Preparação de nanofolhas CIPS

O material CIPS a granel foi sintetizado por reação no estado sólido de acordo com um procedimento publicado anteriormente⁴³. Nanofolhas CIPS foram esfoliadas a partir de cristais CIPS em massa por intercalação de Li usando n-butillítio assistido por ultrassonicação. Após a esfoliação, as nanofolhas foram centrifugadas a 1,500g por 20 minutos e depois enxaguado duas vezes com etanol para remover n-butil-lítio na suspensão. A suspensão coletada foi finalmente liofilizada e armazenada em condições secas a -20 °C.

Análise MS da ligação RBD – CIPS

Preparação de amostras e análise de MS

A proteína RBD (40 μl, 0.5 mg ml^-1 dissolvido em PBS) foi misturado com 40 μl de CIPS (1 mg ml^-1 dissolvido em PBS) em um tubo de centrífuga, o volume final foi levado a 200 μl com PBS e a mistura incubada a 37 ° C por 40 min. Posteriormente, foi realizada a marcação isotópica em duas etapas das proteínas nativas. NaCNBD₃ (1.5 μl a 50 μg μl^-1) e ¹³CD₂O (1.5 μl a 2% em peso) foi adicionado às amostras para marcação de proteína ativa, incubadas a 25 ° C por 5 min, misturadas com 5 M NH₄OAc (1 μl) e liofilizado. Na segunda etapa do processo de rotulagem, cada amostra foi redissolvida em 90 μl de solução desnaturante (cloridrato de guanidina 6 M (GUA) – HEPES 50 mM, pH 7.4). Em seguida, 10 μl de piridina-borano 0.4 M e 1 μl de CH 4%₂O foram adicionados a cada amostra, que foram então mantidas a 37 ° C por 2 h para completar a dimetilação dos resíduos de lisina. A reação de marcação foi extinta pela adição de 1 μl de NH 5 M₄OAc. Em seguida, a proteína foi extraída e hidrolisada com protease. Após a reação, cada amostra foi misturada com 200 μl de amônia a 10%, incubada a 37°C por 5 min e centrifugada a 23,000g a 4 °C por 20 min para remover CIPS. O sistema tampão de proteína foi trocado por solução tampão 6 M GUA – 50 mM HEPES por ultrafiltração com unidades de ultrafiltração centrífuga com um corte de peso molecular nominal de 3K. As proteínas foram então reduzidas com cloridrato de tris (5-carboxietil) fosfina 2 mM (TCEP) e sequencialmente alquiladas com iodoacetamida 10 mM (IAA). O sistema tampão foi novamente trocado por NH 20 mM₄HCO₃ por ultrafiltração centrífuga. Finalmente, as proteínas foram hidrolisadas enzimaticamente com quimotripsina durante 16 h a 37 ° C numa proporção substrato / enzima de 1:25 (peso / peso). Após hidrólise enzimática, as amostras de peptídeos foram acidificadas com ácido trifluoroacético (TFA) a 10%, liofilizadas e armazenadas a 80 ° C até a análise.

A análise LC-MS foi realizada utilizando um espectrômetro de massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid acoplado a um sistema Vanquish Flex HPLC (ThermoFisher Scientific). Resumidamente, 1 μg de amostra de peptídeo foi primeiro carregado em uma coluna de armadilha C5 de 150 cm x 18 μm com partículas C3 de 18 μm e separada em uma coluna capilar C25 de 150 cm x 18 μm com partículas C2.4 de 18 μm. A fase móvel deste sistema HPLC de fase reversa é composta pela fase móvel A (0.1% de ácido fórmico (FA) em solução aquosa) e pela fase móvel B (0.1% de FA em acetonitrila). O gradiente de separação binária de fase reversa foi definido como 0:100–5:95 (B:A, v:v) por 2 min, 5:95–35:65 (B:A, v:v) por 45 min, 35:65–80:20 (B:A, v:v) por 3 min e, após lavagem com 80:20 (B:A, v:v) por 5 min, o sistema foi equilibrado com 100% de fase móvel A por 15 minutos.

A análise dos dados

Um banco de dados de sequências de proteínas RBD foi baixado do UniProt (http://www.uniprot.org). Maxquant v.1.6.7, (https://www.maxquant.org) foi usado para pesquisar neste banco de dados os dados coletados do MS. A multiplicidade de quantificação foi definida como 5 e DimetilLys0, DimetilLys4A e DimetilLys8 foram selecionados. A quimotripsina foi selecionada com uma clivagem perdida máxima de 5. A função de correspondência entre execuções foi habilitada. Os demais parâmetros foram definidos como valores padrão. A eficiência de rotulagem nativa (N_LE) os valores podem ser calculados a partir de N_LE = 1 − I_L/(I_H + I_M + I_L), Onde I_H, I_M e I_L são a intensidade das formas peptídicas marcadas pesadas, médias e leves contendo os resíduos de lisina correspondentes, respectivamente.

A estrutura RBD foi adotada do arquivo PDB 7CZR. Com base nos resultados experimentais de reatividade da lisina, a exibição de proteínas e a análise estrutural foram realizadas pelo PyMOL v.1.9 (https://pymol.org/2).

Efeitos do CIPS na infecção de células Vero-E6 por SARS-CoV-2 e seus VOCs

Os experimentos foram realizados em um laboratório de nível 3 de biossegurança com regulamentação padrão. SARS-CoV-2 (GDPCC-nCOV-8) e quatro VOCs (Alpha (GDPCC2.00304), Beta (GDPCC2.00004), Delta (GDPCC2.00096) e Omicron (GDPCC2.00297)) foram isolados e digitados no laboratório do Centro de Coleta de Culturas de Patógenos Humanos de Guangdong (GDPCC) e propagado em células Vero-E6.

Para os experimentos de infecção, as células Vero-E6 foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 2 x 10⁴ células por poço e cultivadas durante a noite. CIPS em várias concentrações (1.5–96 pM) e SARS-CoV-2 ou VOCs (dose infecciosa de cultura de tecidos de 50% (TCID₅₀) = 100) foram adicionados em conjunto às células Vero-E6 e incubados durante 2 h. As células foram então lavadas duas vezes com 1x PBS quente e cultivadas durante mais 48 h com meio de cultura celular fresco (DMEM com 1% de penicilina / estreptomicina e 10% de soro bovino fetal) ou meio contendo CIPS. Células não infectadas e apenas CIPS foram utilizadas como controle. Os sobrenadantes foram coletados após 48 h, e o SARS-CoV-2 foi analisado quantitativamente por rtPCR usando um kit comercial de detecção de COVID-19 (nº de catálogo DA0931, DaAn Gene), visando a proteína do nucleocapsídeo e o quadro de leitura aberto 1ab (ORF1ab). Em resumo, a proteína nucleocapsídeo e ORF1ab foram detectadas utilizando sondas TaqMan marcadas com FAM e VIC (Applied Biosystems 7500, ThermoFisher Scientific). A amplificação foi realizada da seguinte forma: 50 °C por 15 min, 95 °C por 15 min, seguido de 45 ciclos de 94 °C por 15 s e 55 °C por 45 s. Para avaliação quantitativa, foram utilizados padrões plasmídicos para estabelecer uma curva padrão por diluição seriada (número de cópias versus valor fluorométrico), que foi utilizada para calcular o número de cópias do RNA do SARS-CoV-2 a partir do valor fluorométrico das amostras. A curva padrão é descrita por (y = 50 vezes 10^{(12.352 ;-; 0.2771 ;vezes; C_{mathrm{T}})}). A taxa de infecção foi calculada e normalizada para controles de infecção por vírus. A condição das células Vero-E6 após a infecção por SARS-CoV-2 foi observada às 48 horas e foram adquiridas imagens de microscopia óptica. O espaço ocupado das células foi analisado pelo ImageJ e os dados são dados como uma porcentagem da área coberta pelas células, como uma estimativa de células saudáveis ​​intactas na imagem.

Para os experimentos que avaliam os efeitos pós-infecção do CIPS, as células Vero-E6 foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 2 x 10⁵ células por poço e cultivadas durante a noite. As células foram desafiadas com SARS-CoV-2 (50 TCID₅₀) por 2 h e depois lavado com PBS para remover o vírus não internalizado. As células foram então cultivadas em meio fresco ou meio contendo CIPS em várias concentrações (24, 48 e 96 pM) durante 48 h. As células foram coletadas e lisadas com RNAplus (Takara Bio). O SARS-CoV-2 intracelular foi avaliado por qPCR para a proteína S. O celular 18S foi usado como controle de limpeza.

A janela de tratamento para CIPS foi determinada in vitro adicionando CIPS ao meio de cultura em momentos diferentes após o desafio com SARS-CoV-2. Células Vero-E6 foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 2 x 10⁵ células por poço, cultivadas durante a noite e depois desafiadas com SARS-CoV-2 (50 TCID₅₀). O meio contendo vírus foi descartado após 2 h e as células infectadas foram lavadas duas vezes com PBS para remover o vírus livre. Meio fresco foi adicionado e a cultura continuou até 48 h. O desafio com vírus foi considerado o tempo 0. CIPS (12h) foi adicionado nos tempos 0 ou 2, 4 e 24 horas após o desafio viral. Nenhum tratamento CIPS serviu como controle. Após 48 h, o meio de cultura foi coletado e o RNA viral foi extraído utilizando um kit High Pure Viral RNA (Roche) e quantificado por rtPCR (QRZ-101, TOYOBO).

Efeitos do CIPS na infecção por SARS-CoV-2 em culturas de tecidos epiteliais das vias aéreas humanas

Um inóculo SARS-CoV-2 de 2 × 10⁴ TCID₅₀ em 50 μl do mesmo meio usado para a cultura organoide foi adicionado a uma única inserção transwell contendo tecido epitelial das vias aéreas colocada nos poços de uma placa de 24 poços de fundo redondo na ausência ou presença de CIPS 24 pM e incubada a 37°C por 1 hora. O inóculo foi removido e as inserções contendo tecido foram lavadas três vezes com PBS para remover o vírus não ligado. Cada inserção contendo tecido infectado por vírus foi transferida para um único poço de uma nova placa de 24 poços (Corning) com 500 μl de meio de crescimento fresco sem soro (cat. No. 05001, STEMCELL Technologies) ou meio contendo CIPS, e incubados a 37 °C com 5% de CO₂ por 24 horas. A extração de RNA foi realizada após a adição de 150 μl de Trizol (Qiagen) à cultura de células epiteliais. O RNA viral nas amostras coletadas foi determinado por qPCR com transcrição reversa (RT – qPCR) usando um kit de diagnóstico SARS-CoV-2 (cat. nº 2C-HX-201-2, BioGerm; aprovado pelo China Center for Disease Controle e Prevenção) seguindo o protocolo do fabricante. Para examinar as alterações histológicas causadas pela infecção por SARS-CoV-2 e pelo tratamento com CIPS, os epitélios embebidos em parafina foram seccionados com uma espessura de 3 μm e examinados após coloração com H&E. A imunofluorescência foi realizada com mAb de rato anti-acetil-α-tubulina (Lys40) (cat. no. 6-11B-1) e mAb de coelho anti-MUC5AC (cat. no. E3O9I) da Cell Signaling Technology.

Efeitos do CIPS na infecção por SARS-CoV-2 de camundongos transgênicos hACE2 in vivo

Camundongos transgênicos hACE2 machos com seis a oito semanas de idade foram adquiridos da Gempharmatech (B6JGpt-Ace2^{em1Cin(hACE2-stop)}/Gpt, gato. não. T037630). O SARS-CoV-2 (número de acesso do National Microbiology Data Center: NMDCN0000HUI, https://nmdc.cn/resource/ncov/genome/detail/NMDCN0000HUI) utilizado para avaliação in vivo foi gentilmente cedido pelo Centro Provincial de Controle e Prevenção de Doenças de Guangdong, província de Guangdong, na China. O desafio SARS-CoV-2 foi realizado em uma instalação de nível 3 de biossegurança animal no Instituto de Zoologia de Kunming, Academia Chinesa de Ciências (CAS). Este experimento animal foi realizado de acordo com as recomendações detalhadas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto de Zoologia de Kunming, CAS, com aprovação ID IACUC-RE-2021-05-001 dos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais do Instituto de Zoologia de Kunming, CAS. Três ratos por grupo foram empregados nas experiências seguintes.

Os ratos foram desafiados com SARS-CoV-2 e CIPS por instilação intranasal (in). O desafio viral (5 × 10⁶ TCID₅₀ por rato) foi administrado em duas administrações de 30 μl com 20 minutos de intervalo para reduzir o desconforto do animal e aumentar a absorção. CIPS (4 e 8 mg por kg de peso corporal, correspondendo a 2.4 e 4.8 pmol por kg de peso corporal) foi administrado com a primeira dose viral. Após 3 dias, os ratos foram sacrificados.

Um segundo experimento foi realizado para comparar o tratamento terapêutico e profilático com CIPS. Os ratos foram desafiados com SARS-CoV-2 (1 × 10⁶ TCID₅₀ por camundongo, 30 μl) e CIPS (8 mg por kg de peso corporal, correspondendo a 4.8 pmol por kg de peso corporal) foi administrado 1 h antes (profilático) ou após (terapêutico) infecção viral. Após 3 dias, os ratos foram sacrificados.

O RNA foi extraído dos pulmões usando RNAiso PLUS (Takara) de acordo com o protocolo do fabricante. O RNA do SARS-CoV-2 no pulmão foi medido por RT-qPCR conforme relatado anteriormente⁴⁴. Os resultados são expressos como o número de cópias de RNA do SARS-CoV-2 por micrograma de RNA total do pulmão. A curva padrão para o cálculo do RNA é descrita por (y = 0.87 vezes 10^{2.3026 ;vezes; (-0.3297 ;vezes; C_{mathrm{T}};+; 12.822)}). Para avaliar a presença de alterações patológicas, o tecido pulmonar foi examinado por observação microscópica de cortes histológicos corados com H&E. A análise de imunofluorescência foi realizada por coloração com anticorpos para F4/80 (GB11027, Servicebio Technology) para macrófagos e contra SARS-CoV-2 spike S1 (ABclonal) para SARS-CoV-2. A colocalização do SARS-CoV-2 com macrófagos no tecido pulmonar após tratamento com CIPS foi analisada por microscopia (VS200, Olympus).

Associação do SARS-CoV-2 ao CIPS

SARS-CoV-2 (1.2 × 10⁴ TCID₅₀) foi incubado com CIPS (6h e 12h em 200 μl de PBS) por 1 h. As amostras foram centrifugadas (1,000g por 5 min) para coletar SARS-CoV-2 preso por CIPS em precipitados. Após a extração do RNA, a presença do SARS-CoV-2 foi analisada quantitativamente por rtPCR para a proteína S.

Determinação da estrutura secundária de proteínas por CD

A estrutura secundária do RBD na ausência ou presença de CIPS foi avaliada por CD (J-810, JASCO). O RBD (200 μg.ml^-1 em tampão fosfato 0.01 M, pH 7.4) foi misturado com CIPS (15, 30 e 60 pM) e depois adicionado à cubeta com espessura de 1 mm. Os espectros de CD foram coletados entre 190 e 250 nm. Cada amostra foi medida seis vezes e os espectros foram calculados. Os dados espectrais foram processados ​​utilizando o software CD Tool (http://cdtools.cryst.bbk.ac.uk). A linha de base (entre 235 e 250 nm) foi subtraída. Os dados normalizados foram analisados ​​usando DICROWEB para calcular a percentagem de estrutura secundária, e os dados suavizados são mostrados.

Efeitos do CIPS na interação SC2-P com macrófagos

Células da linha celular de leucemia monocítica aguda humana THP-1 foram semeadas em placas de 24 poços com uma lâmina de cobertura a 5 × 10⁴ células por poço (para absorção/degradação) ou em placas de 96 poços a 1 × 10⁴ células por poço (para infecção) e tratadas com 100 ng ml^-1 PMA por 24 h para induzir a diferenciação de macrófagos.

Para os experimentos de absorção/degradação, SC2-P (4 × 10⁶ cópias) foi pré-incubado com CIPS (12h) por 2 h e depois adicionado aos macrófagos por 24 h (período de captação). O meio contendo SC2-P foi então substituído por meio fresco e a cultura continuou por mais 24 horas (período de degradação). O inibidor lisossomal BM (100 nM; MedChemExpress) foi adicionado aos macrófagos 6 h antes do final da cultura. A captação e degradação de SC2-P foram detectadas por imunofluorescência, e a colocalização de SC2-P e lisossomos foi avaliada por imunofluorescência. O lisossoma e o SC2-P foram corados com anticorpos para LAMP-1 (cat. No. NBP2-52721, Novus Biologicals) e anti-Flag (cat. No. AF0036, Beyotime Biotechnology), respectivamente.

Para os experimentos de infecção, os macrófagos foram cultivados com SC2-P (2 × 10⁵ cópias) por 24 h na ausência ou presença de CIPS (24 pM) e depois lavadas com PBS para remover o vírus extracelular. As células foram cultivadas com meio fresco por mais 24 horas. BM (100 nM) foi adicionado às 18 h. As células foram então lisadas para avaliação da luciferase (cat. No. E1910, Promega).

Efeitos do CIPS na interação do SARS-CoV-2 com macrófagos

Os experimentos foram realizados em um laboratório de nível 3 de biossegurança com regulamentação padrão. A diferenciação de células THP-1 em macrófagos foi realizada conforme descrito acima em placas de 24 poços com 2 x 10⁵ células por poço.

Para os experimentos de absorção/degradação, SARS-CoV-2 (2.4 × 10⁴ TCID₅₀) foi adicionado aos macrófagos por 4 h (período de absorção). As células foram então lavadas duas vezes com PBS quente e cultivadas durante mais 48 horas com meio fresco (período de degradação). O RNA foi extraído dos macrófagos com RNAplus, e o SARS-CoV-2 intracelular foi avaliado quantitativamente por rtPCR para a proteína S.

O efeito CIPS foi avaliado pela pré-incubação do vírus SARS-CoV-2 autêntico (2.4 × 10⁴ TCID₅₀) com CIPS (12h) por 2 h e depois adicionando o vírus (com ou sem pré-tratamento com CIPS) a macrófagos em cultura por 48 h na ausência ou presença de BM (100 nM). Os macrófagos foram lavados duas vezes com PBS antes da extração do RNA e avaliação quantitativa do SARS-CoV-2.

Para os experimentos de infecção, o CIPS (12h) foi pré-incubado com vírus SARS-CoV-2 autêntico (2.4 × 10⁴ TCID₅₀) por 2h. Os macrófagos foram expostos ao SARS-CoV-2 (pré-incubados ou não com CIPS conforme descrito acima) por 4 h, lavados duas vezes com PBS e cultivados em meio fresco com ou sem BM (100 nM) por mais 48 h. Os sobrenadantes foram coletados e a presença de SARS-CoV-2 foi analisada quantitativamente por rtPCR utilizando um kit comercial de detecção de COVID-19 (DaAn Gene), visando a proteína do nucleocapsídeo e ORF1ab.

Estruturas proteicas usadas em simulações MD

As estruturas dos complexos formados entre ACE2 e o RBD do SARS-CoV-2 (Protein Data Bank (PDB) ID: 6M17)⁴⁵, o Alpha VOC (ID do PDB: 7EKF)⁴⁶, Delta VOC (ID do PDB: 7WBQ)⁴⁷, Beta VOC (ID do PDB: 7EKG)⁴⁶, Omicron VOC (ID do PDB: 7WBP)⁴⁷ e o pico SARS-CoV-2 complexado com o anticorpo monoclonal neutralizante P5A-1B8_2B (PDB ID: 7CZR)⁴⁸ foram obtidos do Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDB (www.rcsb.org). As estruturas cristalinas dos complexos RBD com ACE2 aparecem nas figuras a seguir: 6M17 nas Figs. 3h, 4a e 6, Figs. Suplementares. 11 e 13e Dados Estendidos Figs. 4 e 5; 7EKF na Fig. 4a e Dados Estendidos Fig. 5; 7WBQ na Fig. 4a e Dados Estendidos Fig. 5; 7EKG e 7EKC na Fig. 4a e Dados Estendidos Fig. 5; 7WBP na Fig. 4a e Dados Estendidos Figs. 5 e 6.

Análise estatística

Os resultados são apresentados como valores médios de experiências replicadas ou amostras replicadas numa experiência representativa, conforme indicado nas legendas das figuras. A significância estatística foi calculada pelo teste bicaudal de Student t-teste para comparações de dois grupos e por ANOVA uni ou bidirecional com teste de comparações múltiplas de Tukey ou Sidak. A análise estatística foi realizada utilizando GraphPad Prism e P < 0.05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resumo de relatórios

Mais informações sobre projeto de pesquisa estão disponíveis no site Resumo de Relatórios de Pesquisa sobre Natureza vinculado a este artigo.