Materialberedning och karakterisering

Vattenhaltig GO-lösning späddes i avjoniserat vatten för att erhålla en 0.15 mg ml^-1 lösning och vakuumfiltrerades genom ett nitrocellulosamembran med porer på 0.025 µm, vilket bildar en tunn film av GO. Den tunna filmen överfördes sedan till målsubstratet med användning av våtöverföring i avjoniserat vatten och ytterligare termisk glödgning vid 100°C under 2 minuter. GO-filmsubstratstapeln reducerades hydrotermiskt vid 134 °C i en standardautoklav under 3 h för att bilda EGNITE. Bassubstratet för alla karakteriseringsstudier av EGNITE var en kvadrat (1 × 1 cm²) av Si/SiO₂ (400 μm/1 μm).

XPS

XPS-mätningar utfördes med en Phoibos 150 analysator (SPECS) i ultrahöga vakuumförhållanden (bastryck, 5 × 10^-10 mbar) med en monokromatisk Al Ka-röntgenkälla (1,486.74 50 eV). Översiktsspektra förvärvades med en passenergi på 1 eV och stegstorlek på 20 eV och högupplösta spektra förvärvades med passenergi på 0.05 eV och stegstorlek på 0.58 eV. Den totala upplösningen under de sista förhållandena är 3 eV, bestämt genom att mäta hela bredden vid halva maximum av Ag XNUMXd5/2 topp av sputtert silver. XPS-analysen visar en kraftig minskning efter hydrotermisk behandling av C–O-toppen (associerad med epoxidgrupper), men ett litet bidrag av C–OH, C=O och C(O)OH på grund av hydroxyler, karbonyler och karboxyler som kvarstår efter reduktion. Dekonvolutionen av O1s peak bekräftar sådant beteende. Det huvudsakliga bidraget till C1s signal efter den hydrotermiska reduktionen kommer dock från sp² hybridiserade C–C orbitaler^34,57.

Röntgendiffraktion

Röntgendiffraktionsmätningar (θ-2θ scan) utfördes i en Materials Research Diffractometer (Malvern PANalytical). Denna diffraktometer har en horisontell ω-2θ goniometer (320 mm radie) i en fyrcirkelgeometri och arbetade med ett keramiskt röntgenrör med Cu Kα-anod (λ = 1.540598 Å). Detektorn som används är en Pixcel som är en snabb röntgendetektor baserad på Medipix2-teknik.

Raman-spektroskopi

Raman-spektroskopimätningar utfördes med användning av en Witec-spektrograf utrustad med en 488 nm laserexcitationslinje. För mätningarna förvärvades Raman-spektra med ett 50× objektiv och ett 600 spår per nm gitter; lasereffekten hölls under 1.5 mW för att undvika provuppvärmning.

TEM

En fokuserad jonstrålelamell preparerades med en Helios NanoLab DualBeam (LMA-INA) för tvärsnittsstudien av EGNITE-provet. Strukturella analyser utfördes med hjälp av TEM med användning av ett Tecnai F20-mikroskop opererat vid 200 kV, inklusive HRTEM och högvinkla ringformiga mörkfälts STEM-tekniker. STEM-EELS-experimentet utfördes i ett Tecnai F20-mikroskop som arbetade vid 200 KeV, med 5 mm bländare, 30 mm kameralängd, en konvergensvinkel på 12.7 mrad och en samlingsvinkel på 87.6 mrad. Eftersom vi använde 0.5 eV per pixel och 250 eV som startenergi vid core-loss acquisition, förvärvade vi inte Si K-kanten som förväntades vid 1,839 2,122 eV, Pt M-edge vid 2,206 100 eV och Au M-edge vid XNUMX XNUMX eV. Den relativa C–O-atomsammansättningen har erhållits genom att fokusera vår uppmärksamhet på det reducerade GO-skiktet och anta att de analyserade kanterna (C och O i vårt fall) summerar till XNUMX %. Detta antagande är giltigt i vårt fall, vilket framgår av Kompletterande information Kartor. Energidifferentialtvärsnittet beräknades med hjälp av Hartree-Slater-modellen och bakgrunden med en effektlåg modell.

Elektrisk konduktivitet

Elektrisk konduktivitetsmätningar utfördes med användning av en Keithley 2400 källmätare i tvåpunktskonfiguration. De uppmätta proverna bestod av EGNITE-filmer på 1 × 1 cm² ovanpå en SiO₂ substrat.

Dataanalys

Röntgendiffraktion, Raman och XPS-data analyserades med Python 3.7-paket (Numpy, Pandas, Scipy, Xrdtools, Lmfit, Rampy, Peakutils, Matplotlib). Avståndet mellan planen beräknades från röntgendiffraktionsmätningarna enligt Snells lag. När data väl hade flyttats till den rumsliga domänen, passades det maximala av topparna. Motsvarande avstånd gav ett medelvärde på avståndet mellan plan. Avvikelser från dessa medelvärden beräknades från den fulla bredden vid halva maximum av de Lorentziska anpassningarna av topparna på den rumsliga domänen. XPS- och Raman-spektroskopimätningar analyserades genom att montera en konvolution av toppar på förväntade platser för motsvarande egenskaper. Konduktivitetsvärdena för GO och EGNITE erhölls genom att montera I-V kurvor uppmätta i elektriska konduktivitetsmätningar enligt Ohms lag. Data är n = 1 för varje mätning.

Flexibel arraytillverkning

Tillverkningen av enheterna visas i tilläggsbilden. 4. Enheter tillverkades på 4 tum Si/SiO₂ (400 μm/1 μm) wafers. Först spinnbelades ett 10 µm tjockt lager av PI (PI-2611, HD MicroSystems) på skivan och bakades i en atmosfär rik på kväve vid 350°C i 30 minuter. Metalliska spår mönstrades med användning av optisk litografi av fotoresisten för bildomvändning (AZ5214, Microchemicals). Elektronstråleförångning användes för att avsätta 20 nm titan och 200 nm guld och lyftning utfördes. Vi använde en EGNITE-film med en tjocklek på cirka 1 μm som en kompromiss mellan elektrokemisk prestanda och arrayflexibilitet. Efter överföring av GO-filmen förångades aluminium e-beam och områden ovanpå de framtida mikroelektroderna definierades genom att använda en negativ fotoresist (nLOF 2070, Microchemicals) och lyfta av. Därefter etsades GO-filmen överallt förutom de framtida mikroelektroderna med användning av en syrereaktiv jonetsning (RIE) i 5 min vid 500  W och de skyddande aluminiumkolonnerna etsades med en utspädd lösning av fosfor- och salpetersyra. Sedan avsattes ett 3 µm tjockt lager av PI-2611 på skivan och gräddades som tidigare beskrivits. PI-2611-öppningar på mikroelektroden definierades sedan med en positiv tjock fotoresist (AZ9260, Microchemicals) som fungerade som en mask för en efterföljande syre-RIE. Senare mönstrades enheterna på PI-skiktet, återigen med användning av AZ9260 fotoresist och RIE. Fotoresistskiktet avlägsnades sedan i aceton och skivan rengjordes i isopropylalkohol och torkades ut. Slutligen drogs anordningarna av från skivan och var redo att placeras i steriliseringspåsar för att hydrotermiskt behandlas vid 134°C i en standardautoklav under 3 timmar.

Mikroelektrod elektrokemisk karakterisering

Elektrokemisk karakterisering av mikroelektroderna utfördes med en Metrohm Autolab PGSTAT128N-potentiostat i 1× PBS (Sigma-Aldrich, P4417) innehållande 10 mM fosfatbuffert, 137 mM NaCl och 2.7 mM Kl och 7.4 mM K-konfiguration och pH-värde av 45093lect vid pH-de. En Ag/AgCl-elektrod (FlexRef, WPI) användes som referens och en platinatråd (Alfa Aesar, XNUMX) användes som motelektrod.

Före prestandautvärderingen pulsades elektroderna med 10,000 1 laddningsbalanserade pulser (15 ms, 100 µA). Exponering av elektroder för kontinuerliga pulserande protokoll fortsatte med 0.9 cykliska voltammetricykler (−0.8 till +50 V) vid XNUMX mV s^-1, 20 repetitioner på 5,000 1 pulser (XNUMX ms) och återbestämning av den öppna kretspotentialen.

Dataanalys

Elektrokemisk karakteriseringsdata analyserades med användning av Python 3.7-paket (Numpy, Pandas, Scipy, Pyeis, Lmfit, Matplotlib). Impedansspektroskopidata anpassades till en likvärdig elektrisk modell bestående av ett motstånd (R) i serie med ett konstantfaselement (CPE). Därifrån approximerades CPE-värdet till en kapacitans och dividerades med mikroelektrodens geometriska area för att erhålla ett ekvivalent värde för gränssnittskapacitansen för EGNITE. Mikroelektrodladdningslagringskapacitans (CSC) beräknades från cykliska voltammetrimätningar genom att integrera de katodiska och anodiska regimerna för den uppmätta strömmen och normalisera med skanningshastigheten. Den katodiska och anodiska laddningslagringskapacitansen (cCSC och aCSC) vid 100 mV skanningshastighet för EGNITE är 45.9 ± 2.4 och 34.6 ± 2.8 mC cm^-2, respektiven = 3). Som rapporterats för annat material⁵⁸, de erhållna CSC:erna beror på skanningshastigheten (tilläggsbild. 5). För att bedöma närvaron av syrereduktionsreaktioner mätte vi CV-vågformen under kvävgasrenad elektrolyt⁵⁹ och observerade inte väsentliga skillnader i vågform (tilläggsbild. 6). Våra resultat tar dock inte helt upp effekten av syrereduktionsreaktioner i laddningsinjektionskapaciteten hos EGNITE och ytterligare arbete måste göras för att korrekt undersöka detta. Mikroelektrodladdningsinjektionskapacitet (CIC) fastställdes genom att bestämma strömpulsamplituden som framkallade en spänningsskillnad (efter avlägsnande av det ohmska fallet) som matchade elektrodens elektrokemiska vattenfönster (−0.9 V för katod och +0.8 V för anodisk kontra Ag/AgCl ) (Kompletterande bild. 17)⁶⁰.

Statistisk analys

Data är medel ± s.d., n = 18 för EIS och n = 3 för kronopotentiometrier. Data för kartan över katodkapacitiv spänningsavvikelse är medelvärdet av de katodiska kapacitiva spänningsavvikelserna för en händelse för varje pulsform av n = 3 elektroder.

Mekanisk stabilitetsutvärdering

Ultraljudsbehandling

EGNITE elektroduppsättningar placerades inuti en bägare fylld med vatten i ett ultraljudsvattenbad (Elmasonic P 180H). Sonikering applicerades vid 37 kHz under 15 min vid 200 W, och följt av ytterligare 15 mins sonikering vid 37 kHz med effekten förhöjd till 300 W. Bilder av elektroder togs före och efter ultraljudsstegen.

Böjningstest

Böjningsuppställningen (fig. 2k) bestod av tre cylindriska stavar; den mellersta (diameter, 700 µm) sänktes ner, vilket gav böjningsvinklar på 131°. Tre flexibla mikroelektroduppsättningar användes för böjningstestet. Varje array innehöll 18 mikroelektroder med 50 µm diameter. Två matriser mättes efter 10 och 20 cykler medan en enhet endast mättes under 10 cykler eftersom den skadades under hantering efter mätning. Böjningstestcykeln bestod av en 10 s lång belastningsapplikation plus 10 s utan belastning. Anordningar karakteriserades elektrokemiskt (EIS och CV) före och efter 10 och 20 böjningscykler.

Epikortikal neural inspelning

Epikortikal implantation

Alla experimentella procedurer utfördes i enlighet med rekommendationerna från Europeiska gemenskapsrådet och fransk lagstiftning för vård och användning av försöksdjur. Protokollen godkändes av Grenobles etiska kommitté (ComEth) och godkändes av det franska ministeriet (nummer 04815.02). Sprague-Dawley-råttor (hane, 4 månader gammal, vägande ~600 g) sövdes intramuskulärt med ketamin (50 mg per kg (kroppsvikt)) och xylazin (10 mg per kg (kroppsvikt)), och fixerades sedan till en stereotaxisk hållare. Att ta bort den temporala skallen exponerade hörselbarken. Dura mater bevarades för att undvika att skada den kortikala vävnaden. Ett hål borrades vid spetsen för att sätta in referenselektroden, och ett andra hål, 7 mm framåt från den första, borrades för att sätta in jordelektroden. Elektroderna var 0.5 mm tjocka stift som användes för integrerade kretsuttag. De placerades för att få elektrisk kontakt med dura mater och fixerades till skallen med tandcement. Vi monterade sedan ytmikroelektrodbandet på hörselbarken som visas i fig. 3b. Venmönstren identifierar hörselbarken, i område 41 av Kriegs råtthjärnkarta. Kortikala signaler förstärktes samtidigt med en förstärkning på 1,000 33 och digitaliserades med en samplingshastighet på 20 kHz. En högtalare 0.25 cm framför en råts öra, kontralateralt till den exponerade cortex, gav akustiska stimuli. De levererade stimulierna övervakades av en 4939 tums mikrofon (Brüel & Kjaer, 20) placerad nära örat och presenterades i ljudtrycksnivå (dB SPL re 80 μPa). Vi undersöker de vertexpositiva (negativa uppåt) medellatenssvaren framkallade av alternerande klick vid 70 dB SPL och tonburststimuli vid 5 dB SPL med frekvenser från 40 till 5 kHz, en stig- och falltid på 200 ms och en varaktighet på XNUMX ms.

Dataanalys

Elektrofysiologiska data analyserades med Python 3.7-paket (Numpy, Pandas, Scipy, Neo, Elephant, Sklearn Matplotlib) och det anpassade biblioteket PhyREC (https://github.com/aguimera/PhyREC). r.m.s. värden beräknades med ett glidfönster på 20 ms vid frekvenser över 200 Hz. Spektrogram beräknades för ett intervall mellan 70 Hz och 1.1 kHz. PSD beräknades över 60 s av kontinuerliga inspelningar. För en given elektroduppsättning beräknades två PSD:er: in vivo (IV) och post-mortem (PM). SNR uttrycks i dB (20 × ln(r.m.s.(IV)/r.m.s.(PM))) och interpoleras för 20 punkter logaritmiskt fördelade mellan 10 Hz och 1 kHz.

Statistisk analys

Epikortiska neurala data presenterade i fig. 3 tas från individuella mätningar på ett enda djur. I fig. 3c, presenteras data från 64 elektroder. I fig. 3d, presenteras data från två valda elektroder. I fig. 3f, beräknas PSD och SNR från 64 EGNITE-elektroder och visas som medel ± s.d. I kompletterande fig. 12c,d mediandata presenteras för 192 EGNITE-elektroder från n = 3 experiment och 60 platinaelektroder från n = 1 experiment.

Intrakortikal neural inspelning

Intrakortikal implantation

Djuren sövdes med en blandning av ketamin/xylazin (75:1, 0.35 µml/28 µg i.p.) och detta tillstånd bibehölls med en inhalationsmask som gav 1.5 % isofluran. Flera mikroskruvar placerades i skallen för att stabilisera implantatet, och den på toppen av lillhjärnan användes som en allmän grund. Sonden implanterades i den prefrontala cortex (koordinater: AP, 1.5 mm; ML, ±0.5 mm; DV, -1.7 mm från bregma). Implantationen utfördes genom att belägga sonden med maltos (se protokollet nedan) för att ge tillfällig sondstyvhet och underlätta insättning av sonden. Sonden förseglades med tandcement. TDT-ZifClip-kontakter användes för att ansluta sonden till det elektrofysiologiska systemet via en miniatyriserad kabel. Efter operationen genomgick musen en återhämtningsperiod på 1 vecka och fick analgesi (buprenorfin) och antiinflammatoriska (meloxikam) behandlingar. Neural aktivitet registrerades med det flerkanaliga Open Ephys-systemet vid en samplingshastighet på 30 kHz med en Intan RHD2132-förstärkare. De auditiva uppgiftsexperimenten utfördes i en ljudisolerad låda, med två högtalare inuti med hjälp av protokoll baserade på tidigare beskrivet arbete⁶¹. Ljudstimulansen bestod av ett 15 ms långt vitt brusklick, upprepat 100 gånger (cykler), var och en separerad med 5 s (interstimulusintervall). Under uppgiften kunde djuret röra sig fritt.

Maltosförstyvningsprotokoll

En vattenlösning av maltos värms upp till glasövergångspunkten (T_g), mellan 130 och 160 °C, med hjälp av en kokplatta eller mikrovågsugn. När maltosen är trögflytande bringas baksidan av sonden endast i kontakt med maltosen. När maltosen svalnar stelnar den och gör sonden styv.

Dataanalys

Neurala signaler från varje elektrod filtrerades offline för att extrahera SUA och LFP. SUA uppskattades genom att filtrera signalen mellan 450 och 6,000 4 Hz och spikarna från individuella neuroner sorterades med hjälp av principal-komponentanalys med Offline Sorter v.1 (Plexon). För att erhålla LFP:er nedsamplades signaler till 50 kHz, detrenderades och notchfiltrerades för att ta bort bruslinjeartefakter (1 Hz och dess övertoner) med specialskrivna skript i Python. AEP SNR beräknades som förhållandet mellan topp N20-amplituden och s.d. av en XNUMX ms period före stimulansen.

Statistisk analys

Data som visas i fig. 3h, jag är medel ± s.d., n = 30 som antalet genomsnittliga försök. Data som registrerats från samma elektrod visas på dagarna 30, 60 och 90. Data från ett enda djur presenteras.

Kronisk epikortikal biokompatibilitet

Kirurgisk implantation av enheter

Totalt 27 vuxna Sprague-Dawley-råttor av hankön användes för denna studie (Charles River). Djuren hölls vid en omgivningstemperatur på 21 ± 2 °C och en luftfuktighet på 40–50 %, i en 12 h ljus/12 m mörk cykel. Råttor inhystes i grupper och gavs fri tillgång till kost och vatten under hela försöksperioden. Experimentella förfaranden utfördes i enlighet med Animal Welfare Act (1998), under godkännande av det brittiska inrikeskontoret och det lokala etiska granskningsorganet för djurskydd (AWERB). Djuren sövdes med isofluran (2–3 %) under operationens varaktighet, och djupet av anestesin övervakades med tåklämreflextestet. Djur placerades i en stereotaxisk ram (Kopf, 900LS), placerad ovanför en termisk filt för att upprätthålla kroppstemperaturen. Ett kraniotomihål (~5 mm ×4 mm) gjordes 1 mm från mittlinjen med hjälp av en tandborr med en 0.9 mm borr, duran avlägsnades och den epikortikala enheten placerades på den kortikala ytan av hjärnan. Kraniotomihålet förseglades med Kwik-sil, följt av dentalt cement för att säkra, och huden syddes stängd. Subkutana injektioner av koksaltlösning (1 ml per kg (kroppsvikt)) och buprenorfin (0.03 mg per kg (kroppsvikt)) gavs för att ersätta förlorad vätska och minska postoperativ smärta, och anestesin avbröts.

Vävnadssamling och bearbetning

Djuren avslutades 2, 6 eller 12 veckor efter implantation med en lämplig metod för den typ av analys som skulle utföras.

Histologi och immunhistokemi

2, 6 eller 12 veckor efter implantation avslutades råttor via hjärtperfusion med hepariniserad (10 U ml^-1Sigma-Aldrich) PBS, följt av 4% paraformaldehyd (PFA, Sigma-Aldrich) i PBS. Hjärnor efterfixerades i 4% PFA i 24 h, överfördes sedan till 30% sackaros i PBS i minst 48 h innan de frystes i isopentan. Hjärnorna lagrades sedan vid -80 °C tills de kryosnittades vid 25 µm. Vävnaden färgades sedan för joniserad kalciumbindande adaptermolekyl 1 (Iba-1) för att bestämma nivån av mikroglialaktivering. Kortfattat blockerades vävnadssektioner med 5% getserum i PBS med 0.1% Triton-X under 1 timme före inkubation över natten vid 4°C med den primära antikroppen anti-Iba-1 (1:1,000 019, 19741-594; Wako). Sektioner färgades sedan med sekundär antikropp, anti-kanin Alexa Fluor 1 (400:11012, A-1; Thermo Fisher) i 4,6 timme vid rumstemperatur. Objektglasen monterades med täckglas med användning av Prolong Gold anti-blekningsmonteringsmedia med 2-diamidino-3-fenylindol (Thermo Fisher). Sonden täckte ett område på 3.7 × XNUMX mm² på den kortikala ytan av hjärnan; vävnadssektioner valda för färgning täckte 3.2 mm i längd av denna region. Objektglasen avbildades med en 3DHistech Pannoramic-250 objektglasskanner vid 20× och bilder analyserades med CaseViewer v.2.4 (3DHistech). För att bedöma mikrogliaaktivering täcktes ett område på 3.2 mm, med en bild analyserad var 100:e µm. Bilder togs med 8.5 × förstoring som detaljerade en sektion av det epikortikala sondstället, 3 mm från hjärnans mittlinje, som omfattar området direkt under sondstället.

Bildbehandling

Mikroskopidata bildbehandlades med hjälp av en algoritm för mikroglia-fenotypkarakterisering (kompletterande fig. 13). Mikroglialaktivering analyserades med en anpassad CellProfiler* (Broad Institute, v.3.1.9 från https://cellprofiler.org/) rörledning. Först användes EnhanceOrSuppressFeatures-modulen för att förbättra filamentösa strukturer som neuriter genom att tillämpa tubeness-förstärkningsmetoden. Från de förbättrade bilderna segmenterades celler med hjälp av modulen IdentifyPrimaryObjects. Preliminära mätningar av cellerna antydde att det lämpliga objektdiameterintervallet var 3–40 pixlar. Föremål utanför detta diameterintervall eller som rörde vid kanten av bilden slängdes. Cellerna segmenterades med hjälp av en tvåklassig Otsu adaptiv tröskelstrategi med en adaptiv fönsterstorlek på 50 pixlar. Objekten som identifierats av IdentifyPrimaryObjects-modulen matades in i modulen MeasureObjectSizeShape för att beräkna de nödvändiga egenskaperna för cellklassificering. I ClassifyObjects-modulen angavs kategorin som klassificeringen skulle baseras på vara AreaShape, och Extent valdes som motsvarande mått. Cellerna klassificerades som 'aktiverad' eller 'icke-aktiverad' baserat på deras Extent-egenskap, vilket är förhållandet mellan arean som upptas av cellen och arean som upptas av dess begränsningsram. Denna klassificeringsmetod rationaliserades av det faktum att aktiverade mikroglia har stora cellkroppar och inga processer, och därmed upptar en mycket större andel av deras begränsningsrutor än deras icke-aktiverade motsvarigheter. Slutligen användes modulerna CalculateMath och ExportToSpreadsheet för att beräkna och mata ut önskad statistik.

Statistisk analys

Datauppsättningar är n = 3 för varje enhetstyp (PI-enbart implantat (PI); PI med exponerat mikrotillverkat guld (guld); och PI med mikrotillverkat guld och EGNITE (EGNITE) vid alla tidpunkter) med undantag för 6 veckors guld som är n = 2 för ELISA-data. Kontralaterala hemisfärer kombinerades vid varje tidpunkt för att ge n = 9 vid 2 och 12 veckor efter implantation och n = 8 vid 6 veckor efter implantation. Analys av data gjordes med hjälp av programvaran GraphPad Prism v.8. Statistisk analys slutfördes med en tvåvägsvariansanalys (ANOVA) med Tukeys multipla jämförelsetest där så var lämpligt; P < 0.05 ansågs vara signifikant.

ELISA

Efter implantationsperioden avslutades djuren genom cervikal dislokation. Hjärnvävnad extraherades från både högra och vänstra hjärnhalvan, snabbfrystes i flytande kväve och lagrades vid -80 °C tills vidare användning. Vävnad lyserades med användning av NP-40-lysbuffert (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, 1% Nonidet P40-ersättning, Fluka, pH justerat till 7.4) innehållande proteas och fosfatasinhibitor (Halt Protease och Phosphatase Inhibitor Fishtail, Thermoocker Fishtail), Thermoocker Fishtail följt av mekanisk störning av vävnaden (TissueLyser LT, Qiagen). Prover centrifugerades sedan i 10 min vid 5,000 4 rpm och supernatanten förvarades vid 740401°C tills vidare användning. LEGENDplex Rat Inflammation Panel (katalognummer 1, BioLegend), ett pärlbaserat multiplex ELISA-kit, kördes för att kvantifiera följande cytokiner; IL-1α, IL-6β, IL-10, IL-12, IL-70p17, IL-18A, IL-33, IL-1, CXCL2 (KC), CCL1 (MCP-15), granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor, interferon-y och tumörnekrosfaktor. Kitet kördes enligt tillverkarens instruktioner, med protein laddat med en fast volym på XNUMX µl. Efter inkubation med supernatant kördes pärlorna på en BD FACSVerse flödescytometer och data analyserades med hjälp av LEGENDplex dataanalysmjukvara.

Neural stimulering

Intrafascikulär implantation

Alla djurförsök godkändes av den etiska kommittén vid Universitat Autònoma de Barcelona i enlighet med EU-rådets direktiv 2010/63/EU. Djuren hölls vid 22 ± 2 °C under en 12 h ljus/12 h mörk cykel med mat och vatten fritt tillgängligt. Ischiasnerven hos sövda Sprague-Dawley-råttor av honkön (250–300 g, ~18  veckor gammal) exponerades kirurgiskt och TIME-elektroderna implanterades transversalt över ischiasnerven med hjälp av en rak nål fäst vid en 10-0 ögle-tråd⁴⁶. Processen övervakades under ett dissektionsmikroskop för att säkerställa den korrekta positionen för de aktiva platserna inuti nervfasciklarna (Fig. 4b). Under experimenten hölls djurets kroppstemperatur med en värmedyna.

Nervstimulering utfördes genom att applicera tåg av tvåfasiska strömpulser med en fast varaktighet på 100 µs per fas och öka amplituden från 0 till 150 µA i steg om 1 eller 3 µA vid 3 Hz under 33 s (Differentator DS4, Stimulatorn DS13) mikroelektroder. Samtidigt registrerades CMAP från GM-, TA- och PL-muskler med hjälp av små nålelektroder (0.4 mm långa, 03 mm diameter, nålelektroder av rostfritt stål A-14-XNUMXBEP, Bionic) placerade i varje muskel⁶². Den aktiva elektroden placerades på muskelbuken och referensen i nivå med senan. Elektromyografiinspelningar förstärktes (×100 för GM och TA, ×1,000 511 för PL; P3AC-förstärkare, Grass), bandpassfiltrerades (3 Hz till 16 kHz) och digitaliserades med ett PowerLab-inspelningssystem (PowerLab20SP, ADInstruments) vid kHzXNUMX .

Dataanalys

Amplituden för varje CMAP mättes från baslinjen till den maximala negativa toppen. Spänningstoppmätningarna normaliserades till den maximala CMAP-amplituden som erhölls för varje muskel i experimentet. Ett selektivitetsindex (SI) beräknades för varje aktiv plats som förhållandet mellan den normaliserade CMAP-amplituden för en muskel, CMAP_i, och summan av de normaliserade CMAP-amplituderna i de tre musklerna, enligt formeln SI_i = nWCPA_i/∑nWCPA_j, vid den minsta stimuleringsströmamplituden som framkallade ett minimalt funktionellt relevant muskelsvar (definierad som minst 5 % CMAP-amplitud för en av musklerna med avseende på den maximala CMAP-amplituden för den muskeln som tidigare hade bestämts). Sedan valdes de aktiva platserna med högsta SI för var och en av de tre musklerna som SI för varje muskel i ett givet experiment.

Kronisk intraneural biokompatibilitet

Efter en tidigare rapporterad procedur^50,63, ischiasnerven hos sövda Sprague-Dawley honråttor (250-300 g, ~18 veckor gammal) exponerades och enheterna för biokompatibilitet in vivo med och utan EGNITE implanterades longitudinellt i ischiasnervens tibiala gren (n = 6–8 per grupp). Kortfattat, nerven genomborras vid trifurkationen med en rak nål fäst vid en 10-0 ögletråd (STC-6, Ethicon); tråden drar den pilformade spetsen på den böjda elektrodremsan. Spetsen skärs för att ta bort tråden, och spetsarna på varje arm är lätt böjda för att undvika att enheten dras tillbaka. Ett longitudinellt implantat valdes eftersom det möjliggör en bättre studie av främmande kroppssvar inuti nerven⁵⁰.

Nerv- och djurfunktionsbedömning

Djuren utvärderades under uppföljande postimplantation med hjälp av nervlednings-, algesimetri- och gångvägstester⁶². För ledningstester stimulerades ischiasnerven hos de implanterade och kontralaterala tassarna av nålelektroder vid ischiasskåran och CMAP för PL-muskeln registrerades enligt ovan. Latensen och amplituden för CMAP mättes. För algesimetritestet placerades råttor på en trådnätsplattform och en mekanisk icke-skadelig stimulans applicerades med en metallspets ansluten till en elektronisk Von Frey-algesimeter (Bioseb). Den nociceptiva tröskeln (kraft i gram vid vilken djuren drog ut tassen) för implanterade kontralaterala tassar mättes. För gångspårstestet målades baktassarnas plantaryta med svart bläck och varje råtta fick gå längs en korridor. Fotavtrycken samlades in och ischias funktionsindex beräknades⁶².

Histologi

Efter 2 eller 8 veckor perfuserades djuren med PFA (4%) och ischiasnerverna skördades, efterfixerades, kryokonserverades och bearbetades för histologisk analys. För utvärdering av FBR skars ischiasnerver i 15 μm tjocka tvärsnitt med en kryostat (Leica CM190). Prover färgades med primära antikroppar för myeliniserade axoner (anti-RT97 för att märka Neurofilament 200K, 1:200; Developmental Studies Hybridoma Bank) och makrofager (anti-Iba-1, 1:500; Wako). Sedan inkuberades sektioner i 1 timme vid rumstemperatur med sekundära antikroppar åsna-anti-mus Alexa Fluor 488 och åsna anti-kanin Alexa Fluor 555 (1:200, Invitrogen). Representativa sektioner från den centrala delen av implantatet i skenbensnerven valdes, bilder tagna med ett epifluorescensmikroskop (Eclipse Ni, Nikon) fäst till en digitalkamera (DS-Ri2, Nikon) och bildanalys utfördes med ImageJ-mjukvara (National Institutes av hälsa). Mängden Iba-1-positiva celler i hela området av tibialnerven kvantifierades och tjockleken på vävnadskapseln mättes som medelavståndet från varje sida av implantatet till de närmaste axonerna.

Statistisk analys

För statistisk analys av data använde vi en- eller tvåvägs ANOVA följt av Bonferroni post hoc-test för skillnader mellan grupper eller tider. GraphPad Prism programvara användes för grafisk representation och analys. Statistisk signifikans beaktades när P <0.05.

Rapporteringsöversikt

Ytterligare information om forskningsdesign finns i Sammanfattning av naturportföljrapportering länkad till den här artikeln.

• SEO-drivet innehåll och PR-distribution. Bli förstärkt idag.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. Styrka dig själv. Tillgång här.
• PlatoAiStream. Web3 Intelligence. Kunskap förstärkt. Tillgång här.
• Platoesg. Kol, CleanTech, Energi, Miljö, Sol, Avfallshantering. Tillgång här.
• PlatoHealth. Biotech och kliniska prövningar Intelligence. Tillgång här.
• Källa: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01570-5