Động vật

Chuột cái Sprague Dawley (SD) (tuổi, 8~10 tuần; cân nặng, 180~200 g) và chuột C57BL/6 (nửa đực và cái; tuổi, 8~10 tuần; cân nặng, 15~20 g) được mua từ Trung tâm Động vật Phòng thí nghiệm Y tế Quảng Đông và được nuôi trong điều kiện không có mầm bệnh (SPF) tiêu chuẩn. Tất cả các động vật được nuôi trong chuồng động vật không có mầm bệnh (SPF) cụ thể trong môi trường được quy định tiêu chuẩn (chu kỳ sáng/tối 12 giờ) với quyền tiếp cận miễn phí thức ăn và nước uống, đồng thời được phép thích nghi trong ít nhất bảy ngày trước khi thí nghiệm. Các con vật được phân bổ ngẫu nhiên cho các nhóm thử nghiệm khác nhau và không sử dụng phương pháp làm mù nào trong quá trình thử nghiệm. Tất cả các quy trình thí nghiệm trên động vật sử dụng động vật thí nghiệm đều được thực hiện theo Hướng dẫn Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thí nghiệm (Hội đồng Nghiên cứu Quốc gia, 1996) và được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Đại học Tôn Trung Sơn (SYSU-IACUC-2021 -000438).

Văn hóa và sự khác biệt của NSC

NSC được lấy từ não thai nhi của chuột SD phôi thai 14 ngày. Tóm lại, đại não của phôi được cắt ra và lớp màng bao phủ và các mạch máu được lấy ra dưới kính hiển vi. Sau đó, não được phân tách cơ học trong dung dịch muối đệm phốt phát (PBS) làm lạnh trước để tạo ra huyền phù tế bào đơn và ly tâm ở tốc độ 1000 vòng quay mỗi phút (vòng/phút) trong 10 phút. Các viên tế bào được tái huyền phù và nuôi cấy với môi trường DMEM/F-12 (Gibco, Life Technologies, USA) có bổ sung 2% B-27™ (50X; Gibco, Life Technologies, USA), hệ số tăng trưởng 20 ng/ml (EGF) ; Peprotech, New Jersey, USA), yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi 20 ng/ml (FGF; Peprotech, New Jersey, USA), và 1% penicillin/streptomycin (10,000 U/ml, Gibco, Life Technologies, USA). Các NSC đã được tinh lọc bằng cách thông qua ba ngày một lần và các ô giữa các đoạn 2 ~ 5 đã được chọn để thực hiện điều tra thêm. Tất cả các tế bào đã được kiểm tra ô nhiễm mycoplasma cứ sau 3 tháng.

Để phân biệt NSC, các viên tế bào được tiêu hóa thành các tế bào đơn lẻ bằng Accutase (Millipore, Bedford, MA) và chịu sự biệt hóa tế bào thần kinh trên các đĩa nuôi cấy được phủ 0.1% poly-L-lysine (Gibco, Hoa Kỳ) trong Neurobasal (Gibco, Life Technologies , Mỹ) được bổ sung 2% B-27™. Phương tiện đã được thay đổi cứ sau 2 ~ 3 ngày.

Nuôi cấy và cảm ứng tế bào hình sao

Tế bào hình sao được phân lập từ chuột SD hai ngày sau sinh. Sau khi tước bỏ màng não và mạch máu, vỏ não sau đó được phân tách một cách cơ học bằng enzym thành huyền phù tế bào đơn với 0.25% trypsin ở 37°C trong 15 phút, sau đó lọc và ly tâm để thu thập các hạt tế bào. Các tế bào đã được đình chỉ với môi trường cơ bản (DMEM/F-12; 10% huyết thanh bào thai bò, FBS) và được mạ trên các tấm không tráng phủ trong 30 phút để loại bỏ các nguyên bào sợi và tế bào nội mô. Sau đó, các tế bào hình sao không kết dính được chuyển vào các đĩa mới được phủ sẵn 0.1% poly-l-lysin. Môi trường tế bào được thay đổi ba ngày một lần và được thông qua khi tốc độ hợp nhất của tế bào đạt ~ 90%. Các tế bào hình sao được lắc ở tốc độ 200 vòng/phút qua đêm để loại bỏ các vi tế bào thần kinh đệm ở lớp trên được gắn vào bề mặt của các tế bào hình sao, sau đó được quản lý bằng PLX5622, một chất tẩy tế bào thần kinh đệm cụ thể, để tinh chế thêm các tế bào hình sao trước khi đi qua. Tất cả các tế bào đã được kiểm tra ô nhiễm mycoplasma cứ sau 3 tháng. Để tạo ra tế bào hình sao phản ứng, các tế bào được ủ với bộ ba yếu tố TNFα (30 ng/ml), IL-1α (3 ng/ml) và C1q (400 ng/ml) trong 24 giờ và việc tạo ra thành công tế bào hình sao phản ứng đã được xác minh bởi C3 tăng cao⁺ hình thành tế bào hình sao thông qua phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang và xét nghiệm tế bào học dòng chảy.

Sự biểu hiện quá mức qua trung gian lentillin của UCHL1

Lentivirus biểu hiện quá mức UCHL1 (OE-UCHL1-LV) và vec tơ lentivirus trống (NC-LV) được xây dựng bởi HanBio Technology (Thượng Hải, Trung Quốc). Lentivirus được thiết kế để biểu hiện quá mức UCHL1 đã được sao chép vào vec tơ lentivirus pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-GFP-T2A-PURO chứa gen báo cáo ZsGreen. Các vec tơ lentillin đã được chuyển vào 293 tế bào T với sự có mặt của các plasmid đóng gói (psPAX2 và pMD2G) bằng cách sử dụng LipofiterTM (Công nghệ HanBio) để đóng gói lentillin. 293 tế bào T đã được thay thế và hiệu quả biểu hiện quá mức được đánh giá sau 48 giờ bằng qPCR. Hiệu giá véc tơ lentivirus cuối cùng là 2 × 10⁸ TU/ml.

Đối với nhiễm trùng NSC, các tế bào được thay thế bằng dung dịch lentivirus pha loãng với bội số nhiễm trùng (MOI) là 25, với việc bổ sung 1 mg/ml polybrene. Vào 24 giờ sau khi truyền, môi trường được thay thế bằng môi trường cơ bản mới (không có FBS) không có penicillin/streptomycin trong 24 giờ nữa. Biểu hiện GFP được hiển thị dưới kính hiển vi huỳnh quang sau 48 giờ sau khi truyền và sự biểu hiện quá mức của UCHL1 được xác định bằng phân tích Western blot và qPCR.

Đồng nuôi cấy NSC và tế bào hình sao

Hai hệ thống đồng nuôi cấy in vitro đã được tiến hành ở đây (Hình. 4C): (1) Chúng tôi đã sử dụng hệ thống truyền sóng cho phép tương tác thông qua các yếu tố khuếch tán. Tế bào hình sao Kiểm soát chưa được kích thích hoặc tế bào hình sao Phản ứng trong transwell nằm trên đỉnh của NSC được nuôi cấy ở khoang dưới và cả hai tế bào đều được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy cơ bản (không có FBS) của NSC. (2) chuyển môi trường có điều kiện tế bào hình sao đơn giản (ACM) từ môi trường nuôi cấy tế bào hình sao Kiểm soát/Phản ứng sang môi trường nuôi cấy của NSC. Sau khi ủ trong môi trường bình thường hoặc môi trường cảm ứng, tế bào hình sao được nuôi cấy với môi trường nuôi cấy cơ bản (không có FBS) của NSC trong 24 giờ nữa, sau đó ACM từ tế bào hình sao Kiểm soát hoặc tế bào hình sao phản ứng được thu thập và thêm vào môi trường cơ bản của NSC tại tỷ lệ 1:1 ACM với môi trường nuôi cấy NSCs. Sự tăng sinh tế bào, sự hình thành đáng kể và hoạt động đáng tin cậy được đánh giá sau 24 giờ.

Xét nghiệm tăng sinh tế bào

Sự tăng sinh tế bào trong ống nghiệm đã được kiểm tra bởi sự hợp nhất của EdU. NSC được ủ với môi trường nuôi cấy bổ sung 10 µM EdU qua đêm trước khi thu hoạch. Các tế bào được cố định với 4% paraformaldehyde (PFA), sau đó là quá trình thẩm thấu, sau đó rửa hai lần bằng albumin huyết thanh bò 3% (BSA) và nhuộm màu bằng bộ xét nghiệm Click-iT EdU (US Everbright INC.) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi rửa một lần, các tế bào được tái tạo huyền phù bằng dung dịch Hoechst (2 µg/ml; US EVERBRIGHT INC.) để nhuộm DNA đối chiếu trước khi phân tích trên Cytoflex LX hoặc kính hiển vi đồng tiêu quét laze (LSCM). Các ô điều khiển không chịu EdU nhưng đã trải qua quá trình phát hiện EdU huỳnh quang được sử dụng làm cơ sở âm tính để đánh giá các giá trị ngưỡng đối với mức độ tích cực của EdU. Để định lượng xét nghiệm EdU, tỷ lệ của EdU⁺ các tế bào trong ít nhất ba lần lặp lại giữa các nhóm khác nhau đã được tính.

phân tích proteostat

Các tế bào đã được cố định như đã đề cập ở trên, sau đó được thấm bằng Triton X-0.5/PBS 100% trên đá và lắc nhẹ trong 30 phút. Sau khi rửa hai lần bằng PBS, các tế bào được tạo huyền phù lại bằng Thuốc thử phát hiện khối u PROTEOSTAT (1:2000) và được bảo vệ khỏi ánh sáng ở nhiệt độ phòng (RT) trong 30 phút, sau đó được nhuộm ngược lại với Hoechst 33342 (1:1000). Các tế bào nhuộm màu được phân tích bằng kính hiển vi đồng tiêu. Đối với phương pháp tế bào học dòng chảy, 500 µl Thuốc thử Phát hiện Aggresome PROTEOSTAT 1:10000 mới pha loãng được áp dụng để ủ các tế bào trong 30 phút dưới sự bảo vệ khỏi ánh sáng. Một thử nghiệm thiếu chất dinh dưỡng đã loại bỏ proteostat và chất ức chế proteasome được tiến hành dưới dạng kiểm soát. MG132, một chất ức chế đáng tin cậy làm tăng tốc độ hình thành các khối aggresome quanh hạt nhân trong các tế bào, được sử dụng như một biện pháp kiểm soát tích cực. Đối với tình trạng thiếu chất dinh dưỡng, các tế bào được ủ trong HBSS (Gibco) được bổ sung 1 mM HEPES để ngăn quá trình axit hóa quá mức trong 3 giờ, sau đó môi trường được thay thế bằng môi trường nuôi cấy cơ bản. Ghi nhãn proteostat được xác định bởi diện tích huỳnh quang tương đối của protein aggresome trong cùng một trường quan sát qua các phương pháp điều trị khác nhau, với ít nhất ba lần sao chép sinh học.

Xét nghiệm hoạt động đáng tin cậy

Các thử nghiệm hoạt động đáng tin cậy đã được thực hiện bởi một đầu dò hoạt động đáng tin cậy theo hướng dẫn. Các tế bào đã xử lý được ủ với đầu dò hoạt tính đáng tin cậy 5 µM Me4BodipyFl-Ahx3Leu3VS (Boston Biochem) trong 2 giờ ở 37°C, sau đó rửa sạch và phân tích bằng phương pháp tế bào học dòng chảy.

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA)

Mức C3a trong máu ngoại vi và CSF được thu thập từ chuột SCI đã được phát hiện thông qua bộ ELISA RayBio huMan C3a (RayBiotech) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, 100 µl chất chuẩn hoặc mẫu được thêm vào mỗi giếng và ủ trong 2.5 giờ ở RT với lắc nhẹ, sau đó rửa bốn lần và ủ với kháng thể đánh dấu biotin trong 1 giờ. Sau đó, 100 μl Streptavidin liên hợp với HRP đã được thêm vào, tiếp theo là ủ thuốc thử cơ chất một bước 3,3,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) trong 30 phút tại RT trong bóng tối và lắc nhẹ. Cuối cùng, chấm dứt hoạt động bằng dung dịch dừng và giá trị độ hấp thụ ở 450nm được đo và ghi lại ngay lập tức.

Mô hình chấn thương tủy sống và quản lý lentillin

Để tạo ra mô hình chuột của SCI chuyển tiếp hoàn chỉnh đốt sống ngực thứ 10 (T10), chuột SD cái đã được gây mê và lông lưng được cạo và khử trùng bằng Iodine Volts Swab. Một vết rạch khoảng 2 cm được thực hiện trên da T9-T11, sau đó lớp mỡ, lớp cân và cơ cạnh sống được tách ra lần lượt để lộ ra đốt sống T10. Sau đó, phẫu thuật cắt bỏ T10 được thực hiện và mô cột sống T10 được cắt ngang hoàn toàn bằng dao mổ sắc. Sau khi cầm máu, chuột được chia ngẫu nhiên thành sáu nhóm và tổng cộng 10 μl hỗn hợp đặc hiệu được tiêm vào vị trí tổn thương bằng ống tiêm siêu nhỏ theo các nhóm động vật như sau: Nhóm Sham (không có SCI; n = 12); nhóm kiểm soát tổn thương (PBS; n = 12); vectơ lentivirus rỗng (NC-LV; 2 × 10⁸ TU/ml; n = 12); mã hóa véc tơ lentivirus UCHL1 (OE-UCHL1-LV; 2 × 10⁸ TU/ml; n = 12) nhóm; UCHL1 người tái tổ hợp (rh-UCHL1; 4 μm; n = 12) nhóm; và LDN-57444 (chất ức chế UCHL1; 2 mM; n = 12) nhóm. Tổng cộng 5 μl virus hoặc protein tái tổ hợp được trộn riêng với 5 μl Matrigel trước khi tiêm vào các tổn thương của chuột SCI để tránh thất thoát.

Nhiệt độ cơ thể của động vật được duy trì ở mức ~ 37 ° C bằng cách sử dụng miếng đệm sưởi ấm trong suốt quá trình phẫu thuật cho đến khi hồi sinh hoàn toàn sau khi gây mê. Trong quá trình chăm sóc hậu phẫu, động vật đã trải qua quá trình sơ tán bàng quang thủ công cho đến khi phục hồi khả năng đi tiểu tự chủ và kiểm tra hàng ngày các vết thương, nhiễm trùng, sụt cân, tự thực của ngón chân và khả năng vận động. Tất cả các động vật được sử dụng trong thí nghiệm này không có biểu hiện nhiễm trùng vết thương, xói mòn hoặc tự gây ra vết thương.

Xây dựng và tiêm vi rút liên quan đến Adeno (AAV)

AAV nhắm mục tiêu UCHL1 pAAV-Nestin-tdTomato-P2A-3xFLAG-Uchl1-tWPA hoặc vectơ điều khiển chỉ với huỳnh quang tdTomato (pAAV-Nestin-tdTomato-P2A-3xFLAG-MCS-tWPA) được tạo bởi OBiO Technology Corp., Ltd ( Thượng Hải). Gen UCHL1 đã được nhân dòng phụ vào các plasmid pAAV-Nestin-tdTomato-P2A-3xFLAG-WPRE để tạo ra pAAV-Nestin-tdTomato-P2A-3xFLAG-Uchl1-tWPA. Hiệu giá vi rút là 6.81E + 12 Bộ gen Vector trên mỗi mL (VG/ml) được xác định bởi qPCR. Những con chuột SD cái đã trải qua SCI chuyển tiếp hoàn chỉnh T10 như mô tả ở trên, sau đó vi-rút (thể tích 1.5 μl) được đưa vào trung tâm tổn thương bằng một ống tiêm siêu nhỏ ngay sau phẫu thuật. Động vật đã bị hy sinh sau hai tuần sau khi tiêm vi-rút để phân tích thêm.

xét nghiệm BrdU

Việc kích hoạt NSC trong tủy sống được đánh giá bởi BrdU (5-bromodeoxy-2′-deoxyuridine; Sigma) sau khi tiêm AAV. Chuột SCI được quản lý bằng AAV đã được tiêm BrdU (30 mg / kg trọng lượng cơ thể) trong màng bụng hàng ngày sau khi phẫu thuật trong 2 tuần cho đến khi trợ tử. Các dây cột sống bị thương đã được thu thập và các phần đông lạnh (10 Pha) đã được chuẩn bị trên một bộ điều hòa nhiệt độ. Các phần được xử lý trước bằng HCL 2 M trong 30 phút ở 37°C, tiếp theo là axit boric 0.1 M (pH 8.5) (Biosharp) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các phần bị chặn, được ủ với kháng thể chính chống BrdU và kháng Nestin (1: 1000; Sigma) qua đêm ở 4 ° C và sau đó, các kháng thể thứ cấp kết hợp với Alexa Flour 488/647 và sau đó được chống lại bằng DAPI trước khi quan sát.

Ức chế tế bào hình sao phản ứng và con đường C3/C3aR ở chuột SCI

Để ngăn chặn tế bào hình sao phản ứng sau SCI bằng cách sử dụng kháng thể trung hòa [30], chuột C57BL/6 chứ không phải chuột SD đã được chọn để tiến hành thí nghiệm chuyển gen T10 do nhu cầu lớn về kháng thể trung hòa in vivo. Mong đợi cho nhóm Sham (không có SCI; n = 12), tất cả chuột đều được trải qua SCI chuyển vị T10 hoàn chỉnh và được tiêm bộ ba kháng thể trung hòa (nhóm Trung hòa abs; TNFα/IL-1α/C1q, mỗi kháng thể 10 mg/kg; n = 12), kháng thể IgG đối chứng (nhóm IgG; 10 mg/kg; n = 12) và nước muối sinh lý 0.9% (Nhóm kiểm soát tổn thương; n = 12) qua đường tiêm trong màng bụng hai ngày một lần. Để chặn con đường C3/C3aR, chất đối kháng C3aR (SB290157; 10 mg/kg) hoặc nước muối sinh lý 0.9% được tiêm trong màng bụng ở chuột SCI hoặc Sham hàng ngày. Và động vật được xử lý bằng EdU (50 mg/kg) để theo dõi các NSC tăng sinh. Sau 7 ngày sau tổn thương, tất cả các động vật đã bị hy sinh để đánh giá kích hoạt NSC.

kiểm tra hành vi

Thử nghiệm xếp hạng vận động Basso, Beattie & Bresnahan (BBB) ​​[36] được thực hiện vào 2 ngày trước khi bị thương, 1~3 ngày và sau phẫu thuật hàng tuần để đánh giá các chức năng vận động của các chi sau. Chuột được đặt ở nơi yên tĩnh, thoáng để đảm bảo chuột vận động tự phát, sau đó quan sát và ghi lại hoạt động đi lại và vận động của các chi sau. Thang đo BBB bao gồm ba phần: I. chuyển động khớp của các chi sau, được cho điểm từ 0~7; II. dáng đi và chức năng phối hợp của chi sau, đạt điểm 8~13; III. độ mịn của bàn chân khi chuyển động, đạt điểm 14 ~ 21. Đánh giá hành vi được tiến hành hàng tuần sau SCI bởi hai nhà điều tra quen thuộc với các tiêu chí BBB, một cách riêng biệt.

kiểm tra điện sinh lý

Đánh giá điện sinh lý được thực hiện như mô tả trước đây [37, 60] vào lúc 8 tuần sau SCI ở chuột hoặc 6 tuần sau chấn thương ở chuột. Động vật đã được gây mê lại và phẫu thuật cắt lớp được thực hiện để lộ tủy sống T7 và T13, cả hai đều là ba đoạn đầu và đuôi của vị trí tổn thương. Một điện cực kích thích lưỡng cực có khoảng cách 2 mm được đặt ở đoạn T7 trong xương sống và một điện cực bóng bạc được đặt ở đoạn T13 ở đuôi để ghi lại phản ứng gợi lên. Xung sóng vuông 0.1 ms được phân phối ở khoảng thời gian 10 ms và hoạt động của trường được khuếch đại và ghi lại. Ít nhất 20 dấu vết từ mỗi vị trí ghi được tính trung bình và biên độ của tiềm năng gợi lên đã được định lượng.

Mảng protein của dịch não tủy từ động vật SCI

Dịch não tủy (CSF) được chiết xuất bằng cách sử dụng paracentesis từ bể chứa tiểu não. Tóm lại, vào lúc 6 giờ sau khi SCI chuyển đổi hoàn thành T10, chuột (n = 4) đã được gây mê lại và cố định bằng thiết bị định vị lập thể. Sau đó, phần nhô ra của chẩm được bộc lộ, và một mao mạch thủy tinh được đưa vào bể hành tủy tiểu não một cách cẩn thận qua xương chẩm. Khoảng 100~120 μl CSF được thu thập từ mỗi con chuột và giữ ở -80 °C để điều tra thêm. mẫu CSF từ một số lượng chuột bằng nhau (n = 4) không phẫu thuật được dùng làm đối chứng.

Các phân tích microarray protein của CSF được thu hoạch từ chuột bình thường / SCI được thực hiện bởi G-Series Rat Cytokine Array (RayBiotech, Inc., Quảng Châu, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tổng cộng 100 μl mẫu từ mỗi con chuột đã được sử dụng và dữ liệu thô thu được được tiến hành trừ và chuẩn hóa nền trước khi phân tích phân cụm. Chú thích bản thể gen (GO), bao gồm ba phần bao gồm chức năng phân tử, quá trình sinh học và thành phần tế bào, được áp dụng để xác định chức năng của các gen tiềm năng. Các đường dẫn tín hiệu có thể có liên quan đã được phân tích bởi cơ sở dữ liệu của Bộ bách khoa toàn thư về bộ gen và bộ gen (KEGG) ở Kyoto.

nhuộm miễn dịch huỳnh quang

Đối với phân tích hóa mô miễn dịch, các tế bào đã được cố định bằng 4% PFA và được thấm bằng Triton X-0.5 100%, sau đó bị chặn trong 5% BSA trong 1 giờ tại RT. Đối với hóa mô miễn dịch, động vật được truyền nước muối sinh lý 0.9%, sau đó là 4% PFA trong PBS 0.1 M (pH 7.2), sau đó đoạn cột sống 2~3 cm bao quanh trung tâm tổn thương, với 2 đoạn trên (+4 mm) và 2 đoạn dưới (−4 mm), đã được mổ xẻ và trích xuất. Các mẫu được cố định sau 6 ~ 8 giờ và khử nước trong sucrose 20% và 30% trong 3 ngày liên tiếp. Sau khi nhúng vào Tissue-Tek OCT (Sakura), các lát cắt dọc (10 μm) bao quanh trung tâm tổn thương và các mặt cắt ngang (10 μm) của tâm chấn thương T10 được thu thập trên máy lạnh và bảo quản ở -20°C để sử dụng tiếp . Các phần đông lạnh của tủy sống được rửa trong PBS trong 15 phút và sau đó trải qua quá trình thu hồi kháng nguyên bằng Proteinase K và ngăn chặn bằng 5% BSA được bổ sung 0.3% Triton X-100 trong 2 giờ. Sau quy trình chặn, các tế bào và lát cố định được ủ với các kháng thể đầu tiên qua đêm ở 4 ° C. Các kháng thể đầu tiên được sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm: UCHL1 (1:300; Công nghệ tín hiệu tế bào, CST), Nestin (1:300; Công nghệ tín hiệu tế bào, CST), SOX2 (1:300; Abcam), Protein axit dạng sợi thần kinh đệm ( GFAP; 1:300; Công nghệ tín hiệu tế bào, CST), Protein liên kết vi ống 2 (MAP2; 1:300; Abcam), Sợi thần kinh 200 (NF-200; 1:300; Công nghệ tín hiệu tế bào, CST), CNPase (1:300 ; Công nghệ Tín hiệu Tế bào, CST), NeuN (1:300; Abcam), C3a (1:10; Abcam), C3aR (1:200; Santa Cruz), NG2 (1:200; Santa Cruz), Doublecortin (DCX; 1:300; Abcam), Ki-67 (1:800; Abcam), Tubulin β3 (1:300; Công nghệ Tín hiệu Tế bào, CST), BrdU (1:1000, Sigma). Sau khi rửa trong PBS ba lần, các tế bào và các phần sau đó được ủ với các kháng thể thứ cấp kết hợp với Alexa Flour 488/594/647 và được chống lại bằng DAPI (1: 5000; Sigma). Tất cả các hình ảnh miễn dịch huỳnh quang được thu được bằng kính hiển vi đồng tiêu Zeiss LSM 880.

Định lượng phân tích tiêu điểm

Tất cả các hình ảnh đồng tiêu từ các tế bào và mô cột sống đã được kiểm tra bằng kính hiển vi đồng tiêu Zeiss LSM 880 và được định lượng theo cách làm mù như sau. 4 ~ 5 phần tủy sống từ các cấp độ khác nhau (bao gồm cả lưng, giữa và bụng) đã được chọn trong mỗi con chuột / chuột. Các phần được sử dụng để định lượng được chọn từ cùng một cấp độ giữa các nhóm càng nhiều càng tốt trong các điều kiện khác nhau. Các hình ảnh để định lượng chủ yếu được chụp từ vị trí tổn thương ở các mặt cắt dọc và xung quanh ống trung tâm ở các mặt cắt ngang của động vật SCI. Các sơ đồ minh họa nơi chụp ảnh vi mô và các vị trí định lượng trong các hình liên quan được hiển thị trong Hình. 6A. Mỗi điểm dữ liệu đại diện cho một lần thử nghiệm lặp lại hoặc thu được từ một con chuột/chuột. Tất cả các thí nghiệm được tiến hành ít nhất ba lần với các bản sao sinh học.

Để định lượng các tế bào dương tính với UCHL1 ở vị trí tổn thương của tủy sống, phần trăm tín hiệu DAPI được bao quanh bởi UCHL1 đã được tính. Định lượng C3⁺ tế bào hình sao phản ứng, SOX2⁺ NSC, NSC tăng sinh và tế bào thần kinh in vitro và in vivo, C3/GFAP⁺, Ki-67/Nestin⁺, SOX2/Nestin⁺, BrdU/Nestin⁺, BrdU/Tubulin β3⁺ các ô nhuộm màu kép được đếm thủ công trong cùng một trường xem và tỷ lệ các ô dương tính đã được định lượng. Định lượng GFP⁺ các tế bào bị nhiễm vec tơ lentivirus mã hóa UCHL1 ở trung tâm tổn thương in vivo, nhuộm kép GFP/Nestin⁺ NSC, GFP/NG2⁺ OPC, GFP/Tubulin β3⁺ tế bào thần kinh, GFP/NeuN⁺ tế bào thần kinh và GFP/GFAP⁺ tế bào hình sao được đếm thủ công và tỷ lệ của từng ô riêng lẻ so với tổng GFP⁺ các tế bào đã được tính toán, tương ứng. Để định lượng khả năng phản ứng miễn dịch của Nestin và NF-200, diện tích huỳnh quang tương đối của Nestin/NF-200 ở trung tâm tổn thương của từng phần quang học được đo bằng Image J.

Phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực định lượng (qPCR)

Tổng số RNA từ NSC hoặc mô tủy sống được chiết xuất bằng Trizol (Invitrogen, công nghệ sự sống) theo thông số kỹ thuật của thuốc thử. Số lượng của năng suất RNA được xác định bởi Nanodrop (ThermoFisher). Tổng số RNA đã được phiên mã ngược thành cDNA bằng cách sử dụng Bộ thuốc thử PrimeScript RT (Vazyme). Xét nghiệm Q-PCR được tiến hành bằng cách sử dụng SYBR Premix EX Taq (Vazyme). Các mức độ biểu hiện đã được chuẩn hóa thành các mức độ của glyceraldehyd 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Biểu hiện tương đối của gen được tính toán khi thay đổi lần sử dụng phương pháp 2−ΔΔCt. Trình tự mồi cho các gen như sau. Uchl1, Đoạn mồi xuôi (5′–3′): TGAAGGCAGACCATCGGGAAC, Đoạn mồi ngược (5′–3′): GAGTCATGGGCTGCCTGAAT; Uchl3, Đoạn mồi xuôi (5′–3′): GGTCAGACTGAGGCACCAAG, Đoạn mồi ngược (5′–3′): CTCATCAGGGTCGCGCTC; Uchl5, Mồi xuôi (5′–3′): AGACCTTAGCAGAACACCAGC, Mồi ngược (5′–3′): CAGCAGTGTACACATGTCCAAAT; Gapdh, Đoạn mồi xuôi (5′–3′): TGATTCTACCCACGGCAAGTT, Đoạn mồi ngược (5′–3′): TGATGGGTTTCCCATTGATGA.

Tây phương

Western blot đã được tiến hành để phát hiện sự làm giàu protein trong tế bào và mô cột sống. Tóm lại, các tế bào và khoảng 1 cm mô cột sống chứa vị trí tổn thương đã được lọc trong PIPA (Solarbio) được bổ sung PMSF (1:100; Solarbio) và phân tách siêu âm trên băng. Tổng cộng 20 µg protein được chạy trên gel điện di natri dodecyl sulfat-polyacrylamide (SDS-PAGE) 10-12%, được chuyển sang màng polyvinylidene Difluoride (PVDF; Millipore, Mississauga, Canada) và được chặn bằng sữa không béo 5%. Sau đó, các màng được ủ với các kháng thể đầu tiên qua đêm ở 4°C kèm theo lắc nhẹ, sau đó là sự kết hợp với các kháng thể thứ cấp liên hợp với peroxidase cải ngựa (HRP) (1:1000). Quá trình làm giàu protein được hiển thị thông qua thuốc thử phát quang hóa học và phân tích thang độ xám của các dải được xác định bằng Image J. Các kháng thể đầu tiên được áp dụng trong nghiên cứu này như sau: UCHL1 (1:1000; Công nghệ tín hiệu tế bào, CST), 20S đáng tin cậy (1:1000; Ái lực Bioscatics LTD), Ubiquitin (1:1000; Abcam), Nestin (1:1000; Công nghệ Tín hiệu Tế bào, CST), GFAP (1:1000; Công nghệ Tín hiệu Tế bào, CST), MAP2 (1:1000; Abcam), NF- 200 (1:1000; Công nghệ Tín hiệu Di động, CST), C3a (1:1000; Abcam), C3aR (1:500; Santa Cruz), Thẻ DYKDDDDK (1:1000; Công nghệ Tín hiệu Di động, CST), GAPDH (1: 1000, Công nghệ sinh học Beyotime), β-actin (1:1000, Công nghệ sinh học Beyotime). GAPDH và-actin đã được sử dụng làm biện pháp kiểm soát nội bộ.

Thống kê học

SPSS (Phiên bản 20.0; Abbott Laboratories, Chicago, IL) đã được áp dụng để phân tích thống kê. Học sinh độc lập, không ghép đôi hai đuôi t test được sử dụng để so sánh giữa hai nhóm. Đối với nhiều phép so sánh, phân tích phương sai một chiều (ANOVA), sau đó là phân tích bài hoc Tukey HSD hoặc thử nghiệm Kruskal-Wallis với phân tích hiệu chỉnh Bonferroni đã được chọn. Và ANOVA hai chiều với Tukey HSD đã được tiến hành để phân tích điểm số BBB. Không có phương pháp thống kê nào được sử dụng để xác định trước cỡ mẫu. Động vật được phân bổ ngẫu nhiên vào các nhóm thử nghiệm. Không có phương pháp làm mù nào được sử dụng trong quá trình thử nghiệm. Không có tiêu chí loại trừ động vật. Phương sai là tương tự giữa các nhóm được so sánh thống kê. Tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (SEM) và P <0.05 được coi là có ý nghĩa thống kê.

• Phân phối nội dung và PR được hỗ trợ bởi SEO. Được khuếch đại ngay hôm nay.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. Trao quyền cho chính mình. Truy cập Tại đây.
• PlatoAiStream. Thông minh Web3. Kiến thức khuếch đại. Truy cập Tại đây.
• Trung tâmESG. Ô tô / Xe điện, Than đá, công nghệ sạch, Năng lượng, Môi trường Hệ mặt trời, Quản lý chất thải. Truy cập Tại đây.
• BlockOffsets. Hiện đại hóa quyền sở hữu bù đắp môi trường. Truy cập Tại đây.
• nguồn: https://www.nature.com/articles/s41419-023-06003-8