材料

TLR7/8 アゴニスト 1 二塩酸塩は Cayman Chemical から購入しました。 1,2-エポキシドデカン (C12) は Sigma-Aldrich から入手しました。 Core 200 は Enamine からカスタマイズされ、他のポリアミン コアは Sigma-Aldrich および TCI から購入されました。 抗マウスCD16/32抗体、APC抗マウスCD11c抗体、FITC抗マウスCD80抗体、PE抗マウスCD86抗体、APC抗ヒトCD11c抗体、FITC抗ヒトCD80抗体およびPE抗ヒトCD86抗体をバイオレジェンドから購入しました。 マウス IL-1β 非コーティング ELISA、マウス IL-12p70 非コーティング ELISA、マウス TNF-α 非コーティング ELISA、マウス MCP-1 非コーティング ELISA、ヒト IL-1β 非コーティング ELISA、ヒト IL-12p70 非コーティング ELISA、ヒト TNF-α 非コーティング ELISA、LysoTracker Deep Red、LysoTracker Green、DiO、および DiR は Invitrogen から購入しました。 マウス ハプトグロビン ELISA およびマウス IP-10 ELISA は Abcam から入手しました。 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、DMG-PEG、およびコレステロールは、Avanti Polar Lipids から入手しました。 DLin-MC3-DMA および SM-102 は MedChem Express から購入しました。 コドン最適化された m1ψ 修飾ルシフェラーゼ mRNA および SARS-CoV-2 ジプロリン修飾スパイク (S2P) mRNA が in vitro 転写によって生成されました¹⁴。 Cy5 タグ付きルシフェラーゼ mRNA は、Cy5-UTP (TriLink) を in vitro 転写反応に組み込むことにより社内で生成されました。

アジュバントリピドイドの合成

アジュバントリピドイド C12-TLRa は、開環反応を利用してエポキシドデカン (C12) と TLR7/8 アゴニスト 1 二塩酸塩を反応させることによって合成されました。²⁵。 簡単に説明すると、10 mgのTLR7/8アゴニスト1二塩酸塩を、磁気撹拌子を備えたガラスバイアル中で0.8 mlのエタノールに溶解した。 次に、8μlのトリエチルアミンを加えて塩酸塩を中和し、その後20mgのC12を加えた。 バイアルを密閉し、混合物を48℃で80時間撹拌した。 粗生成物を、ＣＨ ３ からの勾配溶出を用いるＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ ＮｅｘｔＧｅｎ ３００＋クロマトグラフィーシステム（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯ）によって精製した。₂Cl₂ 75:22:3CHまで₂Cl₂/MeOH/NH₄ああ（水性）。 所望の画分を収集した(収率、44%)。 C12-TLRa は質量分析法によって特性評価されました (MS 計算値、728.12; 実測値 [M + 2H])²⁺、365.25）およびNMR分光法。 ¹H NMR (400 MHz、DMSO-d)₆) δ (ppm): 7.78 (d、 J = 8.3 Hz、1H)、7.57 (ダブレットのダブレット、 J = 8.4、1.3 Hz、1H)、7.35 ～ 7.29 (m、1H)、7.27 (d、 J = 7.9 Hz、2H)、7.05 ～ 7.00 (m、1H)、6.98 (d、 J = 8.0 Hz、2H)、5.84 (s、2H)、3.61 ～ 3.47 (m、2H)、3.44 (s、2H)、2.90 (t、 J = 7.7 Hz、2H)、2.68 (q、 J = 1.9 Hz、2H)、2.34 (t、 J = 2.8 Hz、2H)、1.69 (クインテット、 J = 7.6 Hz、2H)、1.37 (XNUMX 連符の XNUMX 連符、 J = 14.9、7.5 Hz、2H)、1.22 (s、36H)、0.90 ～ 0.81 (m、9H)。

ポリアミン由来リピドイドの一般的な合成方法

アミンを飽和させるために必要に応じて、ポリアミンコアを過剰モルの C12 と反応させました。^25,33。 C12-113を例に挙げると、113コア（1当量）をC12（4.8当量）と48℃で80時間、そのままの状態で混合しました。 粗生成物を最初のライブラリースクリーニングに使用した。 最高のパフォーマンスを誇る C12-113 リピドイドを精製するために、粗生成物を上記のように分離し、完全に飽和した生成物を収集し、質量分析法によって同定しました (計算値 MS、854.49; 実測値 [M + 2H])²⁺、429.13)、その後の実験に使用されます。

アゴニストとTLR7の相互作用の構造シミュレーション

TLR7/8 アゴニスト 1 と C12-TLRa の構造は、CHARMm 力場を使用した分子動力学シミュレーションによって最初に最適化されました。⁴⁵。 TLR7 タンパク質の正確な結晶構造は、TLR7/R848 複合体の構造に由来しています (PDB ID、 5GMH)、リガンドまたは溶媒分子を除去します。²⁶。 CDockerドッキングシミュレーションによりTLR7ダイマーとアゴニスト間の構造シミュレーションを実施⁴⁶ そしてその場での構造の重ね合わせ。 BIOVIA Discovery Studio 7 を使用して、TLR2018 二量体と対応するアゴニストの間の潜在的な非共有結合相互作用、結合ポケット、および結合部位の概要を生成しました。

LNP製剤

LNPはマイクロ流体混合によって配合されました³⁰。 簡単に説明すると、指定されたモル比でリピドイド（C12-TLRa置換の有無にかかわらず）、リン脂質、コレステロールおよびDMG-PEGを含むエタノール相（補足表） 1）を、マイクロ流体チップ装置内で、流量比１：３およびリピドイド／ＲＮＡ重量比１０：１で、ｍＲＮＡを含む水相（１０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ３）と混合した。 LNPを10 kDa分子量カットオフカセット中で3×PBSに対して1時間透析し、3μmフィルターを通して滅菌し、10℃で保存した。 DiO または DIR 標識 LNP は、透析前に DiO または DiR (総脂質の 1 mol%) を LNP と混合することによって得られました。

LNPの特性評価

LNP の流体力学的サイズ、PDI、およびゼータ電位は、Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments) を使用して測定されました。 LNP の形態は、K1010 Bioquantum (Gatan) を備えた TEM (JEOL 3) およびクライオ EM (Titan Krios、Thermo Fisher) によって特徴付けられました。 mRNA のカプセル化効率と pK_a LNP の割合は、改良型 Quant-iT RiboGreen RNA アッセイ (Invitrogen) および 6-(p-トルイジニル)ナフタレン-2-スルホン酸アッセイ、それぞれ^30,33。 LNP 製剤はリムルス変形細胞溶解物 (LAL) テストによって定期的に検査され、エンドトキシン レベルは 1 ml あたり XNUMX エンドトキシン単位未満であることが一貫して判明しました。

細胞培養と動物実験

HEK-Blue mTLR7 細胞株は、ハーバード大学医学部の J. Shi 氏のご厚意により提供され、InvivoGen から入手しました (#hkb-mtlr7)。 これらのセルはベンダーの指示に従って保守されました。 マウスマクロファージ DC2.4 細胞株は American Type Culture Collection から入手し、10% ウシ胎児血清、100 U ml を補充したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) で維持しました。^-1 ペニシリンと100μg/ml^-1 ストレプトマイシン。 すべての細胞は、37% CO の加湿インキュベーター内で 5 °C で培養されました。₂、マイコプラズマ汚染について定期的に検査されています。

BMDC は C57BL/6 マウスから生成されました。 簡単に説明すると、マウスの大腿骨と脛骨から骨髄細胞を洗い流し、塩化アンモニウム-塩化カリウム（ACK）緩衝液で溶解して赤血球を除去し、1640％ウシ胎児血清を添加したRPMI 10培地（100 U ml）で培養しました。^-1 ペニシリンと100μg/ml^-1 ストレプトマイシン、1% HEPES、0.1 mM β-メルカプトエタノール、20 ng ml^-1 マウス IL-4 (#214-14、PeproTech) および 20 ng ml^-1 マウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (#315-03、PeproTech)。 6日目に、非接着細胞および緩く接着した細胞を研究のために収集しました。

MoDC は、38 歳の健康な男性ボランティアのドナーから生成されました。 単球は、ペンシルベニア大学の Human Immunology Core から提供された RosetteSep ヒト単球濃縮カクテル (#15068、Stemcell Technologies) を使用して、提供されたアフェレーシス血液から単離されました。 これらの細胞は、20 ng ml を補充した完全 RPMI 培地で培養することによって MoDC に誘導されました。^-1 ヒト IL-4 (#574002、Biolegend) および 20 ng ml^-1 ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (#572902、Biolegend) を 6 日間投与。 この研究は、ペンシルベニア大学の治験審査委員会によって承認されました (#705906)。 提供者からはインフォームドコンセントが得られ、提供者はこの献血に対して補償を受けました。

すべての動物プロトコルはペンシルベニア大学の施設内動物管理使用委員会 (#806540​​) によって承認され、動物手順はペンシルバニア大学の実験動物の管理と使用のガイドラインに従って実行されました。 C57BL/6 雌マウス (6 ～ 8 週齢、体重 18 ～ 20 g) を Jackson Laboratory から購入しました。

インビトロ mLuc 送達

DC細胞、BMDC、またはMoDCを96ウェルプレートにウェルあたり10,000個の密度で一晩播種し、その後、mLucをロードしたLNPを使用して、示された用量で24時間細胞を処理しました。 ルシフェラーゼ発現は、Luciferase Reporter 1000 Assay System (E4550、Promega) によって評価し、細胞生存率は、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (G7572、Promega) を製造業者のプロトコールに従って使用して測定しました。 相対ルシフェラーゼ発現は、細胞生存率に対して正規化された相対光単位として報告されました。 遊離mRNAを対照として使用した。

TLR7 レポーターアッセイ

C7-TLRaのTLR12アゴニスト活性を、HEK-Blue検出キット(#hb-det7、InvivoGen)を製造業者の指示に従って使用して、HEK-Blue mTLR2レポーター細胞上で試験した。 簡単に説明すると、HEK-Blue mTLR7 レポーター細胞を、さまざまな濃度の C96-TLRa を含む HEK-Blue Detection 培地中で 40,000 ウェルあたり 12 細胞の密度で 24 ウェル プレートに播種しました。 650 時間インキュベートした後、プレートリーダー (Infinite M200、Tecan) を使用して 7 nm での吸光度を測定し、データを未処理の細胞に対して正規化しました。 TLR8/1 アゴニスト 7 をポジティブコントロールとして使用しました。 同様に、LNP の TLRXNUMX アゴニスト活性を測定しました。

細胞への取り込み

DC2.4 細胞を 35 mm ガラス底ディッシュに 24 時間播種し、mRNA 濃度 12 ng/ml の DiO 標識 C113-12 LNP または DiO 標識 C113-500/TLRa LNP で処理しました。^-1 2時間。 細胞を、LysoTracker Deep Red (100 nM) で 30 分間、および Hoechst 33342 (10 μg/ml) で連続的に染色しました。^-1）5分間。 共焦点レーザー走査型顕微鏡（LSM 710、Zeiss）を使用して画像を直ちに撮影した。

インビトロでの DC 成熟とサイトカイン産生の分析

DC2.4細胞またはBMDCを12ウェルプレートに1×10 の密度で播種しました。⁶ ウェル当たり細胞を一晩放置し、その後 SARS-CoV-2 mRNA をロードした LNP (500 ng/ml) で処理しました。^-1）24時間。 TNF-α、IL-12p70、およびIL-1βのELISA用に細胞培養物を収集しました。 細胞を収集し、抗マウス CD16/32 抗体でブロックし、APC 抗マウス CD11c 抗体、FITC 抗マウス CD80 抗体、および PE 抗マウス CD86 抗体で 30 °C で 4 分間染色した後、フローサイトメトリーで分析しました。 (BD、LSR II)。 同様に、MoDC も処理されました。 ヒト TNF-α、IL-12p70、および IL-1βの ELISA 用に細胞培養物を収集しました。 MoDCを収集し、分析前にAPC抗ヒトCD11c抗体、FITC抗ヒトCD80抗体、およびPE抗ヒトCD86抗体で染色した。 抗体は製造業者の指示に従い、典型的な希釈率 1:100 で使用しました。

in vivoでのDC成熟とサイトカイン産生の解析

各マウスから 24 つの iLN を、SARS-CoV-2 mRNA を負荷した LNP (マウスあたり 5 μg mRNA) の注射後 0.1 時間で尾の付け根に採取し、1.5 ml の RPMI 完全培地中で滅菌乳棒を使用して穏やかに機械的に破壊しました。 16mlチューブ。 得られた細胞懸濁液を収集し、抗マウス CD32/11 抗体でブロックし、APC 抗マウス CD80c 抗体、FITC 抗マウス CD86 抗体および PE 抗マウス CDXNUMX 抗体で染色してから、フローサイトメトリーで分析しました。

免疫化の365967時間後および6時間後に、眼窩後経路を通じて血液を血清分離管(BD #24)に収集した。 室温 (rt) で 30 分間のインキュベーション期間の後、血清を血液から分離し、サンプルを 10,000 で遠心分離しました。g 5分間血清は使用するまで -20 °C で保存しました。 リンパ内サイトカイン産生を分析するために、iLN から得られた細胞懸濁液を、ウェルあたり 96 μl あたり 10,000 細胞の密度で 100 ウェル プレートに置き、8 時間培養しました。 TNF-α、IL-12p70、およびIL-1βのELISAのために、血清サンプルとともに上清を収集しました。 さらに、ハプトグロビン、IP-6、および MCP-24 の ELISA のために、免疫化後 48、10、および 1 時間の血清を収集しました。

in vivoでのLNPの分布とトランスフェクション

マウスの尾の付け根に、マウスあたり５μｇのｍＲＮＡの用量でｍＬｕｃを負荷したＬＮＰを皮下注射した。 注射後 5 時間または 6 時間で、マウスに以下を腹腔内 (ip) 注射しました。 d－ルシフェリンカリウム塩（体重１ｋｇ当たり１５０ｍｇ）、生物発光イメージングをＩＶＩＳイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で行った。 生物発光と蛍光イメージングの同時実行を可能にするために、DiR 標識され mLuc を負荷された LNP をマウスに皮下注射しました。 注射の 150 時間後、マウスに以下を腹腔内注射しました。 d-ルシフェリンカリウム塩、主要臓器およびiLNが生物発光および蛍光イメージングのために収集されました。

インビボ免疫

プライムブースト戦略を使用して、2週間間隔で1回、マウスあたり5または3μgのmRNAの用量でSARS-CoV-20 mRNAを負荷したLNPでマウスを皮下免疫した。 実験中、体重を週に２回記録した。 上記のように血清分離管を使用して血清を収集し、-XNUMX °C で保存し、ELISA およびウイルス中和アッセイに使用しました。 追加免疫ワクチン接種の XNUMX 週間後、マウスを麻酔し、フローサイトメトリー分析のために脾臓を採取しました。

ELISA を使用した抗 RBD 抗体力価の測定

精製 SARS-CoV-2 His タグ RBD (1 μg ml^-1) (Sino Biological、#40592-V08H) を使用して、High Bind Stripwell Corning 96 ウェル透明ポリスチレン マイクロプレートを一晩コーティングしました。 プレートを洗浄緩衝液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ）で１回洗浄し、熱不活化、ＩｇＧ除去、プロテアーゼフリーのウシ血清アルブミン（２％ ｗ／ｖ ＢＳＡ／ＰＢＳ）の溶液を使用して室温で２時間ブロックした。 ）。 その後、プレートを0.05回洗浄し、マウス血清をブロッキング溶液で連続希釈し、室温で20時間インキュベートした。プレートを2回洗浄した後、総IgGに特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウス二次抗体(2:2)を添加した。 、Abcam #ab1）またはサブクラス（IgG10,000、97040:1、Abcam、#ab1; IgG10,000c、98693、Abcam、#ab2）をブロッキングバッファーに添加します。 プレートを10,000時間インキュベートし、98722回洗浄した後、ウェル当たり1.5μlのKPL 100',3,3'-テトラメチルベンジジン基質を5,5分間添加した。 ５０μｌの２Ｎ硫酸を添加することによって反応を停止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定した。 RBD 特異的 IgG エンドポイント希釈力価は、Frey 法を使用して決定されたカットオフ光学密度値よりも高い光学密度を与える血清の最高希釈として定義されました。⁴⁷.

シュードウイルス中和アッセイ

SARS-CoV-2 S を含む VSV 偽型が最初に生成された³⁶。 VSVΔG-RFP SARS-CoV-2 を使用して抗体中和アッセイを実行しました。 TMPRSS6を安定発現するVero E2細胞を100×2.5 の割合で10μlのDMEMに播種しました。⁴ 96 ウェル コラーゲン コーティング プレート内のウェルあたりの細胞数。 12 時間後、2 倍段階希釈した血清サンプルを、D50G、ベータまたはデルタ変異体のスパイクをコードする VSVΔG-RFP SARS-CoV-200 偽型ウイルス (ウェルあたり 614 ～ 1 病巣形成単位) と混合し、37 ℃で 8 時間インキュベートしました。 ℃。 潜在的な VSV-G キャリーオーバー ウイルスを中和するために、マウス抗 VSV インディアナ G、5G11F01401 (#Ab2.0-100、絶対抗体) もこの混合物に含まれ、XNUMX ng/ml の濃度で含まれました。^-1。 次に、抗体とウイルスの混合物を使用して、Vero E6 TMPRSS2 細胞の培地を置き換えました。 感染の 20 時間後、細胞を洗浄し、4% PFA で固定した後、S6 FluoroSpot Analyzer (CTL) で視覚化しました。 個々の感染巣を数え上げ、その値を抗体を含まない対照ウェルと比較しました。 焦点低減中和力 50% (FRNT)₅₀）は、マウス血清の非存在下でシュードタイプウイルスに感染した対照細胞と比較して、フォーカスカウントが少なくとも50％減少する最大の血清希釈として測定した。 フロント₅₀ 各サンプルの力価は、別々の日に実行された XNUMX 回の技術的反復で測定されました。

T 細胞と B 細胞のフローサイトメトリー分析

T細胞

脾臓を収集し、単一細胞として処理し、完全 RPMI 70 で 1640 µm セル ストレーナーを使用して濾過し、遠心分離し、赤血球を ACK 溶解バッファーで溶解して、透明な単一細胞懸濁液を得ました。 抗原特異的 T 細胞を測定するために、2.5 万個の脾細胞を XNUMX μg ml で刺激しました。^-1 FACS チューブ内の SARS-CoV-2 RBD ペプチド プール (#PM-WCPV-S-RBD-1、JPT) を 6 °C、37% CO で 5 時間培養₂ 2mg mlで^-1 抗 CD28 (Tonbo #40-0281-M001) は共刺激を提供します。 刺激を 1 時間続けた後、5 mg ml を添加しました。^-1 ブレフェルディン A (Biolegend #420601)、2 mM モネンシン (Biolegend #420701) および 5 mg ml^-1 抗CD107a Alexa Fluor 647 (Biolegend #121610) を5時間。 DMSOは陰性対照として機能し、50 mg ml の組み合わせ^-1 ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテートおよび 1 mg ml^-1 イオノマイシンはポジティブコントロールとして機能しました。 合計6時間後、サンプルをPBSで洗浄し、Live/Dead Aquaで5分間染色し、抗マウスCD16/32抗体を使用して20分間ブロックし、抗体を使用して細胞外で30分間染色しました（補足図）。 21d & 27d）。 細胞をFACS緩衝液で洗浄し、Cytofix/Cytopermキット(BD Biosciences #554714)を使用して固定および透過処理し、抗体を使用して30分間細胞内を染色した(補足図)。 21d & 27d）。 細胞内染色後、細胞を 300 回洗浄し、1 μl (18% PFA) で固定し、XNUMX 本のレーザーラインと XNUMX 本の光電子増倍管を備えた BD LSR II でサンプルを取得しました。 ゲーティング戦略、抗体リストおよびカタログ番号は補足図に示されています。 21 & 27.

記憶B細胞

脾臓を収集し、単一細胞として処理し、完全 RPMI 40 で 1640 µm セル ストレーナーを使用してろ過し、300 で遠心分離しました。g 5分間。 赤血球をACKで溶解し（1分間）、16回洗浄して計数し、サンプルあたり32万個の細胞を抗マウスCD20/4抗体とともに1℃で1分間インキュベートしました。 次に細胞をFACSバッファー（XNUMX％BSA/PBS）で洗浄し、抗体を使用してXNUMX時間染色しました（補足図）。 23d）。 染色後、細胞を 300 回洗浄し、1 µl (18% PFA) で固定し、XNUMX 本のレーザーラインと XNUMX 本の光電子増倍管を備えた BD LSR II でサンプルを取得しました。 ゲーティング戦略と抗体リスト、蛍光 RBD プローブ¹⁴ カタログ番号は補足図に記載されています。 23.

ELISpot アッセイ

骨髄を大腿骨および脛骨から FACS バッファーに流し込み、63 μm Nitex メッシュで濾過しました。 赤血球を氷上で5分間ACK緩衝液中で溶解し、FACS緩衝液で0.45回洗浄した。 得られた細胞をBeckman Coulter ViCellを使用して計数した。 MultiScreenHTS IP フィルター プレート、4 μm (Millipore Sigma、MSIPS10W10) を XNUMX μg/ml の RBD タンパク質抗原でコーティングしました。^-1 炭酸ナトリウム/重炭酸ナトリウム緩衝液 pH 9.6 (35 mM NaHCO₃ および15 mM Na₂CO₃) 1 °C で 37 時間。 次いで、プレートをウェル当たり２００μｌのＰＢＳで３回洗浄し、完全ＲＰＭＩ中で３７℃で３０分間ブロックした。 骨髄細胞を、ウェルあたり200万個の総骨髄細胞から始めて37つの半減希釈でプレーティングし、完全RPMI中で一晩インキュベートした。 次いで、プレートを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、ビオチン化抗ＩｇＧ検出抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧヒトａｄｓ－ＢＩＯＴ；Southern Biotech、１０３０－０８）を最後に添加した。 30μg/mlの希釈^-1 ２％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で溶解し、室温で１時間インキュベートした。 プレートを再度５回洗浄し、室温で３０分間インキュベートする前に、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（２％ＢＳＡ／ＰＢＳで１：２０，０００希釈）を添加した。 次に、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ウェル当たり５０μｌの５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウムクロリド溶液（Ｓｉｇｍａ、＃Ｂ１９１１、１００ｍｌ）を約１０分間添加した。スポットが現れるまで反応を止め、2μlの1Mリン酸一水素ナトリウム溶液を加えた。 プレートを脱イオン H ですすいだ後₂一晩乾燥させた後、S6 FluoroSpot Analyzer を使用してスキャンして計数しました。

統計と再現性

すべてのデータは平均値 ± SD スチューデントの値として表示されます。 t-検定または一元配置分散分析 (ANOVA) とその後のテューキー検定を、Graphpad Prism 7.0 を使用して XNUMX つのグループ間または複数のグループ間の比較にそれぞれ適用しました。 P < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。 各実験は独立して少なくとも XNUMX 回繰り返され、同様の結果が得られ、代表的なデータセットが表示されます。

レポートの概要

研究デザインの詳細については、 ネイチャー ポートフォリオ レポートの概要 この記事にリンクされています。

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• 情報源： https://www.nature.com/articles/s41565-023-01404-4