Preparação de NPs Mel-PLGA

O método de nanoprecipitação-volatilização de solvente em uma etapa foi utilizado para a síntese de NPs de Mel-PLGA²⁶. Vinte mg de PLGA (P2191, lactido:glicólido (50:50), peso molecular 30,000-60,000, Sigma Aldrich, EUA) foram dissolvidos em acetona (um ml); e dois mg de Mel (73-31-4, peso molecular 232.28, Sigma Aldrich, EUA) foram adicionados seguidos de meia hora de centrifugação para formar a fase orgânica [2% (p/v)]. A fase orgânica formada foi injetada em HXNUMX destilado₂O com agitação contínua por meia hora; seguido de evaporação da acetona (a 37°C sob vácuo).

Caracterização de NPs Mel-PLGA

Os NPs de Mel-PLGA produzidos foram obtidos por liofilização e armazenados a 4°C. A forma das nanopartículas preparadas foi observada por microscópio eletrônico de transmissão (TEM). Malvern.

O dispositivo Zetasizer foi utilizado para determinar o tamanho e o potencial zeta das nanopartículas.

Eficiência de encapsulamento (EE%) e carga de medicamento (DL%) de NPs de Mel-PLGA²⁶

A quantidade de Mel em NPs de Mel-PLGA foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Onde, NPs de Mel-PLGA foram dissolvidos em acetona seguido de ultrassom para liberar o Mel encapsulado. A solução foi centrifugada a 3000 rpm durante vinte minutos para precipitar o PLGA. O Mel dissolvido no sobrenadante representou a massa encapsulada em NPs. A libertação de Mel de NPs de Mel-PLGA foi determinada diluindo um ml de NPs com nove ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7.4); seguido de incubação a 37°C em shaker. Nos tempos 0, 20, 40, 60, 80 e 100 h, 300 µl da solução foram removidos (substituídos pelo mesmo volume por PBS) e centrifugados a 3000 rpm por 30 min. O EE% e DL% foram calculados pelas seguintes equações:

Efeitos in vitro de NPs de Mel-PLGA

Efeito antioxidante in vitro de NPs de Mel-PLGA ²⁷

A capacidade antioxidante dos NPs de Mel-PLGA preparados foi avaliada a partir de seus efeitos de eliminação de radicais livres via 1, 1-difenil-2-picril hidrazil [DPPH (281,689, Sigma Aldrich, EUA)]. Simplesmente, diferentes concentrações de NPs (de 3.9 a 1000 μg/ml) foram misturadas com um ml de solução de DPPH/etanol (0.1 mM), agitadas e deixadas em repouso por 30 min a 25°C. A absorvância foi medida a 517 nm utilizando ácido ascórbico como substância de referência. Atividade de eliminação de DPPH% = [(A₀-UMA₁)/UMA₀]× 100. A absorbância da amostra foi A₁, enquanto a absorbância da reação de controle foi A₀.

Efeito de citotoxicidade in vitro de NPs de Mel-PLGA

A segurança do uso de NPs de Mel-PLGA foi examinada, in vitro, antes de ser utilizada in vivo. Células Caco2 (Sigma Aldrich, EUA) foram cultivadas, a 37 °C em 5% de CO2 e umidade relativa de 95%, em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com NaHCO₃ (2.2 g/l), d-glicose (4.5 g/l), 1% de aminoácidos não essenciais, 10% de soro fetal bovino, 100 UI/ml de penicilina e 0.1 mg/ml de estreptomicina (todos os materiais utilizados no processo de cultura foram adquiridos da Sigma Aldrich, EUA). Os ensaios de citotoxicidade in vitro foram realizados de acordo com Alaa et al.²⁸. 100 µl/poço de 10⁵ As células Caco2 em placas de cultura de tecidos foram incubadas a 37 ° C durante 24 h para permitir o desenvolvimento de monocamadas celulares. Após decantação do meio, utilizou-se um meio de lavagem para lavar as monocamadas. Concentrações graduadas de NPs de Mel-PLGA foram produzidas combinando NPs com meio RPMI. A diluição de NPs produzida foi diluída para 0.1 ml, adicionada aos poços e depois deixada em repouso por mais 24 horas. Os poços receberam 20 µl de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2-5-difeniltetrazólio) na concentração de 5 mg/ml. As placas foram agitadas durante cinco minutos para garantir a mistura do MTT e depois incubadas durante quatro horas a 37°C com 5% de CO₂. Para dissolver o formazan desenvolvido, 200 µl de dimetilsulfóxido (DMSO) foram aplicados nas placas. A 560 nm, foi medida a absorvância (que estava directamente ligada ao formazan).

Efeito de coagulação in vitro de NPs de Mel-PLGA²⁹

A atividade de coagulação dos NPs de Mel-PLGA preparados foi testada para prever o seu efeito quando administrado in vivo. A atividade anticoagulante dos NPs de Mel-PLGA foi avaliada medindo o tempo de coagulação em segundos a 37°C, com heparina servindo como controle. De acordo com as recomendações do fabricante, foram utilizados reagentes de tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina parcial (PTT) (pré-incubados a 37°C por 5 min). Resumidamente, foram combinados plasma de rato (900 μl) e várias concentrações de NPs de Mel-PLGA (100 μl) ou heparina dissolvida em solução salina. O teste foi concluído três vezes e o tempo de coagulação foi registrado.

Efeito antiinflamatório in vitro (inibição da hemólise) de NPs de Mel-PLGA

O efeito antiinflamatório das NPs de Mel-PLGA foi determinado pelo teste de inibição da hemólise de acordo com Anosike et al.³⁰. Sangue heparinizado de rato fresco (5 ml) foi centrifugado a 2500 rpm durante 15 min; depois disso, o pellet resultante foi dissolvido com tampão isotônico (que equivalia ao volume do sobrenadante). Diferentes doses de NPs de Mel-PLGA (de 100 a 1000 μg/ml) foram combinadas com 5 ml de água destilada para criar uma solução hipotônica. As mesmas dosagens de NPs foram combinadas com solução isotônica (5 ml); e indometacina foi empregada como controle. As soluções NPs e controle receberam 0.1 ml da suspensão de eritrócitos produzida, que foi então incubada por uma hora a 37 ° C antes de ser centrifugada por três minutos a 1500 rpm. Um espectrofotômetro foi utilizado para quantificar a hemoglobina liberada no sobrenadante a 540 nm, e a porcentagem de inibição da hemólise foi estimada usando a fórmula: inibição da hemólise (%) = 1−[(OD_b−OD_a)/(OD_c−OD_a)]× 100. DE_a significava absorbância da amostra em uma solução isotônica, OD_b para absorbância da amostra em solução hipotônica e OD_c para controle de absorbância em solução hipotônica.

Animais e desenho experimental

Ratos Sprague Dawley machos, pesando 200 g e oito semanas de idade, foram adquiridos no biotério da Organização Nacional para Controle e Pesquisa de Drogas (Cairo, Egito). Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes internacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório e cumpriram as diretrizes da ARRIVE. Duas doses de NPs de Mel-PLGA (5 e 10 mg/kg) foram examinadas in vivo para testar a eficácia das NPs no tratamento de lesão hepática induzida por CCL4; e também, para encontrar a dose terapêutica necessária. Além disso, duas doses de Mel livre (5 e 10 mg/kg) foram utilizadas nos subgrupos experimentais e comparadas aos subgrupos administrados de NPs de Mel-PLGA para comprovar o sucesso dos NPs de Mel-PLGA preparados na redução da quantidade de Mel administrado. Subgrupos de controle saudáveis ​​foram concebidos como subgrupos com lesão hepática induzida por CCL4 para obter uma comparação crítica e análise estatística. Para tanto, os animais foram divididos em dois grupos, hígidos (H) e com lesão hepática CCL4 (I); cada grupo foi dividido em cinco subgrupos (cinco ratos/subgrupo):

• Grupo saudável (H):

  H controle GI: ratos de controle saudáveis ​​negativos.

  H Mel (5 mg/kg) GII: ratos controle saudáveis ​​que receberam 5 mg/kg de Mel.

  H Mel (10 mg/kg) GIII: ratos controle saudáveis ​​que receberam 10 mg/kg de Mel.

  NPs de H Mel-PLGA (5 mg/kg) GIV: ratos controle saudáveis ​​que receberam 5 mg/kg de NPs de Mel-PLGA.

  NPs de H Mel-PLGA (10 mg/kg) GV: ratos controle saudáveis ​​que receberam 10 mg/kg de NPs de Mel-PLGA.

• Grupo CCL4 com lesão hepática (I):

  Eu controlo o GI não tratado: ratos não tratados com lesão hepática induzida por CCL4 (controle positivo).

  I Mel (5 mg/kg) GII: ratos com lesão hepática induzida por CCL4 tratados com 5 mg/kg de Mel.

  I Mel (10 mg/kg) GIII: ratos com lesão hepática induzida por CCL4 tratados com 10 mg/kg de Mel.

  I Mel-PLGA NPs (5 mg/kg) GIV: ratos com lesão hepática induzida por CCL4 tratados com 5 mg/kg de NPs de Mel-PLGA.

  I Mel-PLGA NPs (10 mg/kg) GV: ratos com lesão hepática induzida por CCL4 tratados com 10 mg/kg de NPs de Mel-PLGA.

Além do grupo veículo (GV) composto por ratos saudáveis ​​que receberam 0.1 ml de azeite por injeção intraperitoneal (ip) duas vezes/semana durante todo o período experimental. O CCL4 foi dissolvido em azeite e administrado na dose de 0.5 mg/kg por via ip duas vezes/semana durante quatro semanas sucessivas. Após a indução da lesão hepática, os NPs Mel ou Mel-PLGA foram administrados por via ip diariamente durante mais quatro semanas (nota: os ratos continuaram a receber doses de CCL4 durante o tratamento) (Fig. 1).

Linha do tempo experimental.

Imagem em tamanho real

Ao final do experimento, os ratos foram anestesiados terminalmente com 50 mg/kg de pentobarbital sódico³¹. Amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca. Após permitir a coagulação do sangue em temperatura ambiente, o soro foi coletado após centrifugação a 1500 rpm por 15 min e dividido em alíquotas para serem mantidas a -20°C. Ratos, de todos os grupos experimentais, foram dissecados para coleta de órgãos (fígado). Resumidamente, o rato foi colocado de costas na bandeja de dissecação e seus membros foram fixados com o auxílio de uma fita adesiva. A pele do rato foi cortada para expor os músculos subjacentes. A parede abdominal foi removida e o fígado foi removido cuidadosamente. Amostras de fígado (um g), de todos os grupos experimentais, foram homogeneizadas usando tampão Tris-HCl frio para preparar homogeneizado de fígado (10%).

Análise bioquímica em amostras de soro

Os parâmetros da função hepática foram medidos para avaliar o efeito hepatoprotetor dos NPs de Mel-PLGA. Os níveis de aspartato aminotransferase (AST), alanina transaminase (ALT), albumina (ab234579, ab263883, ab108789, abcam, EUA) e bilirrubina total (MBS9389057, MyBiosource, EUA) foram medidos por kits ELISA de ratos de acordo com Farid et al.²⁷.

Marcadores de estresse oxidativo em homogeneizados de tecido hepático:

O efeito antioxidante das NPs preparadas foi determinado, in vivo, pela medição do marcador de peroxidação lipídica malondialdeído (MDA) e das enzimas antioxidantes. Os níveis de MDA (MBS268427, MyBioSource, EUA), GPx (MBS744364, MyBioSource, EUA), SOD (ab285310, EUA) e CAT (P04762, CUSABIO, EUA) foram medidos por kits ELISA de rato de acordo com Farid et al.³² e Amr et al.³³.

Níveis de citocinas em homogeneizados de tecido hepático

O efeito antiinflamatório dos NPs de Mel-PLGA foi determinado medindo o nível de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6) e a citocina antiinflamatória (IL-10). Os níveis de citocinas foram medidos no fígado de ratos por IL-1β (MBS825017, MyBioSource, EUA), TNF-α (ab100785, abcam, Reino Unido), IL-6 (P20607, CUSABIO, EUA) e IL-10 (P29456, CUSABIO, EUA). EUA) kits ELISA para ratos de acordo com Farid et al.³⁴.

Níveis de metaloproteinases de matriz em homogeneizados de tecido hepático:

O efeito dos NPs Mel-PLGA na remodelação do tecido hepático foi avaliado medindo MMP9 e TIMP1 por kits ELISA de rato (MBS722532 e MBS2502910, respectivamente; MyBioSource, EUA).

Técnica de citometria de fluxo

A técnica de citometria de fluxo foi utilizada para encontrar o efeito dos NPs preparados na apoptose e nos níveis de proteínas apoptóticas intracelulares. As culturas de células de hepatócitos foram produzidas sob condições esterilizadas. A veia porta de ratos sob anestesia foi perfundida com tampão de colagenase. O fígado foi dissecado após a perfusão, as células foram separadas, suspensas em meio completo de William, filtradas em filtro de náilon (100 μm) e depois cultivadas. O nível de apoptose nas células do fígado foi examinado utilizando o kit de detecção de apoptose Anexina-V-FITC / PI (ab14085, abcam, EUA). As células hepáticas foram permeabilizadas por saponina (pH 7.4); e a proteína anti-apoptótica Bcl2 (11-6992-42) e proteínas pró-apoptóticas [Bax (MA5-14,003), p53 (ab90363), caspase 3 (C92-605) e 8 (ab32125)] foram medidas por citometria de fluxo .

Exame histopatológico e imunohistoquímico:

As secções do fígado foram examinadas pelo método comum de coloração com hematoxilina e eosina para avaliar as diferentes alterações histopatológicas entre os grupos experimentais. A coloração imuno-histoquímica foi utilizada para avaliar o efeito antiinflamatório dos NPs de Mel-PLGA. As amostras de fígado foram desidratadas com níveis crescentes de álcool: álcool 70% por 1.5 h, álcool 90% por 1.5 h e álcool absoluto por 3 h. O fígado foi então clarificado durante 4 h em xileno. Após a limpeza, as amostras de fígado são submetidas ao procedimento de infiltração, onde são impregnadas com parafina pura e macia em três graus distintos (cada um com duração de uma hora) a 56 °C. Os corpos de prova foram então dispostos em blocos e imersos em parafina a 58 °C. Para análise histológica foram cortadas fatias de parafina de 4 mícrons de espessura, coradas com hematoxilina e eosina, montadas em dibutilftalato poliestireno xileno e depois cobertas^33,35. Para exame imuno-histoquímico²⁸, H₂O₂ (3%) [seguido de lavagem com PBS e bloqueio de 60 minutos com albumina de soro bovino (BSA, 5%)] foi utilizado para inibir a atividade da peroxidase endógena. As secções de fígado foram lavadas em PBS, após uma incubação de 30 minutos com o anticorpo primário [anticorpo anti-fator nuclear-kappa beta (NF-кB) p65 (ab86299, abcam, EUA) ou anticorpo anti-proteína C reativa (C1688 , Sigma Aldrich, EUA)]. O anticorpo secundário IgG anti-rato de coelho peroxidase de rábano (HRP) (ab6734, abcam, EUA) foi aplicado em secções de fígado e incubado durante 60 min. 3-diaminobenzidina (DAB) foi utilizada para o desenvolvimento da cor, com a cor marrom significando um resultado positivo. As secções de fígado foram lavadas e depois contrastadas com hematoxilina (3%).

Análise estatística

Os dados foram expressos como média ± DP e investigados por análise de variância unidirecional (ANOVA) utilizando SPSS versão 20.0 (SPSS Inc., Chicago, EUA). As diferenças entre as médias foram examinadas pelo teste post hoc de Tukey. Quando P < 0.05, valores foram considerados significativos.

Aprovação ética

Todos os procedimentos experimentais e manutenção dos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.

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• Fonte: https://www.nature.com/articles/s41598-023-43546-4