Om 3D-beelden met hoge resolutie van weefsels zoals de hersenen te maken, gebruiken onderzoekers vaak twee-fotonmicroscopie, waarbij een laser met hoge intensiteit op het monster wordt gericht om fluorescentie-excitatie te induceren. Scannen diep in de hersenen kan echter moeilijk zijn omdat licht van weefsels wordt verstrooid naarmate het dieper gaat, waardoor beelden wazig worden.

Beeldvorming met twee fotonen is ook tijdrovend, omdat hiervoor meestal afzonderlijke pixels één voor één moeten worden gescand. Een team van onderzoekers van MIT en Harvard University heeft nu een aangepaste versie van twee-foton-beeldvorming ontwikkeld die dieper in het weefsel kan beelden en de beeldvorming veel sneller kan uitvoeren dan voorheen mogelijk was.

Dit soort beeldvorming zou wetenschappers in staat kunnen stellen om sneller beelden met een hoge resolutie te verkrijgen van structuren zoals bloedvaten en individuele neuronen in de hersenen, aldus de onderzoekers.

"Door de laserstraal die in het weefsel komt aan te passen, hebben we laten zien dat we dieper kunnen gaan en fijnere beeldvorming kunnen doen dan de vorige technieken", zegt Murat Yildirim, een MIT-onderzoeker en een van de auteurs van de nieuwe studie.

MIT-afgestudeerde student Cheng Zheng en voormalig postdoc Jong Kang Park zijn de hoofdauteurs van het artikel, dat vandaag verschijnt in Wetenschap Advances. Dushan N. Wadduage, een voormalig MIT-postdoc die nu een John Harvard Distinguished Science Fellow in Imaging bij het Center for Advanced Imaging aan de Harvard University is, is de senior auteur van de paper. Andere auteurs zijn onder meer Josiah Boivin, een MIT-postdoc; Yi Xue, een voormalige MIT-afgestudeerde student; Mriganka Sur, de Newton hoogleraar neurowetenschappen aan het MIT; en Peter So, een MIT-professor in werktuigbouwkunde en biologische technologie.

Diepe beeldvorming

Twee-fotonenmicroscopie werkt door een intense straal van nabij-infrarood licht op een enkel punt in een monster te laten schijnen, waardoor gelijktijdige absorptie van twee fotonen wordt geïnduceerd in het brandpunt, waar de intensiteit het hoogst is. Dit langgolvige, energiezuinige licht kan dieper in het weefsel doordringen zonder het te beschadigen, waardoor beeldvorming onder het oppervlak mogelijk is.

Twee-foton-excitatie genereert echter beelden door fluorescentie en het fluorescerende signaal bevindt zich in het zichtbare spectrale gebied. Bij diepere beeldvorming in weefselmonsters verstrooit het fluorescerende licht meer en wordt het beeld wazig. Het in beeld brengen van vele weefsellagen is ook erg tijdrovend. Het gebruik van breedveldbeeldvorming, waarbij een heel weefselvlak tegelijk wordt verlicht, kan het proces versnellen, maar de resolutie van deze benadering is niet zo groot als die van puntsgewijs scannen.

Het MIT-team wilde een methode ontwikkelen waarmee ze een groot weefselmonster in één keer konden afbeelden, terwijl de hoge resolutie van puntsgewijs scannen behouden bleef. Om dat te bereiken, bedachten ze een manier om het licht te manipuleren dat ze op het monster schijnen. Ze gebruiken een vorm van breedveldmicroscopie, waarbij ze een lichtvlak op het weefsel schijnen, maar de amplitude van het licht aanpassen zodat ze elke pixel op verschillende tijdstippen kunnen in- of uitschakelen. Sommige pixels lichten op terwijl nabijgelegen pixels donker blijven, en dit vooraf ontworpen patroon kan worden gedetecteerd in het licht dat door het weefsel wordt verstrooid.

"We kunnen elke pixel aan- of uitzetten door dit soort modulatie", zegt Zheng. "Als we sommige spots uitschakelen, ontstaat er ruimte rond elke pixel, zodat we nu kunnen weten wat er op elk van de individuele spots gebeurt."

Nadat de onderzoekers de onbewerkte afbeeldingen hebben verkregen, reconstrueren ze elke pixel met behulp van een computeralgoritme dat ze hebben gemaakt.

“We controleren de vorm van het licht en we krijgen de reactie van het weefsel. Uit deze reacties proberen we op te lossen wat voor soort verstrooiing het weefsel heeft. Terwijl we de reconstructies van onze onbewerkte afbeeldingen doen, kunnen we veel informatie krijgen die je niet kunt zien in de onbewerkte afbeeldingen", zegt Yildirim.

Met behulp van deze techniek toonden de onderzoekers aan dat ze ongeveer 200 micron diep in plakjes spier- en nierweefsel konden afbeelden, en ongeveer 300 micron in de hersenen van muizen. Dat is ongeveer twee keer zo diep als mogelijk was zonder deze patroonexcitatie en computationele reconstructie, zegt Yildirim. De techniek kan ook ongeveer 100 tot 1,000 keer sneller beelden genereren dan conventionele microscopie met twee fotonen.

Hersenstructuur

Dit type beeldvorming zou onderzoekers in staat moeten stellen om sneller beelden met een hoge resolutie te verkrijgen van neuronen in de hersenen, evenals van andere structuren zoals bloedvaten. Het in beeld brengen van bloedvaten in de hersenen van muizen kan bijzonder nuttig zijn om meer te weten te komen over hoe de bloedstroom wordt beïnvloed door neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer, zegt Yildirim.

"Alle onderzoeken naar de bloedstroom of morfologie van de bloedvatstructuren zijn gebaseerd op scansystemen met twee fotonen of drie fotonen, dus ze zijn traag", zegt hij. "Door deze technologie te gebruiken, kunnen we echt snelle volumetrische beeldvorming van de bloedstroom en de bloedvatstructuur uitvoeren om de veranderingen in de bloedstroom te begrijpen."

De techniek kan zich ook lenen voor het meten van neuronale activiteit, door het toevoegen van spanningsgevoelige fluorescerende kleurstoffen of fluorescerende calciumsondes die oplichten wanneer neuronen worden geëxciteerd. Het kan ook nuttig zijn voor het analyseren van andere soorten weefsel, waaronder tumoren, waar het kan worden gebruikt om de randen van een tumor te bepalen.

Het onderzoek werd gefinancierd door de National Institutes of Health, waaronder het National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering P41-programma en de NIBIB Pathway to Independence Award, de Hamamatsu Corporation, het Samsung Advanced Institute of Technology, de Singapore-MIT Alliance for Research and Technology (SMART), het Center for Advanced Imaging aan de Harvard University en het John Harvard Distinguished Science Fellowship Program.