Cel cultuur

Bruine adipocyten werden onderscheiden van een onsterfelijk gemaakte bruine preadipocyt-muiscellijn, vriendelijk verstrekt door B. Spiegelman (Harvard University), zoals eerder beschreven¹⁹. Preadipocyten werden gehandhaafd en uitgebreid bij lage confluentie (<50%) in een groeimedium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium, hoge glucose (Gibco), aangevuld met 20% foetaal runderserum (Sigma-Aldrich), 20 mM HEPES (Sigma-Aldrich) en 100 Uml^-1 penicilline-streptomycine (Gibco)). Voor differentiatie werden preadipocyten tweemaal gewassen met fosfaatgebufferde oplossing (PBS) (Gibco, pH 7.4, 1x), gedissocieerd met TrypLE Express en gezaaid met een dichtheid van ongeveer 23,000 cellen cmXNUMX.^-2 in het groeimedium. Het medium werd na 24 uur vervangen door een differentiatiemedium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium, hoog glucosegehalte, aangevuld met 10% foetaal runderserum, 20 nM insuline, 1 nM triiodothyronine en 100 U ml^-1 penicilline-streptomycine) en de cellen werden gedurende 2 dagen gekweekt. Celdifferentiatie werd vervolgens geïnduceerd door de toevoeging van een inductiemedium (differentiatiemedium aangevuld met 0.125 mM indomethacine, 0.5 μM dexamethason en 0.5 mM isobutylmethylxanthine) gedurende 2 dagen, waarna het medium nog twee dagen werd vervangen door het differentiatiemedium. Gedifferentieerde adipocyten werden eenmaal gewassen met een verhongeringsmedium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium, lage glucose (Gibco), aangevuld met glucose tot een eindconcentratie van 8 mM, 0.5% runderserumalbumine (Sigma-Aldrich) en 100 U ml^-1 penicilline-streptomycine) en gedurende 2 uur geïncubeerd in het verhongeringsmedium vóór behandeling met insuline NanoRods of NanoRods verdund in het verhongeringsmedium gedurende de tijden aangegeven in de hoofdtekst. Na de behandeling werden de cellen eenmaal gewassen in PBS en geoogst voor de isolatie van eiwit voor immunoblots of RNA voor genexpressie. Voor IR-analyse door DNA-PAINT werden preadipocyten gedifferentieerd zoals hierboven beschreven met de volgende modificaties. Na behandeling met het inductiemedium werden de cellen gedissocieerd met TrypLE Express en geënt in het differentiatiemedium in μ-Slide 18 Well Glass Bottom-putjes (ibidi). Na 2 dagen werden de cellen gedurende 2 uur geïncubeerd met het verhongeringsmedium, gevolgd door behandeling met 10 nM insuline in het verhongeringsmedium gedurende 10 minuten. Bij controle-experimenten werd de toevoeging van insuline achterwege gelaten. Vóór de behandeling werden gedifferentieerde adipocyten visueel geanalyseerd om de celoppervlakdichtheid te beoordelen en de differentiatie van cellen te evalueren, en vervolgens willekeurig toegewezen aan de behandelings- en controlegroepen.

De cellen werden gehandhaafd, uitgebreid en gedifferentieerd in een bevochtigde atmosfeer die 5% CO bevatte₂ bij 37°C.

DNA-VERF van IR

Gedifferentieerde adipocyten werden gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur (RT) gefixeerd met voorverwarmde 4% paraformaldehyde in PBS, driemaal gewassen met PBS, gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur geblokkeerd met een blokkerende oplossing (3.0% foetaal runderserum/0.1% Triton X -100 in PBS) en geïncubeerd met anti-IR β-antilichaam van konijn (Cell Signaling (4B8); 1:300 verdunning in de blokkerende oplossing) gedurende 2 dagen bij 4 °C. De cellen werden vervolgens driemaal gewassen met PBS en geïncubeerd met het nanobody FluoTag-XM-QC anti-konijn IgG (Massive Photonics) 1:200 verdund in een blokkeerbuffer (Massive Photonics) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na drie wasbeurten met PBS werden de cellen gedurende 80 minuten geïncubeerd met 1 nm gouden nanodeeltjes (Sigma-Aldrich; 5:10 verdunning in de blokkeerbuffer). De cellen werden eenmaal gewassen met PBS en geïncubeerd met 5 nM Cy3b-gelabelde strengen (Massive Photonics) verdund in een beeldbuffer (Massive Photonics).

Beeldvorming werd uitgevoerd op een Nikon ECLIPSE Ti-E-microscoop met een Perfect Focus-systeem (Nikon Instruments), waarbij een fluorescentieconfiguratie van het objectieftype met totale interne reflectie werd toegepast met behulp van een iLAS2 circulaire fluorescentiemodule met totale interne reflectie (Gataca Systems) met een olie-immersie CFI Plan Apo met een numerieke opening van 1.49 totale interne reflectie fluorescentie x 100 objectief (Nikon Instruments) uitgerust met x 1.5 extra Optovar-vergroting, overeenkomend met een uiteindelijke pixelgrootte van 87 nm. De gebruikte laser was een OBIS 561 nm LS 150 mW (coherent) met aangepaste iLas-invoerbundeluitbreidingsoptiek (Cairn), geoptimaliseerd voor beeldvorming met superresolutie in een gereduceerd veld. De fluorescentielichtbundel werd eerst door een filterkubus (89901, Chroma Technology) geleid die een excitatie-quadbandfilter, een quadband dichroïsch filter en een quadband-emissiefilter (ZET405/488/561/640x, ZET405/488/561/640bs en ZET405) bevatte. /488/561/640m, Chroma-technologie). Fluorescentielicht werd vervolgens spectraal gefilterd met een emissiefilter (ET595/50m, Chroma Technology) en afgebeeld op een iXon Ultra 888 elektronenvermenigvuldigende ladingsgekoppelde apparaatcamera (Andor). Micro-Manager-software v. 1.4 werd gebruikt om 12,000 frames te verkrijgen met een uitleesframe van 10 MHz, een belichting van 130 ms en geen versterking van de elektronenvermenigvuldiging. In elke conditie werden in totaal tien cellen uit drie onafhankelijke experimenten in beeld gebracht (Aanvullende opmerking en aanvullende afb. 1).

INS-DNA-productie en -zuivering

Insuline (Merck, 1 mg ml^-1) werd gereageerd met dibenzocyclooctyne-sulfo-N-hydroxysuccinimidylester (DBCO-sulfo-NHS, Click Chemistry Tools; 690 µM) in 100 mM Na₂CO₃ buffer (pH 11.5) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. De reactie werd vervolgens gedurende 5 minuten geblust door de toevoeging van Tris-base (Sigma-Aldrich, 100 mM). De oplossing werd driemaal gewassen met 400 µl 100 mM Na₂CO₃ met behulp van Amicon Ultra 0.5 ml centrifugale filtereenheden met een 3 kDa cut-off membraan (Merck). Bij elke wasstap werden de kolommen gedurende 10 minuten bij 14,000x gecentrifugeerdg. Na de laatste wasstap werd insuline-DBCO (690 μM) gemengd met azide-gemodificeerd DNA (biomeren, 35 μM; aanvullende tabel 3) in 100 mM Na₂CO₃ en liet men gedurende 3 uur reageren bij kamertemperatuur. De reactie werd geblust door NaN toe te voegen₃ (Sigma-Aldrich, 6.9 mM). De monsters werden op een natieve polyacrylamidegel (6% 19:1 polyacrylamide in 1 x TAE, 20 min, 200 V, TAE-loopbuffer) gelopen en gekleurd met SYBR Gold (Thermo Fisher) volgens de instructies van de fabrikant, ter bevestiging van INS- DNA-vorming. Beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een ImageQuant LAS 4000 gel-imager. Het insuline-DBCO-sulfo-NHS-conjugatieprotocol werd geoptimaliseerd om de binding van de ssDNA-oligo aan lysine-29 van de B-keten (B29-lysine) te bevorderen in vergelijking met de aminegroepen aan de N uiteinde van insuline A- en B-ketens. De pKa-waarde van het B29-amine is hoger dan die van de aminen van de twee N termini (11.2 versus 8.6 en 6.8). Er wordt voorspeld dat bij hoge pH de NHS-groep van de crosslinker bij voorkeur reageert met de meest basische aminegroep, namelijk het B29-lysineamine.³². Daarom werden de pH-reactieomstandigheden geoptimaliseerd om een ​​enkel INS-DNA-product te bevorderen.

INS-DNA-reactiemengsels werden gezuiverd door middel van omgekeerde fase krachtige vloeistofchromatografie C₁₈ kolom (Agilent Poroshell 120 EC-C₁₈) op een Amersham Pharmacia Biotech ÄKTA Ettan LC. Buffer A (50 mM triethylamineacetaat) en buffer B (90% acetonitril en 10% buffer A) werden gebruikt in een gradiëntprofiel, waarbij het percentage buffer B in 30 minuten werd verhoogd van 50% naar 20%. Fracties werden verzameld en gedurende 120 minuten bij hoge hitte op een vacuümconcentrator (Thermo Scientific SpeedVac Savant DNA 30) gecentrifugeerd om de vluchtige componenten van de hoogwaardige vloeistofchromatografiebuffers te verwijderen. Geselecteerde pieken werden met buffer uitgewisseld in PBS met behulp van Amicon Ultra 0.5 ml centrifugaalfiltereenheden met een 3 kDa cut-off-membraan (Merck), door driemaal gedurende 10 minuten te draaien bij 14,000 xg en elke keer wassen met 400 µl PBS. Monsters van gezuiverde fracties werden op een natuurlijke polyacrylamidegel gebracht en gekleurd met SYBR Gold (Thermo Fisher) om het gezuiverde INS-DNA zichtbaar te maken. De uiteindelijke zuiverheid van conjugaten werd voor elk preparaat geanalyseerd via drie methoden: vergelijking van zilverkleuringsbandintensiteiten (Pierce Silver Stain Kit) op natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (Invitrogen, 4-12% Bolt-gel) tegen insulinestandaarden (Merck) , vergelijking van SYBR Gold-bandintensiteit op natieve polyacrylamidegelelektroforese tegen DNA-standaarden (Integrated DNA Technologies) en via de Qubit ssDNA Assay Kit (Qubit 4 Fluorimeter, Invitrogen). De eindconcentraties van INS-DNA werden berekend op basis van Qubit ssDNA-metingen. Gezuiverd INS-DNA werd ingevroren en tot verder gebruik bij -20 ° C bewaard.

Productie van NanoRods en insuline NanoRods

Origami-structuren werden bereid door steigerplasmide-DNA (p7560, Tilibit, 10 nM) te mengen met de juiste stapelstrengen (Integrated DNA Technologies, 100 nM) (aanvullende tabellen 4-9) in een vouwbuffer (5.0 mM Tris bij pH 8.5 (Sigma-Aldrich), 1.0 mM EDTA (Panreac AppliChem) en 12.5 mM MgCl₂ (Sigma-Aldrich)). Het mengsel werd vervolgens in een thermocycler (MJ Research PTC-225 Gradient Thermal Cycler) geplaatst en uitgegloeid door gedurende 80.0 minuten te verwarmen tot 5 °C, af te koelen tot 60.0 °C met een snelheid van 1.0 °C per minuut gedurende 20 minuten en vervolgens langzaam af te koelen tot 20.0 °C. °C bij 0.5 °C per min. Overtollige nietjes werden verwijderd met behulp van Amicon Ultra 0.5 ml centrifugale filtereenheden met een 100 kDa cut-off membraan (Merck) door vijf keer gedurende 2 minuten te draaien bij 14,000 xg en elke keer wassen met 400 µl van de vouwbuffer. De concentratie van de gezuiverde structuur werd bepaald door de DNA-absorptie bij 260 nm te meten (Thermo Scientific NanoDrop 2000). Gezuiverd INS-DNA werd vervolgens in 3x stoichiometrische overmaat toegevoegd aan de beschikbare verlengde strengbindingsplaatsen op de NanoRod-structuur en uitgegloeid in een thermocycler door gedurende 37.0 uur te verwarmen tot 1 °C en af ​​te koelen tot 22.0 °C met een snelheid van 0.1 °C per minuut. incuberen bij 22.0 °C gedurende 14 uur en afkoelen tot 4.0 °C met 0.1 °C per minuut. Ongebonden INS-DNA werd verwijderd met behulp van Amicon Ultra 0.5 ml centrifugale filtereenheden met een 100 kDa cut-off membraan (Merck), waarbij vijf keer gedurende 2 minuten werd rondgedraaid bij 14,000 xg en elke keer wassen met 400 µl PBS + 10 mM MgCl₂. Insuline NanoRods werden tot verder gebruik bij 4 ° C bewaard.

Agarosegel-elektroforese

NanoRod-structuren werden geanalyseerd door monsters gedurende 4 uur bij 70 V op agarosegels op ijs te laten lopen. Gels waren samengesteld uit 2% agarose (Thermo Scientific TopVision Agarose) in 0.5 x TBE-buffer (Panreac AppliChem) plus 10 mM MgClXNUMX.₂ (Sigma-Aldrich) en 1× SYBR Safe DNA-kleuring (Invitrogen). Beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een ImageQuant LAS 4000 gel-imager.

Dynamische lichtverstrooiing

NanoRod- en insuline NanoRod-monsters werden bereid in PBS + 10 mM MgCl₂, met een injectiespuit gefilterd met behulp van membranen van 0.1 µm (Merck) en geanalyseerd op een Zetasizer Ultra-instrument (Malvern Panalytical). Er werden drie metingen uitgevoerd bij 25 °C in een cel met een laag volume (ZSU1002) en vervolgens gemiddeld.

oxDNA-simulatie van de NanoRod

NR-, NR-1-, NR-2-, NR-4-, NR-7- en NR-15-structuren werden geanalyseerd met behulp van grofkorrelige oxDNA-modellering (https://oxdna.org/). NanoRod-structuren met dsDNA-strengen die zich uitstrekken vanaf de plaatsen waar insuline is opgenomen, zijn gemaakt met behulp van vHelix en omgezet naar het oxDNA-formaat met behulp van de tacoxDNA-website (http://tacoxdna.sissa.it/). Structuren werden voorgelegd aan de oxDNA.org webserver voor simulatie bij 37 °C, met 1 als zoutconcentratie, 1 × 10⁸ tijdstappen met advertentiet waarde van 0.0001, en een voorlopige relaxatiestap met de standaardparameters. Simulaties werden gevisualiseerd en video’s gemaakt met behulp van de oxView tool (https://oxdna.org/).

Negatief kleurende TEM

Gezuiverde NanoRods (10 nM) werden aangebracht op een door gloeien ontladen koolstofondersteund koperen TEM-rooster (TEM-CF200CU50, Thermo Fisher Scientific) en gedurende 60 seconden geïncubeerd voordat de oplossing werd verwijderd. De roosters werden vervolgens gedurende 10 seconden gekleurd met 5 µl 2% w/v uranylformiaat, dat vervolgens werd verwijderd. De kleuringsprocedure werd zeven keer herhaald en de TEM-roosters werden 30 minuten aan de lucht gedroogd voordat ze werden afgebeeld. Beeldvorming werd uitgevoerd op een Talos 120C G2 (120 kV, Ceta-D-detector) bij x 92,000 voor weergaven in het nabije veld. Ruwe afbeeldingen werden verwerkt met behulp van ImageJ-software (v1.53).

AFM

NanoRod-structuren werden afgebeeld op een schijf van mica die met epoxylijm aan het midden van een microscoopglaasje was bevestigd en omsloten door een plastic ring die met behulp van Reprorubber aan het objectglaasje was bevestigd. Nanostructuren werden verdund tot 1 nM in TE-Mg-buffer (5 mM Tris-base, 1 mM EDTA, 10 mM MgClXNUMX).₂pH 8.0) en 10 µl werd op vers gekliefd mica gepipetteerd. Na 30 s, 4 µl 5 mM NiSOXNUMX₄ werd toegevoegd en nog eens 4.5 minuten geïncubeerd. Het oppervlak werd vervolgens gespoeld met 1.0 ml 0.1 µm-gefilterde TE-Mg-buffer, waarna 1.5 ml gefilterde TE-Mg-buffer aan de micaschijf werd toegevoegd voor beeldvorming. Beeldvorming werd uitgevoerd in vloeistof met behulp van een JPK Instruments NanoWizard 3 Ultra atomic force-microscoop met een Bruker AC40 cantilever in de ac-modus.

DNA-VERF van insuline NanoRod-nanostructuren

De µ-Slide 18 Well Glass Bottom-putten (ibidi) werden gereinigd met isopropanol en gedroogd met N₂. De putjes werden geïncubeerd met 1 mg ml^-1 Biotine runderserumalbumine (Thermo Fisher) in buffer A (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl en 0.05% (v/v) Tween 20 bij pH 8.0) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, driemaal gewassen met buffer A en geïncubeerd met 0.5 mg ml^-1 neutravidine (Thermo Fisher) in buffer A gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De putjes werden vervolgens drie keer gewassen met buffer A, gevolgd door drie keer wassen met buffer B (5 mM Tris-HCl, 10 mM MgClXNUMX).₂1 mM EDTA en 0.05% (v/v) Tween 20 bij pH 8.0). Vervolgens werden 500 pM NanoRods met vier biotine-gelabelde DNA-strengen (Extended Data Fig. 2a), waarbij INS-DNA een PAINT-dockingsequentie van 9 nucleotiden bevat (DS1; aanvullende tabel 3), werd gedurende 5 minuten aan elk putje toegevoegd. De putjes werden driemaal gewassen met buffer B. Vervolgens werd 1 nM Atto-647N-beeldvormerstreng (IS1; aanvullende tabel 10) in buffer B aangevuld met zuurstofvangers (protocatechuïnezuur (Sigma), protocatechuaat 3,4-dioxygenase (Sigma) en Trolox (Sigma)) werd aan elk putje toegevoegd. Voor PAINT met dubbele uitwisseling zijn er drie dockingsequenties (DS2; aanvullende tabel 10) zijn aan beide uiteinden van de NanoRods toegevoegd. Er werden monsters bereid zoals eerder beschreven, waarbij de putjes tussen elke beeldopname tien keer werden gewassen met buffer B. Elke beeldopname werd uitgevoerd met een andere Atto-647N-beeldvormerstreng (IS1 en IS2; aanvullende tabel 10). Micro-Manager-software werd gebruikt om 9,000 frames te verwerven met een uitleesframe van 10 MHz, een belichting van 200 ms en geen versterking van de elektronenvermenigvuldiging (Aanvullende opmerking en aanvullende fign. 2 en 3).

SPR

Een Biacore T200-instrument (Cytiva) werd gebruikt om de SPR-experimenten uit te voeren en gegevens werden verkregen met behulp van Biacore T200-systeembesturingssoftware v. 2.01. Gebiotinyleerde ECD-IR (Nordic BioSite) werd geïmmobiliseerd op een streptavidine Sensor Chip SA (Cytiva). HBS-P+-buffer (Cytiva) werd gebruikt als loopbuffer. Na de immobilisatie van ECD-IR werd een stabilisatietijd van 15 minuten geïntroduceerd om een ​​stabiele basislijn te bereiken. NR-1, NR-2, NR-4, NR-7, NR-15, NR-8 en NR-8dsDNA werden geïnjecteerd met een concentratie van 11.4 nM insuline in de loopbuffer. Insuline en INS-DNA werden geïnjecteerd bij 55 nM, de minimale concentratie om een ​​bindingscurve te verkrijgen die kon worden geanalyseerd. NR werd geïnjecteerd als een negatieve controle in een concentratie die gelijk was aan de hoogste concentratie NanoRod die werd gebruikt bij insuline NanoRod-injecties (NR-1 = 11.4 nM). Als alternatief werden NR-2, NR-4, NR-7 en NR-15 geïnjecteerd met een nanostructuurconcentratie van 5.7 nM (Extended Data Fig. 4e), en NR-7^K-PEG werd ook een concentratie insuline van 50 nM geïnjecteerd (Extended Data Fig. 9c). De injectie van elk monster werd uitgevoerd met behulp van een associatiefase van 180 seconden en een dissociatiefase van 300 seconden. De dissociatie-evenwichtsconstante (K_D), associatiesnelheidsconstante (k_on) en dissociatiesnelheidsconstante (k_korting) werden bepaald met behulp van de BIAevaluation 3.0-software. De t_1/2 waarden, die de verblijftijd definiëren, werden bepaald met behulp van de formule ln2/k_korting. Om de binding van NR-7-structuren tussen IR en IGF1R te ​​vergelijken, werden ECD-IR- en ECD-IGF1R-eiwitten (Nordic BioSite) geïmmobiliseerd op twee verschillende stroomcellen van een CM5-sensorchip via aminekoppelingsreacties, volgens de instructies van de fabrikant. De binding van insuline en INS-DNA werd getest door het injecteren van verschillende concentraties insuline (6.2, 18.5, 55.6, 166.7 en 500.0 nM) in de loopbuffer (HBS-P+) in de kinetische modus van één cyclus, met behulp van een associatiefase van 140 s en een dissociatiefase van 300 s. De binding van NR-7 werd getest door het injecteren van een enkele structuurconcentratie (11.4 nM insuline) met behulp van een associatiefase van 180 seconden en een dissociatiefase van 300 seconden.

Coomassie-gel

Hier werd 0.5 µg recombinant ECD-IR (Nordic BioSite) geresuspendeerd in Laemmli-monsterbuffer (Bio-Rad). Voor reducerende omstandigheden werd 2-mercaptoethanol toegevoegd tot een eindconcentratie van 2.5%. De monsters werden gedurende 80 minuten bij 10 ° C gedenatureerd, gescheiden door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese en gekleurd met GelCode Blue veilige eiwitkleuring (Thermo Fisher Scientific).

Gel-shift-test

NanoRods (NR en NR-7) bij 20 nM werden gedurende 300 minuten bij 30 ° C geïncubeerd met 4 nM recombinant extracellulair domein van menselijk IR (Nordic BioSite) of met PBS. De monsters werden vervolgens op een 2% agarosegel gelopen en gekleurd met SYBR Safe.

immunoblotting

De cellen werden gewassen met PBS, gelyseerd in radio-immunoprecipitatietestbuffer (Sigma-Aldrich), aangevuld met protease en fosfataseremmercocktail (Thermo Fisher Scientific) en gedurende 30 minuten onder schudden op ijs geïncubeerd. Het lysaat werd geklaard door centrifugatie (20,000 xg gedurende 20 minuten bij 4 ° C) en de eiwitlysaten werden gekwantificeerd met behulp van de Bradford-eiwittest (Bio-Rad). Eiwitlysaten werden opnieuw gesuspendeerd in de Laemmli-monsterbuffer (Bio-Rad) die 2.5, 2% 80-mercaptoethanol bevatte, gedurende 10 minuten bij 1 ° C gedenatureerd, gescheiden door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese en overgebracht op polyvinylideenfluoridemembranen. Membranen werden 0.1 uur geïncubeerd in een blokkerende oplossing (Tris-gebufferde zoutoplossing met 20% Tween 5.0 (TBST) en 4% magere droge melk), gevolgd door incubatie gedurende de nacht bij 1 ° C met primaire antilichamen tegen fosfo-IR beta / IGF3024R. bèta (CST 1, 1,000:473), fosfo-AKT-S4058 (CST 1, 1,000:1) of GAPDH (Invitrogen PA987-1, 5,000:31460). Na drie keer wassen met TBST werden de membranen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen (Invitrogen, 5,000, 1:XNUMX). Detectie van mierikswortelperoxidase werd uitgevoerd door chemiluminescerend substraat Immobilon Forte op een ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad). Banddensiometrie werd uitgevoerd met behulp van de ImageJ-software.

Flowcytometrie

Gedifferentieerde, serum-uitgehongerde adipocyten werden bereid zoals hierboven beschreven. Adipocyten werden vervolgens tweemaal gewassen met de gebalanceerde zoutoplossing van Hanks (HBSS) en gedissocieerd in collagenase D-oplossing (1.5 U ml).^-1 collagenase D (Roche) en 10 mM CaCl₂ in HBSS) gedurende 20 minuten bij 37 °C. De cellen werden opnieuw gesuspendeerd in HBSS, gefilterd door een 35 µm HBSS-geëquilibreerde celzeef (BD Biosciences), gepelleteerd bij 300 xg gedurende 5 minuten en opnieuw gesuspendeerd in een kleurbuffer (1 x PBS en 1% runderserumalbumine). De dode cellen werden gelabeld met LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific) volgens de instructies van de fabrikant, en vervolgens werd de celsuspensie gepelletiseerd op 300×g gedurende 5 minuten en opnieuw gesuspendeerd in de kleuringsbuffer. Hier werden ~100,000 cellen geïncubeerd met 10 nM ATTO-647-gelabelde NanoRod-structuren in een eindvolume van 100 µl gedurende 10 minuten bij 37 ° C. De cellen die zonder de NanoRod-structuren waren geïncubeerd, werden als onbehandelde controle gebruikt. De cellen werden vervolgens tweemaal gewassen met de kleurbuffer door centrifugeren bij 300xg gedurende 5 minuten. Flowcytometriemetingen werden uitgevoerd op een BD FACSCANTO II met BD FACSDIVA-software v. 9.0 (BD Biosciences). Levende adipocytcellen werden aanvankelijk geïdentificeerd door cellen op FSC-A versus AmCyan-A te poorteren, gevolgd door poort op FSC-A versus FSC-H om singlets te detecteren. De verkregen gegevens werden geanalyseerd met behulp van FlowJo 10.7.1-software (BD Biosciences). Het geometrische gemiddelde van de fluorescentie-intensiteit na normalisatie naar de onbehandelde controle werd gebruikt om de mate van cellabeling door de NanoRods te definiëren.

Voorbereiding en sequencing van RNA-seq-bibliotheek

Het totale RNA werd geïsoleerd uit gedifferentieerde adipocyten met behulp van de Quick-RNA Microprep Plus Kit (Zymo Research), en 500 ng gezuiverd RNA werd gebruikt voor de voorbereiding van de mRNA-seq-bibliotheek met behulp van de TruSeq RNA Library Prep Kit v2 volgens het low-sample-protocol van de fabrikant. Kwantificatie van de bibliotheek werd uitgevoerd met behulp van het QuantiFluor dsDNA-systeem (Promega) volgens het multiwell-plaatprotocol van de fabrikant op een Varioskan LUX multimode microplaatlezer (Thermo Fisher). De omvang en kwaliteit van de bibliotheek werden beoordeeld met behulp van Bioanalyser 2100 en High Sensitivity DNA Kit (Agilent). Bibliotheken werden gedenatureerd en verdund met behulp van het NextSeq standaard normalisatieprotocol (Illumina), en de sequentiebepaling werd uitgevoerd met behulp van single-end reads (1 x 75 bp) met NextSeq 500/550 High Output Kit v. 2.5 (75 cycli) op ​​een NextSeq 550-platform ( Illumina).

RNA-seq-kwantificering, DEG-analyse en GSEA

Sequencing-lezingen werden in kaart gebracht tegen een referentietranscriptoom van Muis spier eiwitcoderende transcriptsequenties (vrijgave M29, GRCm39; https://www.gencodegenes.org/mouse/) en gekwantificeerd met behulp van Salmon 1.7.0 (ref. ³³). Teltabellen zijn gegenereerd met behulp van het tximport-pakket³⁴ en lijsten met DEG zijn verkregen met behulp van het DESeq2-pakket (v. 1.34.0)³⁵, waar alleen genen zijn aangepast P waarden gelijk aan of lager dan 0.001 en een log₂De grenswaarde voor de vouwverandering bij ±0.58 werd in aanmerking genomen voor verdere analyse. Heatmaps en UpSet-plots zijn gegenereerd met behulp van ComplexHeatmap (v. 2.10.0)³⁶. GSEA voor biologische processen met zowel Gene Ontology-termen als KEGG-routes werd uitgevoerd met behulp van een gerangschikte lijst van genen als invoer voor clusterProfiler (v. 4.2.2)³⁷ en een betekenis van gecorrigeerde valse ontdekkingen P waarden onder respectievelijk 0.10 en 0.05.

Micro-injecties van zebravissen en kwantificering van vrije glucose

NanoRod en insuline NanoRods werden gemengd met oligolysine-PEG (K₁₀-PIN_5K, Alamanda Polymers) bij een verhouding van 1:1 tussen de aminen van lysines in K₁₀-PIN_5K en de fosfaten in DNA³⁰en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd vóór een micro-injectie van 2 nl van het monster in elke zebravislarve. De monsters voor injectie werden bereid met een eindconcentratie van 100 nM structuren voor de gecoate NanoRod-monsters en met een eindconcentratie van 100 nM insuline voor de gecoate insuline NanoRod-monsters (overeenkomend met 100.0 en 14.3 nM NanoRods voor NR-1^K-PEG en NR-7^K-PEGrespectievelijk). Er is aangetoond dat injectie van 1 nl humane insuline bij een concentratie van 100 nM in zebravislarven een verlaging van de vrije glucosespiegels en transcriptionele veranderingen induceert die consistent zijn met insulinesignalering³⁸. Daarom injecteerden we 2 nl van een insulineconcentratie van 100 nM in onze tests om de insuline-gemedieerde effecten op de vrije glucosespiegels te evalueren. Aangezien het totale bloedvolume voor een zebravis van 2 dpf 60-89 nl bedraagt ​​(ref. ³⁹), zou de geschatte concentratie van de geïnjecteerde insuline in onze tests ongeveer 2–3 nM zijn. Bij deze tests waren we ook beperkt in de hoeveelheid geïnjecteerd monster, waarbij hogere injectieniveaus (3 en 4 nl) resulteerden in een slechte overleving van de larven.

Het onderhoud en het kruisen van zebravissen (D. rerio) lijnen werden uitgevoerd in overeenstemming met de Zweedse wetgeving inzake dierenwelzijnsvoorschriften, goedgekeurd door Stockholms djurförsöksetiska nämnd. Omdat voor experimenten met β-celablatie en vrije glucosebepaling alleen dieren jonger dan 5 dagen werden gebruikt, was er geen ethische vergunning vereist volgens 2010/63/EU. De gebruikte transgene lijnen voor zebravissen zijn eerder beschreven, namelijk: Tg(ins:GVB-NTR)^s892 (Ref. ²⁷) en Tg(ins:Kaede)^s949 (Ref. ²⁸).

Ablatie van β-cellen werd uitgevoerd bij twee dagen oud Tg(ins:GVB-NTR) en Tg(ins:GVB-NTR);Tg(ins:Kaede) embryo's door behandeling met 10 mM MTZ (Sigma-Aldrich) verdund in 1% DMSO (VWR) in een eiwateroplossing (E3) aangevuld met 0.2 mM 1-fenyl-2-thioureum (PTU, Acros Organics) gedurende 24 uur. Na β-celablatie, drie dagen oud Tg(ins:GVB-NTR) larven (72 hpf) werden verdoofd in 0.01% tricaïne en geïnjecteerd met 2 nl 1× PBS, ongemodificeerde insuline of gecoate NanoRod/insuline NanoRods in de gemeenschappelijke hoofdader (kanaal van Cuvier)⁴⁰. Fenolrood (Sigma-Aldrich) tot een eindconcentratie van 0.1% werd toegevoegd aan de PBS-, insuline- of gecoate insuline NanoRod-monsters om te helpen bij de visualisatie van het micro-injectieproces en de bepaling van met succes geïnjecteerde larven. Larven van zebravissen werden willekeurig toegewezen aan de behandelingsgroepen. Vrije glucoseniveaus werden gemeten zoals elders beschreven⁴¹ met behulp van een op fluorescentie gebaseerde enzymatische kit (BioVision). Per aandoening/replicaat werden groepen van drie tot zes geïnjecteerde larven gebruikt.

Confocale beeldvorming

Tg(ins:GVB-NTR);Tg(ins:Kaede)-geablateerde larven werden 24 uur na de ablatiebehandeling verzameld, verdoofd en geïnjecteerd volgens het eerder genoemde protocol en gefixeerd in 4% paraformaldehyde-oplossing voordat de β-celaantallen werden geanalyseerd door confocale beeldvorming. De confocale beelden werden verkregen met een Leica TCS SP8-microscoop en de LAS X-software (v. 3.5.5.19976). De primaire pancreaseilandjes van de β-cel zijn geablateerd Tg(ins:GVB-NTR);Tg(ins:Kaede) larven werden gescand met een ×40 wateronderdompelingsdoelstelling en de z stapels werden geanalyseerd met behulp van Fiji-software (v1.53). Alle weergegeven afbeeldingen zijn afkomstig uit hetzelfde experiment en hun contrastwaarden zijn aangepast voor visualisatiedoeleinden. De kwantificering van β-cellen werd uitgevoerd op originele, ongewijzigde afbeeldingen.

statistische analyse

Er werden geen statistische methoden gebruikt om de steekproefomvang vooraf te bepalen, maar de steekproefomvang was vergelijkbaar met die gerapporteerd in eerdere publicaties^28,38,42. Celcultuurmonsters en dieren werden willekeurig toegewezen aan de controle- en behandelingsgroepen. Het verzamelen en analyseren van gegevens gebeurde niet blind voor de omstandigheden van de experimenten. Voor de meeste grafieken worden individuele gegevenspunten uitgezet. Steekproefgrootte (n) van het aantal experimentele biologische herhalingen en de gebruikte statistische methoden worden aangegeven in de overeenkomstige figuurlegendes. Datasets werden getest op Gaussiaanse distributie, gevolgd door de juiste statistische test. Statistische analyse en grafische weergave van de gegevens werden verwerkt met GraphPad Prism 9.4.0. Er werd een tweezijdige Mann-Whitney-test uitgevoerd om de clustereigenschappen tussen de controlecellen en de met insuline behandelde cellen te vergelijken. Voor Western-blot-kwantificeringen werd eenzijdige variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett uitgevoerd. Voor de kwantificering van β-cellen werd de Kruskal-Wallis-test gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Dunn uitgevoerd. De analyse van vrije glucosewaarden werd uitgevoerd met behulp van eenwegs-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Tukey.

Rapportage samenvatting

Nadere informatie over onderzoeksontwerp is beschikbaar in de Samenvatting van de rapportage over de natuurportfolio gekoppeld aan dit artikel.

• Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
• PlatoData.Network Verticale generatieve AI. Versterk jezelf. Toegang hier.
• PlatoAiStream. Web3-intelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
• PlatoESG. carbon, CleanTech, Energie, Milieu, Zonne, Afvalbeheer. Toegang hier.
• Plato Gezondheid. Intelligentie op het gebied van biotech en klinische proeven. Toegang hier.
• Bron: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01507-y