラメダ。 カールツァイス顕微鏡、ニューヨーク州ソーンウッド。 Carolina Liquid Chemistries, Corp.、ノースカロライナ州ウィンストンセーラム。 Charles River Laboratories International, Inc、マサチューセッツ州ウィルミントン。 Chenomx, Inc、アルバータ州、カナダ。 コール・パーマー、イリノイ州バーノンヒルズコート。 DiaPharma、オハイオ州ウェストチェスタータウンシップ、 Fisher Scientific、ペンシルベニア州ピッツバーグ。 Gatan, Inc、カリフォルニア州プレザントン。 イルミナ、サンディエゴ、カリフォルニア州。 インジェニュイティ、カリフォルニア州レッドウッドシティ。 Life Technologies Corp.、ニューヨーク州グランドアイランド。 ライカ、ワシントン DC。 LifeSpan Biosciences, Inc、シアトル、アメリカ; 分子装置、カリフォルニア州サニーベール。 オリンパス サイエンティフィック ソリューションズ アメリカズ コーポレーション、マサチューセッツ州ウォルサム、 PhoenixSongs Biologicals (PSB)、コネチカット州ブランフォード、 Polysciences, Inc、ペンシルベニア州ウォリントン。 キアゲン、メリーランド州ジャーマンタウン。 R&D システムズ、ミネソタ州ミネアポリス。 RayBiotech、ジョージア州ノークロス。 Roche Diagnostics、マンハイム、ドイツ;Santa Cruz Biotechnology, Inc)、テキサス州ダラス。 シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州。 マサチューセッツ州メドフォードのソフレゲン。 宝、大津市、日本。 Tousimis Research Corp.、メリーランド州ロックビル。 トライアングル リサーチ ラボ (TRL)、リサーチ トライアングル パーク、ノースカロライナ州; Umetrics、ウメオ、スウェーデン。 Varian Medical Systems, Inc)、カリフォルニア州パロアルト。 Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム。 VWR Scientific、ペンシルベニア州ラドナー。

倫理的声明は、動物がどのように維持されたかを要約しています。 すべての動物実験は、ローリーのノースカロライナ州立大学 (NCSU) およびチャペルヒルのノースカロライナ大学 (UNC) の承認された施設内動物管理使用委員会に厳密に従って実施され、宣言に概説された原則に従って行われました。ヘルシンキのあらゆる人間または動物の実験研究を担当します。 動物実験で使用されるすべての手順とヒト組織の使用に関わる手順は、UNC と NCSU の獣医学部の両方の施設の動物管理使用委員会 (IACUC) と治験審査委員会 (IRB) の委員会によって承認されました。 。 IACUC 承認番号は 16-316.0 および 17-225.0 です。 このプロジェクトにおけるヒト細胞の研究は治験審査委員会委員会によって評価され、治験審査委員会承認番号 97-1063 が付与されました。

ヒトサンプルには、各サンプルに関する情報に加えて、すべてのサンプルに共通し、以前の研究で詳細に提供された情報が含まれます。39,41,42

胎児肝臓組織は、認定機関 (Advanced Biological Resources、カリフォルニア州サンフランシスコ) によって、選択的妊娠中絶によって得られた在胎週数 18 ～ 22 週の胎児から提供されました。 研究計画書は、UNC の人間研究研究 IRB によって審査され、承認されました。 すべてのサンプルはさまざまな病原体についてスクリーニングされ、それらを含まないサンプルのみが研究研究に受け入れられました。

出生後の肝臓は、死体の新生児、小児、および成人のドナーから入手され、UNOS を介した臓器提供プログラムを通じて入手されました。 これらの研究に使用されたものは正常であると考えられ、その後の病原体のスクリーニングを含む疾患プロセスの証拠はありませんでした。 研究目的での肝臓の使用について近親者からインフォームドコンセントが得られ、プロトコルは治験審査委員会の承認を受け、処理は適正製造基準に準拠していました。

ブタのサンプルは、ノースカロライナ州立大学獣医学部 (NCSU、ノースカロライナ州ローリー) の施設で飼育されている動物から採取されました。 それらの一部は細胞の宿主またはドナーとして使用されました。 手術、剖検、およびすべての体液と組織の収集は、これらの施設で行われました。

移植に使用されたブタ宿主は、XNUMX つの異なる品種の混合物でした。ヨークシャー、ラージ ホワイト、ランドレース (雌豚から)、デュロック、スポット、およびピエトランス (イノシシから) からなる XNUMX 種交配です。 この高度に不均一な遺伝的背景は、ヒト集団の不均一な遺伝的構成と類似しているという点で望ましいものです。65。 宿主動物はすべて雌で、生後約 6 週間、体重約 15 kg でした。

緑色蛍光タンパク質 (GFP)+ H2B ヒストン-eGFP 導入遺伝子を保有するトランスジェニック ブタのドナーが樹立されました。 GFP+ ドナー動物は、標準的な人工授精によってトランスジェニック H2B-GFP 雄豚と野生型の雌ブタを交配することによって得られました。66。 このモデルは、CRISPR-Cas9 を介した IRES-pH2B-eGFP の内因性 β-アクチン (ACTB) 遺伝子座への相同性指向性修復 (HDR) によって開発されました。 トランスジェニック動物は、すべての組織で pH2B-eGFP の遍在的な発現を示します。 GFP を H2B に融合すると、GFP マーカーがヌクレオソームに局在化するため、核の明瞭な視覚化および染色体の動態の研究が可能になります。 創始者系統は広範かつ遍在的に分析されており、核局在的な発現が確認されています。 さらに、育種により H2B-GFP が次世代に伝達されることが実証されました。 すべての動物は健康であり、多胎妊娠が確立され、子孫は pH2B-eGFP の伝達について予想されるメンデル比を示しました。 雄の子孫は出生時に遺伝子型が特定され、導入遺伝子が陽性であったものは組織採取とドナー細胞の単離のために人道的に安楽死させられた。

ブタ動物の遺伝子型決定が行われました。 各ドナーおよびレシピエント動物について、ブタ白血球抗原クラス I (SLA-I) およびクラス II (SLA-II) 遺伝子座は、PCR に基づいてこれらの領域の既知の対立遺伝子を増幅するように設計されたプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 増幅されています。 -配列特異的プライマー戦略18。 このシステムは、SLA-47、SLA-1、および SLA-2 遺伝子座を増幅する 3 個の識別用 SLA-I プライマー セットと、DRB47、DQB1、および DQA 遺伝子座を増幅する 1 個の識別用 SLA-II プライマー セットで構成されます。67。 これらのプライマーセットは、類似の配列モチーフを共有するグループごとに対立遺伝子を区別するために開発されており、既知の SLA-I および SLA-II 対立遺伝子を簡単かつ明確に検出できることが示されています。 これらのプライマーセットを一緒に使用すると、試験対象の各動物のハプロタイプが効果的に得られるため、ドナー動物とレシピエント動物のハプロタイプの一致または不一致を簡単に確認するためのアッセイが提供されます。

ブタの手術は、ケタミン/キシラジン（各2～3 mg/kg体重）の組み合わせをIV注射するか、20 mg/kgのケタミンと2 g/kgのキシラジンをIMで投与することによって誘発された麻酔を使用して行われ、酸素中のイソフルランによって維持されました。閉回路ガス麻酔装置を介して投与されます。 肝臓への移植および一般的な外科的処置では、ブタを背臥位に置き、腹側腹部を剣状突起から恥骨まで切り取った。 皮膚は、ヨウ素化スクラブ溶液とアルコール溶液を交互に使用して無菌的に準備されました。 手術室に入った後、滅菌技術を使用して皮膚の準備を繰り返し、滅菌手術用ドレープを適用する前にその領域を局所ヨウ素溶液で覆った。 外科医は適切な無菌技術を使用しました。 腹部中央を切開し、皮膚、皮下組織、および リネアアルバ、剣状突起から始まり、尾方向に8〜12 cm伸びます。 左肝区画を露出させ、BTSCオルガノイドを埋め込んだ3Xヒアルロナンヒドロゲル（〜4.5Pa）を含む1×60cmのパッチグラフトを肝臓の腹側表面に適用し、10Xヒアルロナンヒドロゲル（〜760Pa）を含むバッキング上に配置しました。 4Pa); パッチは肝被膜の表面に直接接触して配置されました。 パッチグラフトは、6-4 ポリプロピレンの 0-2 本の単純断続縫合糸を使用して肝臓に縫合されました。 次に、移植片の露出表面を 2 ml の 200X ヒアルロナン ハイドロゲル (約 300 ～ XNUMX Pa) で処理しました。これは、移植片の外側に塗布またはコーティングできるほどの流動性のレベルの剛性でした。 さらに、隣接する組織からの癒着を最小限に抑えるのに役立ちました。 外科用グラフトの配置後、 リネアアルバ 0-PDS を使用した単純な連続縫合糸で閉じました。 の リネア ２ｍｇ／ｋｇの０．５％ブピバカイン、ＩＭでブロックした。 皮下組織と皮膚をそれぞれ 2-0.5 PDS および 2-0 モノクリル連続縫合糸で閉じました。 組織接着剤を皮膚表面に配置した。

膵臓の移植の場合、ブタの外科手術では、膵臓の寸法に適合する任意のサイズの移植片が使用されました。 膵臓を露出させるために、留置縫合糸を十二指腸下行に配置した。 移植片は、膵臓と直接接触するオルガノイドを含む柔らかいヒアルロン酸ヒドロゲル（〜60 Pa）と、シルク内のより硬いヒアルロン酸ヒドロゲル（〜760 Pa）を用いて、膵臓の頭部および十二指腸に隣接して配置されました。バッキング。 四隅に縫合糸を使用しました（4-0 Prolene）。 最初の 2 つの隅の縫合糸を十二指腸下行部に配置しました。 残りの2つは腸間膜に配置され、膵臓実質を避けました（膵臓による自己消化の傾向を最小限に抑えるため）。 次に、癒着を最小限に抑えるために、移植片の漿膜表面を 200X ヒアルロナン (約 300 ～ XNUMX Pa) ヒドロゲルで覆いました。 腹部を線状層、皮下層、および皮下層で連続吸収性（PDS）縫合糸で閉じた。 皮膚の縫合を避けるために、組織接着剤を皮膚に使用した。

トランスジェニックブタから野生型レシピエントへの移植は同種異系であったため、免疫抑制が必要であった。 使用された免疫抑制プロトコルは他者によって確立されたものでした68,69。 すべてのブタには、手術の0.5時間前から500日24回、免疫抑制薬であるタクロリムス(XNUMXmg/kg)およびミコフェノール酸(XNUMXmg)が経口投与された。 薬物は実験期間全体にわたって継続的に投与された。 動物の好物に混ぜて与えると簡単に与えることができます。

正常組織の分離は、生まれたばかりの子豚と、生後 12 週の年長の豚から行われました。 生まれたばかりの子豚の体重は約10ポンドでした。 生後12週目の年長の豚は約50～60ポンドでした。 ブタは、捕獲ボルトを貫通して安楽死させ、続いて頸静脈を放血することによって屠殺された。 この方法は、豚の安楽死に関する米国獣医師会の推奨ガイドラインを満たしています。65。 子豚または成豚の胆管組織に使用されるドナーのリストは、補足表に記載されています。 4.

すべての培地を滅菌濾過し (0.22 μm フィルター)、使用前に 4 °C の暗所に保管しました。 基本培地およびウシ胎児血清 (FBS) は GIBCO/Invitrogen から購入しました。 すべての成長因子は R&D Systems から購入しました。 記載されているものを除き、他のすべての試薬は Sigma から入手しました。

500 mlの基礎培地（例：RPMI 1640; Gibco # 11875-093）からなる細胞洗浄緩衝液に、0.5 gの血清アルブミン（Sigma、# A8896-5G、脂肪酸を含まない）を添加した。-9 M セレン、および 5 ml の抗生物質 (Gibco #35240-062、AAS)。 処理中に組織や細胞を洗浄するために使用されました。

コラゲナーゼ緩衝液は、最終濃度が胆管樹（管）組織の場合は100 U/ml（R5138 600 mg）、臓器の場合は1451 U/ml（25 mg）のコラゲナーゼ（Sigma # C300）を補充した細胞洗浄液12.5 mlで構成しました（例：肝臓）。

クボタ培地、もともと肝芽細胞用に設計された完全に定義された無血清培地70その後、胆道系幹細胞、肝幹細胞、膵臓幹細胞と前駆細胞の維持に成功したことが判明し（その後、評価されたすべての内胚葉幹/前駆細胞について全般的に成功したことが判明）、細胞懸濁液、オルガノイド、およびヒアルロン酸ハイドロゲル。 この培地は、銅を含まない、低カルシウム (1640 mM)、0.3 nM セレン、1% 血清アルブミン (精製、脂肪酸不含、画分 V)、0.1 mM ニコチンアミド、4.5% を含む基礎培地 (ここでは RPMI 0.1) で構成されます。 nM 硫酸亜鉛七水和物、5 μg/ml トランスフェリン/Fe、5 μg/ml インスリン、10 μg/ml 高密度リポタンパク質、および脂肪酸を含まない高度に精製されたアルブミンと複合体を形成した精製遊離脂肪酸の混合物。 遊離脂肪酸混合物は、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸から構成されていた。 クボタの培地は以下から市販されています。 フェニックスソングスバイオロジカルズ （コネチカット州ブランフォード）。

使用されたヒアルロン酸 (HA) には、可溶性長鎖型 HA (Sigma カタログ #52747) が含まれており、オルガノイド培養の安定化および細胞懸濁液の凍結保存に使用されました。71,72。 ハイドロゲルの製造に使用されたチオール修飾 HA は、以前は Lineage Cell Therapeutics (カリフォルニア州アラメダ) の子会社であった Glycosan Biosciences から入手したもので、現在は Advanced Biomatrix (カリフォルニア州カールズバッド) から非臨床グレードの形式で提供されています。 Sentrex Animal Care (ソルトレイクシティ、ユタ州) からの臨床グレードフォーム (G. Prestwich、私信)。 これらのチオール修飾 HA の成分は、独自の細菌発酵プロセスによって製造されました。 枯草菌 ISO 9001:2000 プロセスのホストとして (www.biopolymer.novozymes.com/）。 これらの成分は、HyaCare® という商品名で Novozymes によって製造されており、動物由来の材料や残留有機溶媒は 100% 含まれていません。 製造には動物由来の成分は使用されていません。 タンパク質レベルは非常に低く、エンドトキシンはありません。 製造はヨーロッパ薬局方によって設定された基準に従っています。 HA ハイドロゲルは、酸素の存在下でジスルフィド架橋の形成を誘発できるチオール修飾 HA である Glycosil (HyStem® HA、ESI BIO-CG313) を使用するか、ポリエチレングリコール ジアクリレート (PEGDA) を使用してチオエーテル結合を形成することによって調製されました。 ）。 Glycosil® は、脱気水を使用して、または我々の場合は無血清クボタ培地を使用して、1% リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中のチオール化 HA の 1% 溶液として再構成されます。 戻すと数時間は液体のままですが、酸素にさらされるとゲル化する可​​能性があります。 Glycosil を PEGDA などの架橋剤で処理すると、数分以内にゲル化が起こり、温度や pH を変化させることなく、より正確なゲル化が起こります。73,74,75,76.

架橋のレベルは、剛性 (粘弾性) または剛性のレベルに大きく寄与し、チオール修飾ヒアルロン酸と PEGDA の比率を調整することで制御できます。76。 以前の研究では、肝幹細胞集団がさまざまなレベルの剛性の HA ハイドロゲルでテストされ、抗原性と機能性の両方（たとえば、移動能力や幹細胞関連遺伝子の発現に関して）幹細胞として残ることが判明しました。多能性遺伝子やマトリックスメタロプロテイナーゼなど）、剛性レベルが約 100 Pa 未満の場合のみ76。 我々はこの発見を利用して、BTSCのオルガノイドを埋め込むための柔らかい層（〜100 Pa以下）と、他の方向への移動に対する障壁を形成するために裏打ちにヒアルロン酸ヒドロゲルのより硬い層（〜700 Pa）を備えたグラフトを設計しました。標的組織よりも硬く、癒着を最小限に抑えるために中間レベルの剛性 (約 200 ～ 300 Pa) の組織よりも優れています。

ヒアルロナンヒドロゲルのマクロスケールレオロジー特性は、応力制御されたコーンアンドプレートレオメーター（TA Instruments、AR-G2、コーン直径40 mm、角度1°）を使用して測定されました。 ゲルは、架橋反応が十分に完了したかどうかを調べるために弾性率を継続的に監視しながら、周波数１ｒａｄ／ｓおよび応力振幅０．６Ｐａで振動させながら、レオメーター上で活発に重合した。 平衡化したら、ヒドロゲルを振動周波数掃引(応力振幅: 1 Pa、周波数範囲: 0.6 ～ 0.6 Hz)に供しました。

細胞の調製は、ブタ（またはヒト組織）から得た肝外胆管樹組織（胆嚢、総管、肝管）から行った。 正常細胞のオルガノイドを生成するために使用される組織については、肝内胆管と肝外胆管の結合を注意深く維持しながら、組織を滅菌したステンレス鋼の木槌で叩いて実質細胞を除去しました。 次に、胆管系を、抗生物質、0.1% 血清アルブミン、および 1 nM セレンを添加した無菌の無血清基礎培地で構成される「細胞洗浄」バッファーで洗浄しました。-9 マ）。 次に、交差メスで機械的に解離させ、1640% ウシ血清アルブミン (BSA) [またはヒト組織の場合はヒト血清アルブミン、HAS]、0.1 nM セレン、1 を添加した RPMI-300 中の細胞懸濁液に凝集体を酵素的に分散させました。 U/ml IV 型コラゲナーゼ、0.3 mg/ml デオキシリボヌクレアーゼ (DNAse)、および抗生物質。 消化は 32 °C で 30 ～ 60 分間頻繁に撹拌しながら行われました。 ほとんどの組織では、1100 ラウンドの消化と、その後 4 °C で 30 rpm での遠心分離が必要でした。 細胞ペレットを合わせ、細胞洗浄液に再懸濁しました。 細胞懸濁液を XNUMX 倍で遠心分離しました。g 5℃で4分間赤血球を除去します。 細胞ペレットを再度細胞洗浄液に再懸濁し、新しい細胞洗浄液を使用して 40 μm ナイロンセルストレーナー (Becton Dickenson Falcon #352340) で濾過しました。 細胞数を測定し、トリパンブルーを使用して生存率を評価しました。 90 ～ 95% を超える細胞生存率が日常的に観察されました。

オルガノイドの形成は、無血清クボタ培地中のマルチウェル平底細胞培養プレート (Corning #353043) に加えられた細胞懸濁液から行われ、成熟間葉系細胞 (成熟間質など) の付着を促進するために 37 °C で約 15 時間インキュベートされました。 、成熟星細胞）。 培地が無血清であっても、成熟間葉細胞は約 2 分以内にディッシュに付着しました。 懸濁液中に残った未成熟細胞を別の皿に移し、再度最大10時間インキュベートした。 これを数回繰り返して、成熟間葉細胞のかなりの部分を確実に枯渇させた。 成熟間葉細胞を枯渇させた後、残りの浮遊細胞を約XNUMX×XNUMX 個播種しました。5 コーニングの超低接着ディッシュ (Corning #3471) の無血清クボタ培地でウェルあたり 37 個の細胞を培養し、COXNUMX 雰囲気下 XNUMX °C で一晩インキュベートしました。2 インキュベータ。 胆管樹幹細胞 (BTSC) と初期系統段階の間葉細胞 (ELMSC) が結合して一晩で形成されたオルガノイド。 ELMSC は、特定の表面抗原の発現により血管芽細胞 (CD117) であることが判明しました。+、CD31 - 、VEGFr+) および内皮の前駆体 (CD31)+、VEGFr+）および星状細胞（ICAM-1）+、CD146+）。 これらのELSMCのより広範な特性評価が行われ、その結果は以前に発表されました。77,78。 オルガノイド培養物は、特に培地に可溶性形態のヒアルロナン(Sigma)が補充された(0.1%)場合、クボタ培地中で数週間生存した。

以下に説明するように、細胞を凍結保存することもできます。 ブタ胆管系組織 1.5 グラムあたり、約 10 × XNUMX7 細胞。 約 3 ～ 6 × 10 を使用しました5 6ウェルの超低付着プレートのウェルあたり細胞を培養し、無血清クボタ培地中でインキュベートしました。 細胞は、平均して 6000 ～ 20,000 個の小さなオルガノイド (約 50 ～ 100 細胞/オルガノイド/ウェル) を生成しました。 移植片には、少なくとも 100,000 個のオルガノイド (>10 個) を使用しました。7 細胞）。 裏打ちのサイズに応じて、移植片内のオルガノイドの数を最大 10 個以上まで増やすことができました。8 オルガノイド (つまり、~109 細胞総数）以上が、1 cm × 3 cm の裏打ち上の約 4.5 ml の柔らかいヒアルロン酸ヒドロゲルに埋め込まれています。

幹細胞/前駆細胞の凍結保存は、成熟間葉系細胞の数を最小限に抑えるためにパニング手順を行った単離細胞または小さな細胞凝集体の凍結保存によって最も成功しました。 幹細胞/前駆細胞と系統初期の間葉細胞の混合物は、不凍因子、デキストラン、DMSO を含む等張凍結保存緩衝液である Cryostor10 (Bioliife、ワシントン州シアトル) で凍結保存できます。 細胞の生存率は、0.1% HA (Sigma #52747) を補給するとさらに改善されました。71,72。 オルガノイドの生存率が最も高かったのは、解凍したばかりの凍結保存した細胞懸濁液から調製した場合でした。 凍結保存された完全に形成されたオルガノイドでは生存率が低いことが観察されました。 凍結保存は CryoMed™ Controlled-Rate Freezer を使用して行われました。 細胞懸濁液として凍結保存され、解凍後にオルガノイドの形成に使用されたものの解凍時の生存率は 90% 以上でした。71,72.

パッチグラフトは、多数（例：10 人以上）を移植するために迅速に確立された新しい方法です。8th) オルガノイドを固形臓器に変換し、オルガノイドを XNUMX 週間以内に臓器内に完全に統合させ、さらに XNUMX 週​​間以内に成体細胞に成熟させる。 オルガノイドを固形臓器にパッチ移植するためのロジック、戦略、および方法の詳細については、当社の以前の出版物に記載されています。54,55。 移植片は、裏打ちである Contour Seri-silk (Sofregen、メドフォード、マサチューセッツ州) を使用して形成され、その上に軟ヒアルロン酸ハイドロゲル (約 50 ～ 100 Pa) に埋め込まれた幹/前駆細胞オルガノイドが配置されました。 これらは事前に容易に準備され、インキュベーター内の培養皿内で一晩維持されました。 ソフトハイドロゲル内にオルガノイドを凍結保存する試みが成功しなかったことは、グラフトを取り付ける手術の直前にオルガノイドをソフトハイドロゲルに埋め込む必要があることを意味しました。

アップデイト: Contour Seri-silk がメーカーから販売終了となったことが分かりました。 Vivex Biologics (フロリダ州マイアミ) などの羊膜ベースのマトリックス材料は、適切な代替品となるはずであり、臨床または非臨床目的で FDA に承認されたインプラント材料です。 これらは移植片に適切な機械的支持を提供するはずであり、ドナーオルガノイドに対する影響は合理的に中立であると仮説が立てられています。 これは、オルガノイドが幹細胞の形質を確実に保持し、生着と遊走に必要なマトリックスメタロプロテイナーゼ (MMP) を発現できるようにするために重要です。54。 このような羊膜由来マトリックスの臨床使用は、最近の総説で他の人によって議論されています。79。 障壁として機能するはずの羊膜内の複雑なマトリックス化学を考慮すると、より硬いヒアルロン酸ヒドロゲル (約 700 Pa) は必要ないと考えられます。 しかし、標的部位に繋ぎ止めた後も、羊膜マトリックスバリアの両面をヒアルロン酸でコーティングする必要があり、また、無血清クボタ培地で調製した中間レベルの剛性（約 200 ～ 300 Pa）のヒアルロン酸でコーティングする必要があるのではないかと仮説が立てられています。 ）。 手術時の漿膜側のコーティングは、隣接する組織との癒着を最小限に抑える必要があります。

剖検手順では、ケタミン/キシラジンによる鎮静およびイソフルラン麻酔、その後の致死量のペントバルビタールナトリウムの静脈内注射により、すべての動物を指定の時点で人道的に安楽死させた。 死亡が確認されたら、死骸を注意深く解剖し、目的の臓器を取り出し、研究室への輸送のために冷却したクボタ培地に入れました。 肝臓に加えて、肺、心臓、腎臓、脾臓を採取し、10％中性ホルマリンで固定した。

組織学は、ブタから新たに解剖した組織の一部で実施するか、肝臓または膵臓の移植片を 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で固定してからパラフィン包埋しました。 ルーチンの組織学的分析のために、XNUMX ミクロンの切片を切断し、ヘマトキシリン エオシンで染色しました。 新生ブタから得られた組織は、胆道系および膵管系全体の接続の分析を容易にするために、大きなパラフィンブロック内のサンプル（肝臓、膵臓、胆道系および十二指腸）としても調製されました。

免疫組織化学 (IHC) は、さまざまなマーカーと形質の分析に使用されました。 免疫蛍光染色では、5 μm の凍結切片または培養細胞を 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で室温で 20 分間固定し、PBS でリンスし、PBS 中の 10% ヤギ血清で 2 時間ブロッキングし、リンスしました。 固定細胞を一次抗体とともに 4 °C で 14 時間インキュベートし、洗浄し、標識されたアイソタイプ特異的二次抗体とともに 1 時間インキュベートし、洗浄し、視覚化するために 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) で対比染色しました。 Leica DMIRB 倒立顕微鏡 (Leica、テキサス州ヒューストン) または Zeiss ApoTome Axiovert 200 M (Carl Zeiss Inc、ニューヨーク州ソーンウッド) を使用して観察しました。

IHC では、組織を 4% PFA で一晩固定し、70% エタノールで保存しました。 それらをパラフィンに包埋し、5μmの切片に切断した。 脱パラフィン後、抗原賦活化をクエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）緩衝液（pH 8.0）を用いて蒸し器中で20分間実施した。 内因性ペルオキシダーゼは、15% H 中で 3 分間インキュベートすることでブロックされました。2O2。 切片を、ImmPRESSペルオキシダーゼ染色キットおよび30'-ジアミノベンジジン基質(Vector Laboratories)とともに室温で3,3分間インキュベートした。 切片をヘマトキシリンで対比染色した。 使用した抗体は補足表に記載されています。 1.

遺伝子研究のための細胞集団の精製は、さまざまな分析にとって重要でした。 単離される部分集団の純度は、細胞を単離するための戦略の組み合わせによって決まります。 成人肝細胞は、標準的なコラゲナーゼ消化およびパーコール分画によって、新生児、小児、および成人のヒトの肝臓ではなく、新生児のブタの肝臓から新たに単離されました。80。 単離された成人肝細胞画分（平均直径が 17 μm を超えるもの）を、1640% 血清を添加した RPMI2 でリンスし、細胞の単離に使用した酵素を不活化しました。 その後、無血清RPMI 1640培地で複数回洗浄して処理します。 最後に液体窒素を使って急速冷凍します。 細胞は培養されなかった。

ヒトとブタの両方の幹細胞/前駆細胞の部分集団は、胎児または新生児の胆管樹 (胆管樹幹細胞)、胎児または新生児の肝臓 (肝幹細胞および肝芽細胞)、または胎児または新生児の胆管樹から新たに単離された細胞から調製されました。膵臓（膵臓幹細胞および膵管前駆細胞）; 表面抗原に対する免疫選択の組み合わせによって精製され、個別の細胞亜集団の単離が可能になります。39,41,50,54。 補足表 5 特に過去の研究で広範囲に特徴付けられた部分集団のマーカーを要約します。31,32,33,38,39,40,41,42,43,49,50.

免疫選択された細胞を無血清クボタ培地に懸濁しました。81内胚葉幹細胞用に設計され、低接着培養皿に6〜12時間播種してオルガノイドの形成を可能にします。 その6〜12時間で形成されたオルガノイドは、初期系統段階の間葉細胞、つまり血管芽細胞および内皮細胞および星状細胞の前駆体と提携した内胚葉幹細胞で構成されていました（注：成熟間葉細胞は、細胞の枯渇によって示されるように、免疫選択プロセスによって最小化されました）成熟造血細胞および間葉細胞の表面抗原の細胞）。

RNA シーケンスおよび遺伝子発現解析には、Qiagen RNeasy Kit を使用して、ブタ (またはヒト) 成体肝臓、膵臓、胆嚢、および胆管樹組織、および肝細胞 (AHeps)、肝幹細胞 (HpSC) の単離細胞懸濁液から精製された RNA が含まれていました。胆管樹幹細胞（BTSC）、それぞれヒト細胞の場合はXNUMX人の異なるドナー、ブタ細胞の場合はXNUMX人の異なるドナーからのもの（補足表） 6 & 7）。 RNA-seq データ収集と品質管理分析は、以前の研究で具体的に説明されました。52。 LIMMA (バージョン 3.50.1) パイプラインを使用して、差次的に発現された遺伝子 (DEG) を特定しました。 遺伝子発現プロファイルは、ピアソンおよびスピアマンの相関分析を使用して比較されました。 主成分分析 (PCA) と階層的クラスタリングは R (R バージョン 4.1.0) で実行されました。

定量的逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応は、細胞からの全RNAを使用して行われました。 全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して細胞から抽出した。 Ｐｒｉｍｅ ｓｃｒｉｐｔ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（宝、大津、日本）を使用して合成された１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを、ＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。 mRNAレベルの定量分析は、ABI PRISM 1HT配列検出システム（Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ）を備えたFaststart Universal Probe Master（R oche Diagnostics、マンハイム、ドイツ）を使用して実行されました。 プライマーは、Universal Probe Library Assay Design Center (Roche Applied Science) で設計されました。 プライマー配列は補足表に記載されています。 4a。 プライマーを50℃で2分間、95℃で10分間アニーリングし、続いて40℃（95秒）と15℃（60分間）を1サイクル行った。 グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) の発現を一般に標準として使用しました。

統計分析

サンプル間の統計的に有意な差は、スチューデントの両側検定を使用して計算されます。 t- テストと結果は平均値 ± SD として表示されます。 P <0.05 の値は統計的に有意であるとみなされました。

レポートの概要

研究デザインの詳細については、 ネイチャー ポートフォリオ レポートの概要 この記事にリンクされています。

スポット画像

最新のインテリジェンス

スポット画像

著作権 @ 2024 Plato Technologies Inc.