Materialvorbereitung und Charakterisierung

Wässrige GO-Lösung wurde in entionisiertem Wasser verdünnt, um 0.15 mg ml zu erhalten^-1 Lösung und vakuumfiltriert durch eine Nitrozellulosemembran mit Poren von 0.025 µm, wodurch ein dünner GO-Film entsteht. Der dünne Film wurde dann durch Nassübertragung in entionisiertem Wasser und weiterem thermischen Tempern bei 100 °C für 2 Minuten auf das Zielsubstrat übertragen. Der GO-Film-Substrat-Stapel wurde 134 Stunden lang bei 3 °C in einem Standardautoklaven hydrothermisch reduziert, um EGNITE zu bilden. Das Basissubstrat für alle Charakterisierungsstudien von EGNITE war ein Quadrat (1 × 1 cm).²) von Si/SiO₂ (400 μm/1 μm).

XPS

XPS-Messungen wurden mit einem Phoibos 150-Analysator (SPECS) unter Ultrahochvakuumbedingungen (Basisdruck 5 × 10) durchgeführt^-10 mbar) mit einer monochromatischen Al Kα-Röntgenquelle (1,486.74 eV). Übersichtsspektren wurden mit einer Durchgangsenergie von 50 eV und einer Schrittweite von 1 eV aufgenommen und hochauflösende Spektren wurden mit einer Durchgangsenergie von 20 eV und einer Schrittweite von 0.05 eV aufgenommen. Die Gesamtauflösung unter diesen letzten Bedingungen beträgt 0.58 eV, bestimmt durch Messung der Halbwertsbreite von Ag 3d5/2 Spitze aus gesputtertem Silber. Die XPS-Analyse zeigt nach der hydrothermischen Behandlung einen starken Rückgang des CO-Peaks (verbunden mit Epoxidgruppen), aber einen kleinen Beitrag von C-OH, C=O und C(O)OH aufgrund von Hydroxylen, Carbonylen und Carboxylen bleiben nach der Reduzierung bestehen. Die Entfaltung des O1s Peak bestätigt ein solches Verhalten. Der Hauptbeitrag zum C1s Signal nach der hydrothermischen Reduktion kommt jedoch aus sp² hybridisierte C-C-Orbitale^34,57.

Röntgenbeugung

Röntgenbeugungsmessungen (θ-2θ Scan) wurden in einem Materials Research Diffraktometer (Malvern PANalytical) durchgeführt. Dieses Diffraktometer hat eine Horizontale ω-2θ Goniometer (320 mm Radius) in Vierkreisgeometrie und gearbeitet mit einer keramischen Röntgenröhre mit Cu Kα Anode (λ = 1.540598 Å). Der verwendete Detektor ist ein Pixcel, ein schneller Röntgendetektor basierend auf der Medipix2-Technologie.

Raman-Spektroskopie

Raman-spektroskopische Messungen wurden mit einem Witec-Spektrographen durchgeführt, der mit einer 488-nm-Laseranregungslinie ausgestattet war. Für die Messungen wurden Raman-Spektren mit einem 50-fach-Objektiv und einem Gitter mit 600 Rillen pro nm aufgenommen; Die Laserleistung wurde unter 1.5 mW gehalten, um eine Erwärmung der Probe zu vermeiden.

TEM

Für die Querschnittsuntersuchung der EGNITE-Probe wurde mit einem Helios NanoLab DualBeam (LMA-INA) eine fokussierte Ionenstrahllamelle vorbereitet. Strukturanalysen wurden mittels TEM unter Verwendung eines Tecnai F20-Mikroskops durchgeführt, das bei 200 kV betrieben wurde, einschließlich HRTEM und ringförmiger Hochwinkel-Dunkelfeld-STEM-Techniken. Das STEM-EELS-Experiment wurde in einem Tecnai F20-Mikroskop mit 200 KeV, 5 mm Apertur, 30 mm Kameralänge, einem Konvergenzwinkel von 12.7 mrad und einem Sammelwinkel von 87.6 mrad durchgeführt. Da wir 0.5 eV pro Pixel und 250 eV als Startenergie bei der Kernverlusterfassung verwendet haben, haben wir nicht die erwartete Si-K-Kante bei 1,839 eV, die Pt-M-Kante bei 2,122 eV und die Au-M-Kante bei 2,206 eV erfasst 100 eV. Die relative CO-Atomzusammensetzung wurde ermittelt, indem wir unsere Aufmerksamkeit auf die reduzierte GO-Schicht richteten und davon ausgingen, dass die Summe der analysierten Kanten (C und O in unserem Fall) XNUMX % ergibt. Diese Annahme ist in unserem Fall gültig, wie aus dem hervorgeht Zusatzinformationen Karten. Der Energiedifferenzquerschnitt wurde mit dem Hartree-Slater-Modell und der Hintergrund mit einem Power-Low-Modell berechnet.

Elektrische Leitfähigkeit

Messungen der elektrischen Leitfähigkeit wurden mit einem Keithley 2400 Sourcemeter in Zweipunktkonfiguration durchgeführt. Die gemessenen Proben bestanden aus EGNITE-Filmen von 1 × 1 cm² auf einem SiO₂ Substrat.

Datenanalyse

Röntgenbeugungs-, Raman- und XPS-Daten wurden mit Python 3.7-Paketen (Numpy, Pandas, Scipy, Xrdtools, Lmfit, Rampy, Peakutils, Matplotlib) analysiert. Der Abstand zwischen den Ebenen wurde aus den Röntgenbeugungsmessungen nach dem Snelliusschen Gesetz berechnet. Sobald die Daten in den räumlichen Bereich verschoben wurden, wurde das Maximum der Peaks angepasst. Der entsprechende Abstand ergab einen Mittelwert des Abstands zwischen den Ebenen. Abweichungen von diesen Mittelwerten wurden aus der Halbwertsbreite der Lorentz-Anpassungen der Peaks im räumlichen Bereich berechnet. XPS- und Raman-Spektroskopiemessungen wurden analysiert, indem eine Faltung von Peaks an erwarteten Orten für die entsprechenden Merkmale angepasst wurde. Die Leitfähigkeitswerte von GO und EGNITE wurden durch Anpassen erhalten I-V Kurven gemessen bei der Messung der elektrischen Leitfähigkeit nach dem Ohmschen Gesetz. Daten sind n = 1 für jede Messung.

Flexible Array-Herstellung

Die Herstellung der Geräte ist in der ergänzenden Abbildung dargestellt. 4. Die Geräte wurden auf 4 Zoll Si/SiO hergestellt₂ (400 μm/1 μm) Wafer. Zunächst wurde eine 10 µm dicke PI-Schicht (PI-2611, HD MicroSystems) durch Schleuderbeschichtung auf den Wafer aufgetragen und in einer stickstoffreichen Atmosphäre 350 Minuten lang bei 30 °C gebacken. Metallische Spuren wurden mithilfe optischer Lithographie des Bildumkehr-Fotolacks (AZ5214, Microchemicals) strukturiert. Mittels Elektronenstrahlverdampfung wurden 20 nm Titan und 200 nm Gold abgeschieden und anschließend abgehoben. Als Kompromiss zwischen elektrochemischer Leistung und Array-Flexibilität haben wir einen EGNITE-Film mit einer Dicke von etwa 1 μm verwendet. Nach der Übertragung des GO-Films wurde Aluminium mittels Elektronenstrahl verdampft und Bereiche auf den zukünftigen Mikroelektroden wurden mithilfe eines negativen Fotolacks (nLOF 2070, Microchemicals) definiert und abgehoben. Als nächstes wurde der GO-Film überall außer den zukünftigen Mikroelektroden unter Verwendung eines sauerstoffreaktiven Ionenätzens (RIE) für 5 Minuten bei 500 W geätzt, und die schützenden Aluminiumsäulen wurden mit einer verdünnten Lösung aus Phosphor- und Salpetersäure geätzt. Anschließend wurde eine 3 µm dicke Schicht PI-2611 auf den Wafer aufgetragen und wie zuvor beschrieben gebacken. Anschließend wurden PI-2611-Öffnungen auf der Mikroelektrode mithilfe eines positiven dicken Fotolacks (AZ9260, Microchemicals) definiert, der als Maske für einen anschließenden Sauerstoff-RIE fungierte. Später wurden die Geräte auf der PI-Schicht strukturiert, wiederum unter Verwendung von AZ9260-Fotolack und RIE. Anschließend wurde die Photoresistschicht in Aceton entfernt und der Wafer in Isopropylalkohol gereinigt und getrocknet. Schließlich wurden die Geräte vom Wafer abgezogen und konnten in Sterilisationsbeutel gelegt werden, um drei Stunden lang bei 134 °C in einem Standardautoklaven hydrothermisch behandelt zu werden.

Elektrochemische Charakterisierung von Mikroelektroden

Die elektrochemische Charakterisierung der Mikroelektroden wurde mit einem Metrohm Autolab PGSTAT128N Potentiostat in 1× PBS (Sigma-Aldrich, P4417) mit 10 mM Phosphatpuffer, 137 mM NaCl und 2.7 mM KCl bei pH 7.4 und unter Verwendung einer Drei-Elektroden-Konfiguration durchgeführt. Als Referenz wurde eine Ag/AgCl-Elektrode (FlexRef, WPI) und als Gegenelektrode ein Platindraht (Alfa Aesar, 45093) verwendet.

Vor der Leistungsbewertung wurden die Elektroden mit 10,000 ladungsbalancierten Impulsen (1 ms, 15 µA) gepulst. Die Einwirkung kontinuierlicher Pulsierungsprotokolle auf die Elektroden erfolgte über 100 zyklische Voltammetriezyklen (–0.9 bis +0.8 V) bei 50 mV s^-1, 20 Wiederholungen von 5,000 Impulsen (1 ms) und Neubestimmung des Leerlaufpotentials.

Datenanalyse

Elektrochemische Charakterisierungsdaten wurden mit Python 3.7-Paketen (Numpy, Pandas, Scipy, Pyeis, Lmfit, Matplotlib) analysiert. Impedanzspektroskopische Daten wurden an ein äquivalentes elektrisches Modell angepasst, das aus einem Widerstand besteht (R) in Reihe mit einem Konstantphasenelement (CPE). Von dort aus wurde der CPE-Wert einer Kapazität angenähert und durch die geometrische Fläche der Mikroelektrode dividiert, um einen äquivalenten Wert für die Grenzflächenkapazität von EGNITE zu erhalten. Die Ladungsspeicherkapazität (CSC) der Mikroelektrode wurde aus zyklischen Voltammetriemessungen berechnet, indem die kathodischen und anodischen Bereiche des gemessenen Stroms integriert und durch die Abtastrate normalisiert wurden. Die kathodische und anodische Ladungsspeicherkapazität (cCSC und aCSC) bei einer Scanrate von 100 mV von EGNITE beträgt 45.9 ± 2.4 und 34.6 ± 2.8 mC cm^-2, beziehungsweise (n = 3). Wie für andere Materialien berichtet⁵⁸Die erhaltenen CSCs hängen von der Scanrate ab (ergänzende Abbildung). 5). Um das Vorhandensein von Sauerstoffreduktionsreaktionen zu beurteilen, haben wir die CV-Wellenform unter einem mit Stickstoff gespülten Elektrolyten gemessen⁵⁹ und beobachtete keine wesentlichen Unterschiede in der Wellenform (ergänzende Abbildung). 6). Unsere Ergebnisse gehen jedoch nicht vollständig auf die Auswirkungen von Sauerstoffreduktionsreaktionen auf die Ladungsinjektionskapazität von EGNITE ein und es bedarf weiterer Arbeit, um dies ordnungsgemäß zu untersuchen. Die Ladungsinjektionskapazität (CIC) der Mikroelektrode wurde ermittelt, indem die Stromimpulsamplitude bestimmt wurde, die (nach Entfernen des ohmschen Abfalls) eine Spannungsdifferenz hervorrief, die dem elektrochemischen Wasserfenster der Elektrode entsprach (–0.9 V für kathodisch und +0.8 V für anodisch gegenüber Ag/AgCl ) (Ergänzende Abb. 17)⁶⁰.

statistische Analyse

Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung, n = 18 für EIS und n = 3 für Chronopotentiometrien. Die Daten der Karte der kathodischen kapazitiven Spannungsausschläge sind der Mittelwert der kathodischen kapazitiven Spannungsausschläge für ein Ereignis für jede Impulsform von n = 3 Elektroden.

Bewertung der mechanischen Stabilität

Ultraschallbeschallung

EGNITE-Elektrodenarrays wurden in einem mit Wasser gefüllten Becherglas in einem Ultraschallwasserbad (Elmasonic P 180H) platziert. Die Ultraschallbehandlung erfolgte 37 Minuten lang bei 15 kHz und 200 Watt, gefolgt von weiteren 15 Minuten Ultraschallbehandlung bei 37 kHz und einer auf 300 Watt gesteigerten Leistung. Vor und nach den Ultraschallbehandlungsschritten wurden Bilder der Elektroden aufgenommen.

Bigsamkeitstest

Der Biegeaufbau (Abb. 2k) bestand aus drei zylindrischen Stäben; der mittlere (Durchmesser 700 µm) wurde abgesenkt, wodurch Biegewinkel von 131° entstanden. Für den Biegetest wurden drei flexible Mikroelektrodenarrays verwendet. Jedes Array enthielt 18 Mikroelektroden mit einem Durchmesser von 50 µm. Zwei Arrays wurden nach 10 und 20 Zyklen gemessen, während ein Gerät nur 10 Zyklen lang gemessen wurde, da es bei der Handhabung nach der Messung beschädigt wurde. Der Biegetestzyklus bestand aus einer 10 Sekunden langen Belastungsanwendung plus 10 Sekunden ohne Belastung. Die Geräte wurden vor und nach 10 und 20 Biegezyklen elektrochemisch charakterisiert (EIS und CV).

Epikortikale neuronale Aufzeichnung

Epikortikale Implantation

Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Rates der Europäischen Gemeinschaft und der französischen Gesetzgebung zur Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Die Protokolle wurden von der Grenoble-Ethikkommission (ComEth) genehmigt und vom französischen Ministerium genehmigt (Nummer 04815.02). Sprague-Dawley-Ratten (männlich, 4 Monate alt, Gewicht: ~600 g) wurden intramuskulär mit Ketamin (50 mg pro kg (Körpergewicht)) und Xylazin (10 mg pro kg (Körpergewicht)) anästhesiert und dann an einem stereotaktischen Halter fixiert. Durch die Entfernung des Schläfenschädels wurde der auditorische Kortex freigelegt. Die Dura mater wurde erhalten, um eine Schädigung des kortikalen Gewebes zu vermeiden. Am Scheitelpunkt wurde ein Loch gebohrt, um die Referenzelektrode einzuführen, und ein zweites Loch, 7 mm vor dem ersten, wurde gebohrt, um die Erdungselektrode einzuführen. Bei den Elektroden handelte es sich um 0.5 mm dicke Stifte, die für Sockel für integrierte Schaltkreise verwendet wurden. Sie wurden so platziert, dass sie elektrischen Kontakt mit der Dura mater herstellen, und mit Zahnzement am Schädel befestigt. Anschließend befestigten wir das Oberflächenmikroelektrodenband auf der Hörrinde, wie in Abb. 3b. Die Venenmuster identifizieren den auditorischen Kortex im Bereich 41 von Kriegs Rattengehirnkarte. Kortikale Signale wurden gleichzeitig mit einer Verstärkung von 1,000 verstärkt und mit einer Abtastrate von 33 kHz digitalisiert. Ein Lautsprecher 20 cm vor dem Ohr einer Ratte, kontralateral zur freigelegten Hirnrinde, lieferte akustische Reize. Die abgegebenen Reize wurden mit einem 0.25-Zoll-Mikrofon (Brüel & Kjaer, 4939) in der Nähe des Ohrs überwacht und im Schalldruckpegel (dB SPL re 20 μPa) dargestellt. Wir untersuchen die Scheitelpunkt-positiven (negativen) Reaktionen mittlerer Latenz, die durch abwechselnde Klicks bei 80 dB SPL und Ton-Burst-Stimuli bei 70 dB SPL mit Frequenzen im Bereich von 5 bis 40 kHz, einer Anstiegs- und Abfallzeit von 5 ms und hervorgerufen werden eine Dauer von 200 ms.

Datenanalyse

Elektrophysiologische Daten wurden mit Python 3.7-Paketen (Numpy, Pandas, Scipy, Neo, Elephant, Sklearn Matplotlib) und der benutzerdefinierten Bibliothek PhyREC (https://github.com/aguimera/PhyREC). r.m.s. Die Werte wurden mit einem gleitenden Fenster von 20 ms bei Frequenzen über 200 Hz berechnet. Spektrogramme wurden für einen Bereich zwischen 70 Hz und 1.1 kHz berechnet. PSD wurde über 60 Sekunden kontinuierlicher Aufzeichnungen berechnet. Für eine gegebene Elektrodenanordnung wurden zwei PSDs berechnet: in vivo (IV) und post mortem (PM). Das SNR wird in dB (20 × ln(r.m.s.(IV)/r.m.s.(PM))) ausgedrückt und für 20 logarithmisch beabstandete Punkte zwischen 10 Hz und 1 kHz interpoliert.

statistische Analyse

Epikortikale neuronale Daten, dargestellt in Abb. 3 werden aus Einzelmessungen an einem einzelnen Tier entnommen. In Abb. 3cEs werden Daten von 64 Elektroden dargestellt. In Abb. 3dwerden Daten von zwei ausgewählten Elektroden dargestellt. In Abb. 3f, PSD und SNR werden aus 64 EGNITE-Elektroden berechnet und als Mittelwert  ± s.d. angezeigt. In der ergänzenden Abb. 12c,d Mediandaten werden für 192 EGNITE-Elektroden präsentiert n = 3 Experimente und 60 Platinelektroden aus n = 1 Experiment.

Intrakortikale neuronale Aufzeichnung

Intrakortikale Implantation

Die Tiere wurden mit einer Mischung aus Ketamin/Xylazin (75:1, 0.35 ml/28 g i.p.) anästhesiert und dieser Zustand wurde mit einer Inhalationsmaske mit 1.5 % Isofluran aufrechterhalten. Mehrere Mikroschrauben wurden in den Schädel eingesetzt, um das Implantat zu stabilisieren, und die Schraube oben auf dem Kleinhirn diente als allgemeine Erdung. Die Sonde wurde in den präfrontalen Kortex implantiert (Koordinaten: AP, 1.5 mm; ML, ±0.5 mm; DV, –1.7 mm von Bregma). Die Implantation erfolgte durch Beschichten der Sonde mit Maltose (siehe Protokoll unten), um eine vorübergehende Steifigkeit der Sonde zu gewährleisten und das Einführen der Sonde zu erleichtern. Die Sonde wurde mit Zahnzement versiegelt. TDT-ZifClip-Anschlüsse wurden verwendet, um die Sonde über ein miniaturisiertes Kabel mit dem elektrophysiologischen System zu verbinden. Nach der Operation durchlief die Maus eine Erholungsphase von einer Woche und erhielt Analgetika (Buprenorphin) und entzündungshemmende Behandlungen (Meloxicam). Die neuronale Aktivität wurde mit dem Mehrkanal-Open-Ephys-System bei einer Abtastrate von 1 kHz mit einem Intan RHD30-Verstärker aufgezeichnet. Die Höraufgabenexperimente wurden in einer schallisolierten Box mit zwei darin befindlichen Lautsprechern durchgeführt, wobei Protokolle verwendet wurden, die auf zuvor beschriebenen Arbeiten basierten⁶¹. Der Tonreiz bestand aus einem 15 ms langen Klick mit weißem Rauschen, der 100 Mal (Zyklen) wiederholt wurde, jeweils im Abstand von 5 Sekunden (Interstimulusintervall). Während der Aufgabe konnte sich das Tier frei bewegen.

Maltose-Versteifungsprotokoll

Eine wässrige Maltoselösung wird bis zum Glasübergangspunkt erhitzt (T_g), zwischen 130 und 160 °C, auf einer Kochplatte oder in der Mikrowelle. Sobald die Maltose viskos ist, wird die Rückseite der Sonde nur noch mit der Maltose in Kontakt gebracht. Wenn die Maltose abkühlt, verfestigt sie sich und versteift die Sonde.

Datenanalyse

Neuronale Signale von jeder Elektrode wurden offline gefiltert, um SUA und LFPs zu extrahieren. SUA wurde durch Filterung des Signals zwischen 450 und 6,000 Hz geschätzt und die Spitzen einzelner Neuronen wurden mithilfe einer Hauptkomponentenanalyse mit Offline Sorter v.4 (Plexon) sortiert. Um LFPs zu erhalten, wurden die Signale mit benutzerdefinierten Skripten in Python auf 1 kHz heruntergesampelt, trendbereinigt und kerbgefiltert, um Rauschlinienartefakte (50 Hz und ihre Harmonischen) zu entfernen. Das AEP-SNR wurde als Verhältnis der Spitzen-N1-Amplitude und der Standardabweichung berechnet. einer Periode von 20 ms vor dem Reiz.

statistische Analyse

Die in Abb. dargestellten Daten. 3h, ich sind Mittelwert ± s.d., n = 30 als Anzahl der gemittelten Versuche. Die von derselben Elektrode aufgezeichneten Daten werden an den Tagen 30, 60 und 90 angezeigt. Es werden Daten von einem einzelnen Tier dargestellt.

Chronische epikortikale Biokompatibilität

Chirurgische Implantation von Geräten

Für diese Studie wurden insgesamt 27 erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten verwendet (Charles River). Die Tiere wurden bei einer Umgebungstemperatur von 21 ± 2 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 40–50 % in einem 12-Stunden-Licht-/12-Stunden-Dunkel-Zyklus gehalten. Die Ratten wurden in Gruppen gehalten und hatten während des gesamten Versuchszeitraums freien Zugang zu Futter und Wasser. Die experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Animal Welfare Act (1998) mit Genehmigung des britischen Innenministeriums und der örtlichen Tierschutz-Ethikprüfungsbehörde (AWERB) durchgeführt. Die Tiere wurden für die Dauer der Operation mit Isofluran (2–3 %) anästhesiert und die Tiefe der Anästhesie wurde durch den Zehenklemmreflextest überwacht. Die Tiere wurden in einen stereotaktischen Rahmen (Kopf, 900LS) gelegt, der sich über einer Wärmedecke befand, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Ein Kraniotomieloch (~5 mm ×4 mm) wurde 1 mm von der Mittellinie entfernt unter Verwendung eines Dentalbohrers mit einem 0.9 mm-Bohrer angefertigt, die Dura entfernt und das epikortikale Gerät auf der kortikalen Oberfläche des Gehirns platziert. Das Kraniotomieloch wurde mit Kwik-sil verschlossen, anschließend mit Zahnzement gesichert und die Haut zugenäht. Subkutane Injektionen von Kochsalzlösung (1 ml pro kg (Körpergewicht)) und Buprenorphin (0.03 mg pro kg (Körpergewicht)) wurden verabreicht, um verlorene Flüssigkeiten zu ersetzen und postoperative Schmerzen zu lindern, und die Narkose wurde abgesetzt.

Gewebesammlung und -verarbeitung

Die Tiere wurden 2, 6 oder 12 Wochen nach der Implantation mit einer für die Art der durchzuführenden Analyse geeigneten Methode getötet.

Histologie und Immunhistochemie

2, 6 oder 12 Wochen nach der Implantation wurden die Ratten durch Herzdurchblutung mit heparinisierten (10 U ml) getötet^-1, Sigma-Aldrich) PBS, gefolgt von 4 % Paraformaldehyd (PFA, Sigma-Aldrich) in PBS. Die Gehirne wurden 4 Stunden lang in 24 % PFA nachfixiert und dann für mindestens 30 Stunden in 48 % Saccharose in PBS überführt, bevor sie in Isopentan eingefroren wurden. Die Gehirne wurden dann bei –80 °C gelagert, bis sie bei 25 µm kryogeschnitten wurden. Anschließend wurde das Gewebe auf das ionisierte Calciumbindungsadaptermolekül 1 (Iba-1) gefärbt, um den Grad der Mikroglia-Aktivierung zu bestimmen. Kurz gesagt, Gewebeschnitte wurden 5 Stunde lang mit 0.1 % Ziegenserum in PBS mit 1 % Triton-X blockiert, bevor sie über Nacht bei 4 °C mit dem Primärantikörper Anti-Iba-1 (1:1,000, 019-19741; Wako) inkubiert wurden. Die Schnitte wurden dann 594 Stunde lang bei Raumtemperatur mit dem Sekundärantikörper Anti-Kaninchen Alexa Fluor 1 (400:11012, A-1; Thermo Fisher) gefärbt. Die Objektträger wurden mit Deckgläsern unter Verwendung des lichtbeständigen Eindeckmediums Prolong Gold mit 4,6-Diamidino-2-phenylindol (Thermo Fisher) montiert. Die Sonde deckte eine Fläche von 3 × 3.7 mm ab² auf der kortikalen Oberfläche des Gehirns; Für die Färbung ausgewählte Gewebeschnitte bedeckten eine Länge von 3.2 mm dieser Region. Die Objektträger wurden mit einem 3DHistech Pannoramic-250 Mikroskop-Objektträgerscanner bei 20-facher Vergrößerung abgebildet und die Bilder wurden mit CaseViewer v.2.4 (3DHistech) analysiert. Um die Mikroglia-Aktivierung zu beurteilen, wurde ein 3.2 mm großer Bereich abgedeckt und alle 100 µm ein Bild analysiert. Die Bilder wurden mit 8.5-facher Vergrößerung aufgenommen und zeigten einen Ausschnitt der epikortikalen Sondenstelle, 3 mm von der Mittellinie des Gehirns entfernt, der den Bereich direkt unter der Sondenstelle umfasste.

Bildverarbeitung

Die Mikroskopiedaten wurden mit einem Algorithmus zur Charakterisierung des Mikroglia-Phänotyps bildverarbeitet (ergänzende Abbildung). 13). Die Mikroglia-Aktivierung wurde mit einem benutzerdefinierten CellProfiler* (Broad Institute, Version 3.1.9 von) analysiert https://cellprofiler.org/) Pipeline. Zunächst wurde das Modul EnhanceOrSuppressFeatures verwendet, um filamentöse Strukturen wie Neuriten durch Anwendung der Tubeness-Enhancement-Methode zu verbessern. Aus den verbesserten Bildern wurden Zellen mithilfe des IdentifyPrimaryObjects-Moduls segmentiert. Vorläufige Messungen der Zellen deuteten darauf hin, dass der geeignete Objektdurchmesserbereich 3–40 Zoll Pixel betrug. Objekte außerhalb dieses Durchmesserbereichs oder die den Bildrand berühren, wurden verworfen. Die Zellen wurden mithilfe einer Zwei-Klassen-Otsu-Adaptive-Thresholding-Strategie mit einer adaptiven Fenstergröße von 50 Pixeln segmentiert. Die vom IdentifyPrimaryObjects-Modul identifizierten Objekte wurden in das MeasureObjectSizeShape-Modul eingegeben, um die erforderlichen Eigenschaften für die Zellklassifizierung zu berechnen. Im Modul „ClassifyObjects“ wurde als Kategorie, auf der Klassifizierungen basieren sollen, „AreaShape“ festgelegt und „Extent“ als entsprechendes Maß ausgewählt. Die Zellen wurden klassifiziert als 'aktiviert“ oder „nicht aktiviert“ basierend auf ihrer Extent-Eigenschaft, die das Verhältnis der von der Zelle eingenommenen Fläche zur von ihrem Begrenzungsrahmen eingenommenen Fläche darstellt. Dieser Klassifizierungsansatz wurde durch die Tatsache begründet, dass aktivierte Mikroglia große Zellkörper und keine Prozesse haben und daher einen weitaus größeren Anteil ihrer Begrenzungsrahmen einnehmen als ihre nicht aktivierten Gegenstücke. Abschließend wurden die Module CalculateMath und ExportToSpreadsheet genutzt, um die gewünschten Statistiken zu berechnen und auszugeben.

statistische Analyse

Datensätze sind n = 3 für jeden Gerätetyp (PI-only-Implantat (PI); PI mit freiliegendem mikrofabriziertem Gold (Gold); und PI mit mikrofabriziertem Gold und EGNITE (EGNITE) zu allen Zeitpunkten), mit Ausnahme von 6 Wochen-Gold n = 2 für ELISA-Daten. Die kontralateralen Hemisphären wurden zu jedem Zeitpunkt kombiniert, um sie zu ergeben n = 9 2 und 12 Wochen nach der Implantation und n = 8 6 Wochen nach der Implantation. Die Analyse der Daten erfolgte mit der Software GraphPad Prism v.8. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung einer Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukeys Mehrfachvergleichstest, sofern angemessen, abgeschlossen. P < 0.05 wurde als signifikant angesehen.

ELISA

Nach der Implantationsperiode wurden die Tiere durch eine Zervixluxation getötet. Hirngewebe wurde sowohl aus der rechten als auch aus der linken Gehirnhälfte entnommen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert. Das Gewebe wurde unter Verwendung von NP-40-Lysepuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, 1 % Nonidet P40-Ersatz, Fluka, pH-Wert eingestellt auf 7.4) lysiert, der Protease- und Phosphatase-Inhibitor (Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, Thermo Fisher) enthielt. gefolgt von einem mechanischen Aufschluss des Gewebes (TissueLyser LT, Qiagen). Die Proben wurden dann 10 Minuten lang bei 5,000 U/min zentrifugiert und der Überstand bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert. Das LEGENDplex Rat Inflammation Panel (Katalognummer 740401, BioLegend), ein perlenbasiertes Multiplex-ELISA-Kit, wurde zur Quantifizierung der folgenden Zytokine eingesetzt: IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-18, IL-33, CXCL1 (KC), CCL2 (MCP-1), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierend Faktor, Interferon-γ und Tumornekrosefaktor. Das Kit wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers betrieben, wobei das Protein in einem festen Volumen von 15 µl geladen wurde. Nach der Inkubation mit dem Überstand wurden die Perlen auf einem BD FACSVerse-Durchflusszytometer laufen gelassen und die Daten mit der Datenanalysesoftware LEGENDplex analysiert.

Neurale Stimulation

Intrafaszikuläre Implantation

Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission der Universitat Autònoma de Barcelona gemäß der Richtlinie 2010/63/EU des Rates der Europäischen Gemeinschaften genehmigt. Die Tiere wurden bei 22 ± 2 °C in einem 12 h-Licht/12 h-Dunkel-Zyklus gehalten, wobei Futter und Wasser frei verfügbar waren. Der Ischiasnerv anästhesierter weiblicher Sprague-Dawley-Ratten (250–300 g, ~18  Wochen alt) wurde chirurgisch freigelegt und die TIME-Elektroden wurden mit Hilfe einer geraden Nadel, die an einem 10-0-Schlingenfaden befestigt war, quer über den Ischiasnerv implantiert⁴⁶. Der Prozess wurde unter einem Dissektionsmikroskop überwacht, um die korrekte Position der aktiven Stellen innerhalb der Nervenbündel sicherzustellen (Abb. 4b). Während der Experimente wurde die Körpertemperatur des Tieres mit einem Heizkissen aufrechterhalten.

Die Nervenstimulation wurde durchgeführt, indem Züge von zweiphasigen Stromimpulsen mit einer festen Dauer von 100 µs pro Phase und steigender Amplitude von 0 auf 150 µA in Schritten von 1 oder 3 µA bei 3 Hz für 33 Sekunden (Stimulator DS4, Digitimer) durch die verschiedenen EGNITE angelegt wurden Mikroelektroden. Gleichzeitig wurden die CMAPs von GM-, TA- und PL-Muskeln mithilfe kleiner Nadelelektroden (13 mm lang, 0.4 mm Durchmesser, Edelstahl-Nadelelektroden A-03-14BEP, Bionic) aufgezeichnet, die in jedem Muskel platziert wurden⁶². Die aktive Elektrode wurde am Muskelbauch und die Referenz auf Sehnenhöhe platziert. Elektromyographieaufzeichnungen wurden verstärkt (×100 für GM und TA, ×1,000 für PL; P511AC-Verstärker, Grass), bandpassgefiltert (3 Hz bis 3 kHz) und mit einem PowerLab-Aufzeichnungssystem (PowerLab16SP, ADInstruments) bei 20 kHz digitalisiert.

Datenanalyse

Die Amplitude jedes CMAP wurde von der Grundlinie bis zum maximalen negativen Peak gemessen. Die Spannungsspitzenmessungen wurden auf die maximale CMAP-Amplitude normiert, die für jeden Muskel im Experiment erhalten wurde. Für jede aktive Stelle wurde ein Selektivitätsindex (SI) als Verhältnis zwischen der normalisierten CMAP-Amplitude für einen Muskel, CMAP, berechnet_iund die Summe der normalisierten CMAP-Amplituden in den drei Muskeln gemäß der Formel SI_i = nWCPA_i/∑nWCPA_j, bei der minimalen Stimulationsstromamplitude, die eine minimale funktionell relevante Muskelreaktion hervorrief (definiert als mindestens 5 % CMAP-Amplitude für einen der Muskeln im Verhältnis zur maximalen CMAP-Amplitude dieses Muskels, die zuvor bestimmt wurde). Anschließend wurden die aktiven Stellen mit dem höchsten SI für jeden der drei Muskeln als SIs für jeden Muskel in einem bestimmten Experiment ausgewählt.

Chronische intraneurale Biokompatibilität

Nach einem zuvor gemeldeten Verfahren^50,63, der Ischiasnerv anästhesierter weiblicher Sprague-Dawley-Ratten (250–300 g, ~18  Wochen alt) wurde freigelegt und die Geräte für die In-vivo-Biokompatibilität mit und ohne EGNITE wurden in Längsrichtung in den Schienbeinast des Ischiasnervs implantiert (n = 6–8 pro Gruppe). Kurz gesagt, der Nerv wird an der Trifurkation mit einer geraden Nadel durchstochen, die an einem 10-0-Schlingenfaden (STC-6, Ethicon) befestigt ist; Der Faden zieht an der pfeilförmigen Spitze des gebogenen Elektrodenstreifens. Die Spitze ist abgeschnitten, um den Faden zu entfernen, und die Spitzen jedes Arms sind leicht gebogen, um ein Herausziehen des Geräts zu verhindern. Die Wahl fiel auf ein Längsimplantat, da es eine bessere Untersuchung der Fremdkörperreaktion im Nerv ermöglicht⁵⁰.

Beurteilung der Nerven- und Tierfunktion

Die Tiere wurden während der Nachuntersuchung nach der Implantation mittels Nervenleitungs-, Algesimetrie- und Laufbahn-Fortbewegungstests untersucht⁶². Für Leitungstests wurde der Ischiasnerv der implantierten und kontralateralen Pfoten durch Nadelelektroden an der Ischiaskerbe stimuliert und der CMAP des PL-Muskels wie oben aufgezeichnet. Die Latenz und die Amplitude des CMAP wurden gemessen. Für den Algesimetrietest wurden Ratten auf eine Drahtnetzplattform gesetzt und mit einer Metallspitze, die an ein elektronisches Von-Frey-Algesimeter (Boseb) angeschlossen war, ein mechanischer, nicht schädlicher Reiz ausgeübt. Gemessen wurde die nozizeptive Schwelle (Kraft in Gramm, bei der die Tiere die Pfote zurückzogen) der implantierten im Vergleich zur kontralateralen Pfote. Für den Laufstreckentest wurde die Plantarfläche der Hinterpfoten mit schwarzer Tinte bemalt und jede Ratte ließ man einen Korridor entlanglaufen. Die Fußabdrücke wurden gesammelt und der Ischias-Funktionsindex berechnet⁶².

Histologie

Nach 2 oder 8 Wochen wurden die Tiere mit PFA (4 %) perfundiert und die Ischiasnerven entnommen, nachfixiert, kryokonserviert und für die histologische Analyse aufbereitet. Zur Auswertung des FBR wurden Ischiasnerven mit einem Kryostat (Leica CM15) in 190 μm dicke Querschnitte geschnitten. Die Proben wurden mit Primärantikörpern für myelinisierte Axone (Anti-RT97 zur Markierung von Neurofilament 200K, 1:200; Developmental Studies Hybridoma Bank) und Makrophagen (Anti-Iba-1, 1:500; Wako) gefärbt. Anschließend wurden die Schnitte 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit den Sekundärantikörpern Esel-Anti-Maus Alexa Fluor 488 und Esel-Anti-Kaninchen Alexa Fluor 555 (1:200, Invitrogen) inkubiert. Es wurden repräsentative Abschnitte aus dem zentralen Teil des Implantats im Schienbeinnerv ausgewählt, Bilder mit einem Epifluoreszenzmikroskop (Eclipse Ni, Nikon) aufgenommen, das an eine Digitalkamera (DS-Ri2, Nikon) angeschlossen war, und die Bildanalyse mit der ImageJ-Software (National Institutes) durchgeführt der Gesundheit). Die Menge an Iba-1-positiven Zellen im gesamten Bereich des Nervus tibialis wurde quantifiziert und die Dicke der Gewebekapsel als mittlerer Abstand jeder Seite des Implantats zu den nächstgelegenen Axonen gemessen.

statistische Analyse

Für die statistische Analyse der Daten verwendeten wir eine ein- oder zweifaktorielle ANOVA, gefolgt von einem Bonferroni-Post-hoc-Test für Unterschiede zwischen Gruppen oder Zeiten. Zur grafischen Darstellung und Analyse wurde die Software GraphPad Prism verwendet. Statistische Signifikanz wurde berücksichtigt, wenn P <0.05.

Berichtzusammenfassung

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie im Nature Portfolio-Berichtszusammenfassung mit diesem Artikel verlinkt.

• SEO-gestützte Content- und PR-Distribution. Holen Sie sich noch heute Verstärkung.
• PlatoData.Network Vertikale generative KI. Motiviere dich selbst. Hier zugreifen.
• PlatoAiStream. Web3-Intelligenz. Wissen verstärkt. Hier zugreifen.
• PlatoESG. Kohlenstoff, CleanTech, Energie, Umwelt, Solar, Abfallwirtschaft. Hier zugreifen.
• PlatoHealth. Informationen zu Biotechnologie und klinischen Studien. Hier zugreifen.
• Quelle: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01570-5