Cel cultuur

Muis ESC-lijnen (Rex1GFP-d2 en E14IVc¹³⁷) werden gekweekt in feeder-vrije omstandigheden [geplastificeerd met 0.2% gelatine (Sigma, cat. G1890)] en elke 3-4 dagen opnieuw uitgeplaat in een split-ratio van 1:10 na dissociatie met Accutase (GE Healthcare, cat. L11-007 ) of 0.25% trypsine (Life Technologies). Cellen werden gekweekt in serumvrij N2B27-gebaseerd medium [DMEM/F12 en Neurobasal in een verhouding van 1:1, 0.1 mM β-mercapto-ethanol, 2 mM L-glutamine, 1:200 N2 en 1:100 B27 (alle reagentia van Life Technologies )] of serumbevattend KSR-medium [GMEM (Sigma, cat. G5154) aangevuld met 10% KSR (Life Technologies), 2% FBS (Sigma, cat. F7524), 100 mM β-mercapto-ethanol (Sigma, cat. M7522) , 1 × MEM niet-essentiële aminozuren (Invitrogen, cat. 1140-036), 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat (beide van Invitrogen)], aangevuld met twee kleinmoleculaire remmers (2i) PD (PD0325901, 1 μM), CH (CHIR99021, 3 μM) van Axon (cat. 1386 en 1408) en LIF (100 eenheden/ml gekocht bij Qkine – Cambridge UK).

Menselijke iPSC's CS09iHD-109n5 (hier aangeduid als iPSC_Q109) en CS14iCTR-21n3 (hier aangeduid als iPSC_Q21) gekocht bij Cedars-Sinai Biomanufacturing Center (Los Angeles, Californië), werden onderhouden op voorgecoate 0.5% Matrigel (CORNING, cat. 356231 ) platen in E8 medium gemaakt in huis (volgens Chen et al., 2011¹³⁸) of in mTeSR (StemCell Technologies, cat. 05850) bij 37 °C, 5% O², 5% CO². Menselijke iPSC's werden gedissocieerd in klonten met 0.5 mM EDTA (Gibco, cat. AM99260G) en elke 1-6 dagen opnieuw uitgeplaat in een verdunning van 3:4 met 10 μM ROCK-remmer (Y27632-dihydrochloride Axon Medchem, cat. 1683) gedurende 24 uur. Medium werd elke dag verschoond. Alle cellijnen waren mycoplasma-negatief.

Genotypering van iPSC_Q21 en iPSC_Q109

Genomisch DNA van iPSC_Q21 en iPSC_Q109 werd geïsoleerd met behulp van de DNeasy Blood and Tissue-kit (Qiagen, cat. 69504) volgens de instructies van de fabrikant en gekwantificeerd door Nanodrop ND-1000. PCR werd uitgevoerd met behulp van primers vermeld in aanvullende tabel 1 en beschreven in Mangiarini et al.²⁹, ontworpen om het polyQ-kanaal in HTT exon 1 te versterken. Voor een reactie van 25 μl gebruikten we 200 ng genomisch DNA, 0.25 μl Taq Phusion High fidelity (ThermoFisher, cat. F-530L), 2.5 μL Buffer GC 5x + MgCl² (7.5 mM), 2 μl dNTP's (10 mM) en 1.25 μl dimethylsulfoxide (DMSO, 100%). Na 3 minuten bij 94 °C voerden we 35 cycli uit van: 94 °C gedurende 1 minuut, 63 °C gedurende 45 seconden, 72 °C gedurende 1 minuut, gevolgd door een laatste verlenging bij 70 °C gedurende 7 minuten. Gelelektroforese werd uitgevoerd op agarosegel bij 2.5%, waarbij 20 μl PCR-producten werd geladen met Purple Loading Dye 6x (NEB, cat. B7024S). β-actine werd gebruikt als laadcontrole. De resultaten zijn digitaal verkregen door VWR Imager CHEMI Premium.

Generatie van HTT-uitdrukkende ESC-lijnen

Q15- en Q128-cellen werden gegenereerd door DNA-transfectie van vectoren die het N-terminale van het humane huntingtine-gen bevatten, met respectievelijk 128 of 15 CAG-herhalingen (met dank aan professor Elena Cattaneo). Linearisatie van plasmide-DNA gedurende de nacht werd uitgevoerd met het restrictie-enzym PvuI. Voor DNA-transfectie gebruikten we Lipofectamine 2000 (Life Technologies, cat. 11668-019) en voerden omgekeerde transfectie uit. Voor één putje van een plaat met 6 putjes gebruikten we 6 μl transfectiereagens, 2 μg plasmide-DNA en 300,000 cellen in 2 ml medium. Het medium werd na incubatie gedurende de nacht vervangen. Antibioticaselectie (puromycine 1 μg/ml) begon 24 uur na transfectie.

Generatie van muizen-ESC's die op stabiele wijze interessante genen tot expressie brengen

Stabiele transgene muis-ESC's die kandidaten tot expressie brengen, werden gegenereerd door HTT tot expressie brengende cellen te transfecteren met PB-transposon-plasmiden (1 μg CAG-Mtf1, CAG-Kdm2b, CAG-Kdm5b en CAG-Fbxo34), gekocht bij VectorBuilder (VectorBuilder Inc, Chicago, IL, VS), met PB-transposase-expressievector pBase (1 μg). We gebruikten Lipofectamine 2000 en voerden omgekeerde transfectie uit zoals beschreven voor het genereren van HD-lijnen. Antibioticaselectie (Hygromycine B, 150 μg/ml; Invitrogen, cat. 10687010) begon 24 uur na transfectie.

NPC's differentiatie

iPSC_Q21 en iPSC_Q109 werden gedifferentieerd in NPC's volgens Li et al., 2011⁹² protocol. iPSC's bij 80% confluentie werden gedissocieerd in enkele cellen met Accutase (Gibco, cat. A1110-501) en geplateerd 45,000 cellen / cm² in E8-medium met 10 μM ROCK-remmer. Na 1 dag werd E8-medium vervangen door N2B27-inductiemedium bestaande uit Advanced DMEM/F12 (Gibco, cat. 12634-010): Neurobasal (Gibco, cat. 21103-049) (verhouding 1:1), BSA 50 mg/ml (Gibco, cat. 15260-037), Glutamax 1% (Gibco, cat. 35050-038), Penicilline/Streptomycine 1% (Gibco, cat. 15140122), N2 Supplement 1:200 (Gibco, cat. 17502-048) , B27 Supplement 1:100 (Gibco, cat. 17504-044), aangevuld met kleine moleculen humaan LIF 10 ng/mL (Qkine, cat. Qk036), SB431542 2 μM (Axon Medchem, cat. 1661), CHIR99021 3 μM ( Axon Medchem, cat. 1386), Verbinding E 0.1 uM (Sigma-Aldrich, cat. 209986-17-4). N2B27-inductiemedium werd gedurende 7 dagen elke dag vervangen. Op dag 7 werden NPC's gesplitst in een verdunning van 1:6 in N2B27-onderhoudsmedium dat is samengesteld uit Advanced DMEM/F12 (Gibco, cat. 12634-010): Neurobasal (Gibco, cat. 21103-049) (verhouding 1:1) , BSA 50 mg/ml (Gibco, cat. 15260-037), Glutamax 1% (Gibco, cat. 35050-038), Penicilline/Streptomycine 1% (Gibco, cat. 15140122), N2 Supplement 1:200 (Gibco, cat. 17502-048), B27 Supplement 1:100 (Gibco, cat. 17504-044), aangevuld met kleine moleculen humaan LIF 10 ng/ml (Qkine, cat. Qk036), SB431542 2 μM (Axon Medchem, cat. 1661 ), CHIR99021 3 μM (Axon Medchem, cat. 1386), aangevuld met EGF 20 ng/mL (R&D, cat. 236-EG) en FGF2 20 ng/mL (Qkine, cat. Qk002, recombinant zebravis FGF2). NPC's werden onderhouden voor 6 passages. h-iPSC's en NPC's morfologiegegevens werden digitaal verzameld met microscoop Zeiss Axio Vert A1 FL-LED.

Generatie van NPC's die genen van interesse tijdelijk tot expressie brengen

Voor DNA-transfectie werden 250,000 NPC's gedissocieerd als enkele cellen met Accutase (Gibco, cat. A1110-501) en werden getransfecteerd met PB-constructen (1 μg) met behulp van FuGENE HD Transfection (Promega, cat. E2311), volgens het protocol voor omgekeerde transfectie . Voor één putje van een plaat met 12 putjes gebruikten we 3.9 μl transfectiereagens, 1 μg plasmide-DNA en 250,000 cellen in 1 ml N2B27-onderhoudsmedium met 10 μM Y27632 [ROCKi, Rho-geassocieerde kinase (ROCK)-remmer, Axon Medchem kat. 1683]. Het medium werd na incubatie gedurende de nacht vervangen. Na 48 uur na transfectie werden de cellen gedurende 30 uur behandeld met Rotenon 24 µM en vervolgens geanalyseerd zoals aangegeven in Fig. 8f.

Proliferatie-test

Muis-ESC's werden geconditioneerd voor één passage in KSR + 2iL-medium in aanwezigheid van Puromycine 6 μg / ml. Proliferatie van ESC's werd beoordeeld door 15,000 cellen uit te platen in een plaat met 24 putjes (7,500 cellen/cm²) in KSR + 2iL medium in aanwezigheid van Puromycin 6 μg/mL. Cellen werden gedissocieerd met 0.25% trypsine (Life Technologies) en gedurende 24 dagen elke 4 uur geteld.

De proliferatie van iPSC's werd gemeten door 40,000 afzonderlijke cellen uit te platen op voorgecoate 0.5% Matrigel (CORNING, cat. 356231) platen met 12 putjes (11,428 cellen/cm²) in E8-medium met 10 µM ROCK-remmer (Y27632-dihydrochloride, Axon Medchem, cat. 1683) gedurende 24 uur. Medium werd elke dag verschoond. Cellen werden gedissocieerd met Accutase (GE Healthcare, cat. L11-007) en gedurende 24 dagen elke 4 uur geteld.

Proliferatie van NPC's werd gemeten door 100,000 cellen uit te platen op voorgecoate 0.5% Matrigel (CORNING, cat. 356231) 12-wells platen (28,571 cellen/cm²) in N2B27 onderhoudsmedium met 10 µM ROCK-remmer (Y27632-dihydrochloride Axon Medchem, cat. 1683) gedurende 24 uur. Cellen werden gedissocieerd met Accutase (GE Healthcare, cat. L11-007) en gedurende 24 dagen elke 4 uur geteld.

Behandeling van stressoren en kleuring van kristalviolet (CV).

Voor experimenten in Fig. 2bwerden 5,000 muis-ESC's uitgeplaat in een plaat met 24 putjes (2,500 cellen / cm²) in KSR + 2iL-medium in aanwezigheid van de remmers (en Puromycin 6 μg/ml) gedurende 48 uur en gescoord door kwantificering van het aantal overlevende cellen door CV-kleuring [CV-oplossing: 0.05% w/v Crystal Violet (Sigma) , 1% formaldehyde-oplossing 37% (Sigma), 1% methanol, 10% PBS] en kwantificering van de gemiddelde intensiteit werd uitgevoerd met Fiji-software (v2.0.0).

Voor PB-mutagenese gevolgd door stressorbehandelingen werden cellen uitgeplaat met een dichtheid van 2,500 cellen/cm² in Puromycin 6 μg/mL en gedurende 5 dagen geselecteerd in aanwezigheid van MG132 (Sigma-Aldrich, cat. C2211) of Tamoxifen (Sigma-Aldrich, cat. T2859).

Voor experimenten in Fig. 4gwerden 5,000 cellen uitgeplaat in een plaat met 24 putjes in KSR + 2iL-medium met Puromycine 3 μg / ml. Stressoren (MG132 12.5 nM of Tamoxifen 13.4 µM) werden na 12 uur toegevoegd. Scoren van overlevende cellen werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven.

Voor experimenten in Aanvullende Fig. 4dwerden 2,500 cellen uitgeplaat in een plaat met 48 putjes in KSR + 2iL-medium. Stressoren [Rotenon (Sigma-Aldrich, cat. R8875), Cumeen (Sigma-Aldrich, cat. 247502), 5-Azacytidine (Sigma-Aldrich, cat. A1287), MG132 (Sigma-Aldrich, cat. C2211), Bafilomycine ( Sigma-Aldrich, cat. B1793), Staurosporine (Sigma-Aldrich, cat. S6942), Tamoxifen (Sigma-Aldrich, cat. T2859)] werden na 12 uur bij de aangegeven concentraties toegevoegd. Na 48 uur werden de overlevende cellen gekleurd met CV-oplossing en werd het scoren van de overlevende cellen uitgevoerd zoals hierboven beschreven.

Elektroporatie van het PB-systeem in ESC's

PB-gemedieerde mutagenese door elektroporatie werd uitgevoerd voor genoombrede screening. PB-vectoren integreren stabiel in het genoom na willekeurige insertie in TTAA-sites. De gebruikte PB pGG134-vector (getoond in Fig. 2a) is geoptimaliseerd voor gain-of-function-schermen⁵⁴: het bestaat uit de MSCV-enhancer/promotor gevolgd door een splitsingsdonorsite van exon 1 van vosf2 gen, dat de overactivering van nabijgelegen genen mogelijk maakt. De PB 5'-ITR heeft ook een zwakke directionele promotoractiviteit, dwz dit construct kan genen in beide oriëntaties activeren. De vector bevat ook een tweede cassette, inclusief een constitutieve promotor gevolgd door DsRed- en Hygromycine-resistentiegenen, die werd gebruikt om cellen met stabiele vectorintegratie te identificeren.

We hebben de omstandigheden geoptimaliseerd om een ​​laag aantal integratiegebeurtenissen te bereiken, door de verhouding van PB-vector versus transposase pBase aan te passen. Voor de screeningprocedure werd mutagenese uitgevoerd met behulp van de geoptimaliseerde hoeveelheid van 0.5 μg pGG134 en 20 μg pBase.

Voor een enkele elektroporatie, 10⁷ cellen en 20.5 pg DNA werden gemengd en in een elektroporatiecuvette geplaatst (Biorad Gene Pulser Cuvette, cat. 165-2088). Cellen werden geëlektroporeerd door de cuvet in de elektroporatiehouder van de Biorad GenePulser (cat. 165-2076) te plaatsen. Gebruikte instellingen: 250 V, 500 μF, tijdconstante moet tussen 5.6 en 7.5 liggen. Geëlektroporeerde cellen werden voorzichtig uit de cuvetten gehaald en uitgeplaat. Antibioticaselectie begon 24 uur na elektroporatie.

Genomische DNA-extractie en Splinkerette-PCR

Cellen werden geoogst en overnacht bij 56 °C geïncubeerd met lysisbuffer [10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 10 mM EDTA; 10 mM NaCl; 0.5% w/v Sarcosyl, aangevuld met proteïnase K (Sigma, cat. P2308) tot een eindconcentratie van 1 mg/ml]. Om DNA-precipitaten te verkrijgen, werd de volgende dag 2 ml van een mengsel van NaCl en ethanol (30 µl 5 M NaCl gemengd met 20 ml koude absolute ethanol) toegevoegd. Cellulaire extracten werden 45 minuten bij 4°C gecentrifugeerd om de oplosbare fractie te verwijderen. Geprecipiteerd gDNA werd driemaal gespoeld door 2 ml 70% ethanol te druppelen en uiteindelijk opnieuw gesuspendeerd in 70 ° C milliQ water.

Splinkerette-PCR-procedure voor PB-integratiemapping werd aangepast van Potter en Luo ¹³⁹ en bestond uit de volgende stappen: a) 2 µg genomisch DNA werd gedigereerd met 10 U BstYI (10,000 U/ml, NEB) in een volume van 30 µl. De reactie werd een nacht bij 60°C geïncubeerd, de volgende dag werd het enzym gedurende 80 minuten bij 20°C geïnactiveerd. Adapters voor Splinkerette-PCR werden gegenereerd door annealing van 150 pmol AdapterA- en B-primers (aanvullende tabel 1) in een eindvolume van 100 μL (10x NEB Buffer 2). Oligo's werden gedurende 65 minuten bij 5 ° C gedenatureerd en vervolgens afgekoeld; b) Ligatie werd uitgevoerd in een totaal volume van 6 μl inclusief een 2x ligatiemix (Takara), 2.5 μl gedigereerd gDNA en 0.5 μl gehybridiseerde adapters voor Splinkerette-PCR. De ligatiereactie werd een nacht bij 16°C geïncubeerd, de volgende dag 65 minuten bij 10°C voor enzyminactivatie. Voorafgaand aan stap C was er een zuiveringsstap met behulp van de QIaquick PCR Purification Kit, volgens de instructies van de fabrikant. Voor PCR-amplificaties gebruikten we Phusion HF DNA Pol (NEB) in 5x Phusion GC Buffer aanbevolen in het geval van GC-rijke sjablonen of die met secundaire structuren. PCR-mix omvatte 5x GC-buffer, 10 mM dNTP's, DMSO en Phusion Pol; c) Eerste ronde PCR werd geamplificeerd met 15 μl geligeerd DNA (of 50% ligatieproduct voor elke reactie voor PB5'- en PB3'-transposon/gastheerverbindingen), 0.5 μM voor elke primer (Adaptor-PCR1 en PB5' of PB3' -ITR PCR1), 6.5 μL PCR-mix, eindvolume van 25 μL. Splinkerette-PCR1-programma: 95 °C gedurende 2 minuten; twee cycli van 95 °C gedurende 20 seconden, 65 °C gedurende 30 seconden, 68 °C gedurende 2 minuten; vervolgens 30 cycli van 95 °C gedurende 30 seconden, 60 °C gedurende 30 seconden, 68 °C gedurende 2 minuten; vervolgens 68 °C gedurende 10 minuten; d) Voor de tweede ronde PCR gebruikten we 5 μl van 1:500 verdunning van PCR1-product, 0.5 μM voor elke primer (Adapter-PCR2 en PB5' of PB3'-ITR PCR2), 6.5 μL PCR-mix, eindvolume van 25 μL . Splinkerette-PCR2-programma: 95 °C gedurende 2 minuten; twee cycli van 95 °C gedurende 20 seconden, 65 °C gedurende 30 seconden, 68 °C gedurende 2 minuten; vervolgens 5 cycli van 95 °C gedurende 30 seconden, 60 °C gedurende 30 seconden, 68 °C gedurende 2 minuten; vervolgens 25 cycli van 95 °C gedurende 30 seconden, 58 °C gedurende 30 seconden, 68 °C gedurende 2 minuten; vervolgens 68 °C gedurende 10 minuten; e) PCR2-producten werden behandeld met Antarctic Phosphatase en Exonuclease I (beide van NEB) en de sequentie werd bepaald met behulp van PB5'- of PB3'-ITR PCR2-primers. Primers en adaptersequenties worden vermeld in de aanvullende tabel 1.

Next Generation Sequencing-analyse van genomische integratiesites

Genomisch DNA van volledige populaties van mutanten werd geëxtraheerd met behulp van een Gentra Puregene Cell Kit. Bibliotheekvoorbereiding en sequentiëring werden uitgevoerd zoals eerder beschreven¹⁴⁰. Een op maat gemaakte bio-informatica-pijplijn maakte het mogelijk om elke afzonderlijke uitlezing in kaart te brengen naar een genomische locus en om elke integratieplaats te associëren met een gen binnen een afstand van 20 kb. Gegevens werden vervolgens georganiseerd in het netwerk van ZvH-interagerende genen door middel van Cytoscape-software (v3.8.2).¹⁴¹.

Propidiumjodide (PI) kleuring

PI-kleuring werd uitgevoerd op levende enkele muis-ESC's volgens de instructies van de fabrikant (Ebioscience, cat. 88-8007-72). Na wassen in PBS, 10⁵ levende cellen werden opnieuw gesuspendeerd in 200 μl 1x bindingsbuffer en 5 μl PI-kleuringsoplossing (cat. 00-6990) werd toegevoegd. Flowcytometrie-analyse werd uitgevoerd met behulp van een BD FACSCanto^TM II cytometer binnen 1 uur, bewaar monsters in het donker bij 2-8 °C. Gegevens werden geanalyseerd met BD FACSDiva^TM (v. 9.0) en FlowJo (10.8.1) software. Representatieve poortstrategie is beschikbaar in aanvullende afbeelding XNUMX. 10.

ROS-meettest

ROS-productie werd gedetecteerd door enkele levende muis-ESC's en menselijke NPC-cellen te kleuren met 2', 7'-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (H₂DCFDA; Levenstechnologieën, cat. D399), waarbij de volgende stappen werden uitgevoerd: a) ROS-indicator werd vers gereconstitueerd om een ​​geconcentreerde voorraadoplossing (10 mM) te maken; b) 3-5×10⁵ cellen werden geoogst, c) eenmaal gewassen met 500 μl PBS en d) opnieuw gesuspendeerd in 300 μl PBS met de sonde om een ​​uiteindelijke werkconcentratie van 0.5 μM kleurstof te verkrijgen; e) cellen werden gedurende 37 minuten in het donker bij 10°C geïncubeerd; f) na verwijdering van de kleuroplossing werden de monsters g) tweemaal gewassen in PBS. Monsters werden verzameld door middel van flowcytometrie met behulp van een BD FACSCanto^TM II cytometer of BIO-RAD S3e Cell Sorter en analyse werd uitgevoerd met BD FACSDiva^TM (v. 9.0), ProSort^TM (v. 1.6) en FlowJo (10.8.1) software. Representatieve poortstrategie is beschikbaar in aanvullende afbeelding XNUMX. 10b-c.

Annexine V-kleuring

Levende NPC's, tijdelijk getransfecteerd met het gen van belang en gedurende 30 uur behandeld met Rotenon 24 μM, werden gekleurd met Annexine V volgens de instructies van de fabrikant (Ebioscience, cat. 88-8007-72). Cellen werden een keer gewassen in PBS, daarna een keer in lx bindingsbuffer (cat. 1-00). 0055×5⁵ cellen werden opnieuw gesuspendeerd in 200 μl 1x bindingsbuffer en geïncubeerd met 5 μl fluorochroom-geconjugeerd Annexine V (cat. 17-8007) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Cellen werden vervolgens gewassen in 500 μl 1x bindingsbuffer. Ten slotte werden de cellen opnieuw gesuspendeerd in 200 μl 1x bindingsbuffer. Flowcytometrie-analyse werd uitgevoerd met behulp van de BIO-RAD S3e Cell Sorter binnen 1 uur, waarbij monsters in het donker bij 2-8 °C werden opgeslagen. Gegevens werden geanalyseerd met ProSort^TM (v. 1.6) en FlowJo (10.8.1) software. Representatieve poortstrategie is beschikbaar in aanvullende afbeelding XNUMX. 10c.

Western Blotting

Cellen werden gewassen in koude PBS en geoogst in lysisbuffer (50 mM Hepes pH 7.8, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, 5% glycerol), vers aangevuld met 1 mM DTT, proteaseremmer (Roche, cat. 39802300 ) en fosfataseremmer (Sigma-Aldrich, cat. P5726). Monsters werden blootgesteld aan ultrageluid in een sonicator (Diagenode Bioruptor) en 15,871 minuten gecentrifugeerd bij 10 rcf om supernatant te bereiden. Eiwitconcentratie werd bepaald door Bradford-kwantificering. Voor experimenten in Fig. 1b, 2g, 4d en aanvullende afb. 1dwerd totaal eiwit (10 µg) gefractioneerd op 4-12% Nupage MOPS acrylamidegel (Life Technologies, cat. BG04125BOX/BG00105BOX) en elektroforetisch overgebracht op een PVDF-membraan (Millipore, cat. IPFL00010) in een transferoplossing (50 mM Tris -HCl, 40 mM glycine, 20% methanol, 0.04% SDS). Membranen werden vervolgens verzadigd met 5% magere droge melkpoeder (BioRad; 170-6405-MSDS) in TBST (8 g NaCl, 2.4 g Tris-HCl, 0.1% Tween20/liter, pH 7.5) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en overnacht geïncubeerd bij 4 ° C met anti-HTT (kloon 1HU-4C8) of anti-GAPDH (kloon 6C5) primair antilichaam (aanvullende tabel 2). Membranen werden vervolgens geïncubeerd met secundaire antilichamen geconjugeerd met een peroxidase, verdund in 1% melk in TBST. Pico SuperSignal West chemiluminescent reagens (Thermo Scientific, cat. 34078) werd gebruikt om membranen te incuberen en beelden werden digitaal verkregen door ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare). Niet-bijgesneden gels en numerieke waarden worden geleverd in het brongegevensbestand.

Muizen werden opgeofferd door cervicale dislocatie en weefsels werden gehomogeniseerd in lysisbuffer met 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 20 mM NaF, 2 mM Na₃VO₄ en 1:1000 proteaseremmermengsel (Sigma-Aldrich) en gesoniceerd. Voor experiment in Aanvullende Fig. 1b, 50 µg totaal eiwitlysaat van WT-muis, R6/2-muis, Q15-cellen en Q128-cellen werd geladen in een met de hand gegoten 5-11% acrylamide stapelgel en geïncubeerd met de volgende antilichamen: anti-HTT (kloon EM48) en anti -GAPDH (aanvullende tabel 2). Voor experimenten in Aanvullende Fig. 8a, d, e en g40 μg totaal eiwitlysaat werd onderworpen aan immunoblotting met de volgende antilichamen: anti-GFP, anti-ACTIN (kloon 8H10D10), anti-HTT (kloon EM48), anti-TUBULINE (kloon B-5-1-2) (aanvullende tabel 2). Membranen werden verwerkt zoals hierboven beschreven. Afbeeldingen zijn digitaal verkregen door VWR Imager CHEMI Premium of ChemiDoc XRS+ (model nr.: Universal Hood II) met Image Lab Software, BioRad (v. 6.1). Kwantificering werd uitgevoerd met behulp van Fiji 2.9.0 met achtergrondaftrekking en normalisatie op de laadcontrole (GAPDH, ACTIN of TUBULIN). Niet-bijgesneden gels worden geleverd in de brongegevensbestanden.

Immunofluorescentie

Immunofluorescentie voor MTF1-detectie in ESC's van muizen werd uitgevoerd op cellen die waren uitgeplaat op met fibronectine (Merck, cat. FC010) gecoate glazen dekglaasjes. Cellen werden gefixeerd in 4% formaldehyde (Sigma-Aldrich, cat. F8775) in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, gewassen in PBS, gepermeabiliseerd gedurende 10 minuten in PBS + 0.1% Triton X-100 (PBST) bij kamertemperatuur en geblokkeerd in PBST + 3% paardenserum (HS; Gibco, cat. 16050-122) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Cellen werden overnacht bij 4 ° C geïncubeerd met primaire antilichamen (voor details over primaire en secundaire antilichamen zie aanvullende tabel 2) in PBST + 3% van HS. Na wassen met PBST werden de cellen gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met secundaire antilichamen (Alexa, Life Technologies). Kernen werden gekleurd met DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindool; Sigma-Aldrich, cat. F6057). Afbeeldingen werden verkregen met Leica SP5 confocale microscopen. Beeldanalyse werd uitgevoerd met behulp van Fiji 2.9.0. Kwantificering van nucleaire en cytoplasmatische intensiteit werd uitgevoerd met CellProfiler-software (v4.1.3). In het kort werden kernen gedetecteerd door DAPI-kleuring. Cytoplasma werd willekeurig gedefinieerd door radiaal uitzettende kernen met 10 pixels. De verhouding van de geïntegreerde nucleaire intensiteit van het MTF1-signaal ten opzichte van de cellulaire geïntegreerde intensiteit van het MTF1-signaal (kern + cytoplasma) werd berekend en uitgezet.

Immunofluorescentieanalyse op menselijke iPSC's en NPC's werd uitgevoerd op 1% Matrigel-gecoate glazen dekglaasjes in putjes. Cellen werden gefixeerd in 4% formaldehyde (Sigma-Aldrich, cat. F8775) in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, gewassen in PBS, gepermeabiliseerd gedurende 1 uur in PBST bij kamertemperatuur en geblokkeerd in PBST + 5% HS (Gibco, cat. 16050-122) gedurende 5 uur bij kamertemperatuur. Cellen werden overnacht bij 4 ° C geïncubeerd met primaire antilichamen (voor details over primaire en secundaire antilichamen zie aanvullende tabel 2) in PBST + 3% van HS. Na wassen met PBS werden de cellen gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met secundaire antilichamen (Alexa, Life Technologies). Kernen werden gekleurd met DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindool; Sigma-Aldrich, cat. F6057). Afbeeldingen werden verkregen met Zeiss LSM900 Airyscan 2 confocale microscopen. Beeldanalyse werd uitgevoerd met behulp van Fiji 2.9.0.

RNA-isolatie, reverse transcriptie en kwantitatieve PCR

Voor cellulair lysaat werd RNA geïsoleerd met behulp van Total RNA Purification Kit (Norgen Biotek, cat. 37500) en complementair DNA (cDNA) werd gemaakt van 500 ng met behulp van M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen, cat. 28025-013), RNaseOUT (40 eenheden/µL), willekeurige primers (200 nM), dNTP's (10 mM), First-Strand Buffer 5x, DTT (0.1 M). Voor zebravislarven werd totaal RNA geïsoleerd door gebruik te maken van de fenol-chloroform-extractie. Totaal RNA werd geïsoleerd uit pools van 10 dieren met behulp van TRIzol Reagent (Life Technologies, cat. 15596026), volgens de instructies van de fabrikant voor standaard trizol-chloroform-ethanol extractieprocedure. RNase-vrij glycogeen werd gebruikt zoals voorgesteld door het protocol, om de opbrengst van de RNA-precipitatiestap te verhogen. 2 μg totaal RNA werd reverse getranscribeerd in cDNA met behulp van Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, cat. 18080044) en een mengsel van oligo(dT)18-primers (500 μg/ml); dNTP-mengsel (10 mM); DTT (0.1 M); 5x eerste strengbuffer; RNaseOUT (40 eenheden/μL).

Voor real-time PCR werd SYBR Green Master-mix (Bioline, cat. BIO-94020) gebruikt. Primers worden gedetailleerd beschreven in de aanvullende tabel 3. Technische herhalingen werden uitgevoerd voor alle kwantitatieve PCR. Voor ESC's van muizen, menselijke iPSC's en NPC's werden Gapdh en GAPDH gebruikt als endogene controle om expressie te normaliseren. Het Ct-gemiddelde van de zebravis gadh, eef1a1l1, tuba1b en b2m werd gebruikt als een endogene huishoudelijke controle voor normalisatie, vanwege de variabiliteit die werd getoond door naar de expressieniveaus van die genen te kijken. qPCR-gegevens zijn verkregen met QuantStudio™ 6&7 Flex Software 1.0 en 1.3 versie.

RNA-sequencing: bibliotheekvoorbereiding

Totaal RNA werd gekwantificeerd met behulp van de Qubit 4.0 fluorimetrische assay (Thermo Fisher Scientific). Bibliotheken werden bereid uit 125 ng totaal RNA met behulp van de NEGEDIA Digital mRNA-seq sequencing-service voor onderzoek (Negedia srl)¹⁴⁰ waaronder bibliotheekvoorbereiding, kwaliteitsbeoordeling en sequencing op een NovaSeq 6000 sequencing-systeem met behulp van een single-end, 100 cycli-strategie (Illumina Inc.).

Bio-informatica-workflow

De onbewerkte gegevens zijn geanalyseerd door de eigen NEGEDIA Digital mRNA-seq-pijplijn van Next Generation Diagnostics srl, die een opschoningsstap omvat door kwaliteitsfiltering en trimmen, afstemming op het referentiegenoom en tellen per gen^142,143. Genen werden gesorteerd door de genen te verwijderen met een totaal aantal tellingen van minder dan 5 in ten minste 3 van de 30 monsters. Na toepassing van dit filter identificeerden we 11,851 tot expressie gebrachte genen die in aanmerking kwamen voor verdere analyse.

Differentiële expressie-analyse werd uitgevoerd in de R-omgeving (v. 4.1.0) met Bioconductor (v. 3.14) die gebruik maakte van het DESeq2 R-pakket. (v. 1.34.0)¹⁴⁴ en edgeR (v. 3.36.0)¹⁴⁵. DESeq2 voert de schatting uit van groottefactoren, de schatting van de spreiding voor elk gen en past een negatief binomiaal gegeneraliseerd lineair model aan met tweezijdige Wald-statistieken. Biologische betekenis van DEG's tussen Q128 en Q15 (Fig. 1g), van DEG's tussen Q128_Mtf1 en Q128 (aanvullend Fig. 5b) en van genen die zijn gered door Mtf1 (Fig. 5c) werd onderzocht door Gene Ontology (GO) termverrijkingsanalyse met behulp van Enrichr-software (v. 3.0) en inclusief de categorieën biologische processen (BP) (2021) en moleculaire functie (MF) (2021).

Om de verrijking van celpopulatieproliferatie uit te voeren (GO:0008283 en¹⁴⁶) en apoptose (R-HSA-109581 en WP1351) gensignaturen in Q128- en Q15-cellijnen die tot overexpressie komen Mtf1gebruikten we Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)-software (v 4.3.2)¹⁴⁷. Pre-gerangschikte lijsten met genensets werden gegenereerd op basis van log₂ fold-change (FC) waarden zoals verkregen door de differentiële expressie-analyse tussen Q128_Mtf1 versus Q128 en Q15_Mtf1 versus Q15.

Motif-verrijkingsanalyse werd uitgevoerd met behulp van de Motif Analysis-tool van de Regulatory Genomics Toolbox-suite (https://reg-gen.readthedocs.io). Mtf1 MRE is verkregen uit de Jaspar-database (9e versie, http://jaspar.genereg.net/)¹⁴⁸. Het commando "rgt-motifanalysis matching" werd gebruikt om te zoeken naar bindingsplaatsen op het promotorgebied van alle genen van belang; vervolgens werd "rgt-motievenanalyse-verrijking" gebruikt om een ​​Fisher's exact-test uit te voeren om te evalueren of het aandeel bindingsplaatsen in de van belang zijnde genenset hoger is dan verwacht door toeval.

Een representatieve biologische replica van RNA-sequencinggegevens en Mtf1 MRE werden gevisualiseerd als sporen in de Integrated Genomics Viewer (IGV v. 2.16.0) en getoond in Fig. 5h.

Vulkaanplots en scatterplots werden geproduceerd met log₂ FC en -log₁₀ p-value door gebruik te maken van de ggscatter-functie van het ggpubr R-pakket (v. 0.4.0.5). Heatmaps zijn gemaakt met behulp van CPM-waarden met de pheatmap-functie van pheatmap R-pakket (v. 1.0.12).

Uitlijning van Mtf1-orthologen

De Mtf1 sequentie-uitlijning werd uitgevoerd met behulp van de Clustal Omega-software (v1.2.4, https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)¹⁴⁹. De identiteit tussen de sequenties werd berekend met behulp van het Sequence Manipulation Suite-programma (https://www.bioinformatics.org/sms2/ident_sim.html).

Metaal analyse

Na een conditioneringsbehandeling van 48 uur, 10⁷ Q15- en Q128-cellen werden verzameld, gecentrifugeerd in Eppendorf-buizen, het supernatant werd verwijderd en de celpellets werden bewaard bij -80 ° C. Onmiddellijk voor de analyse werden de cellen ontdooid en opnieuw gesuspendeerd in geconcentreerd HNO₃ (68%), 1 ml toegevoegd aan elk monster. Na volledige oplossing hebben we 2 ml ultrapuur water toegevoegd en het monster volledig gemineraliseerd door middel van microgolfverwarming, met behulp van een zeer efficiënte hogedrukmicrogolfreactor (Ultrawave, Milestone, Bergamo, Italië). Dezelfde procedure werd toegepast op het kweekmedium, voor en na de conditioneringsbehandeling. De kalibratiecurven voor de kwantificering van metalen werden verkregen door zes standaardoplossingen te bereiden in verschillende concentraties (0.005-0.010-0.025-0.050-0.100-0.200 ppm), gebruikmakend van gecertificeerde multi-element en single-element standaarden (Agilent). Alle monsters werden vervolgens gefiltreerd door een 0.20 µm spuitfilter. De metaalanalyse, met de verstuiving en ionisatie van de monsters verkregen in een argonplasma, werd uitgevoerd door Inductively Coupled Plasma – Optical Emission Spectrometry (ICP-OES, mod 5110, Agilent).

Generatie van Zebrafish HD-model

ZvH-zebravissen werden gegenereerd door micro-injectie in eencellige embryo's van mRNA dat codeert voor het eerste exon van menselijke HTT inclusief 74Q of 16Q, gefuseerde in-frame naar eGFP-coderingssequentie. Q74eGFP en Q16eGFP werden gekloneerd in pCS2+ plasmide om de in vitro transcriptie mogelijk te maken. pCS2_Mtf1 en pCS2_mCherry plasmiden werden ook gegenereerd om te verkrijgen Mtf1 en mKers mRNA's gebruikt voor injecties in ZvH zebravisembryo's.

Voor RNA in vitro transcriptie werd 2.5 μg pCS2_Q74eGFP, pCS2_Q16eGFP, pCS2_Mtf1 en pCS2_mCherry gelineariseerd door een nachtelijke digestie bij 37 °C met HF-Not I (New England Biolabs, cat. R3189S). Het digestievolume werd vervolgens geconcentreerd met de DNA Clean & Concentrator-kit (Zymo Research, cat. D4003) en gebruikt voor de afgedekte transcriptiereactie (mMESSAGE mMACHINETM SP6 Transcription Kit, Thermo Fisher Scientific, cat. AM1340) met SP6 RNA-polymerase. Na verwijdering van de DNA-template door DNase-behandeling (Thermo Fisher Scientific, cat. AM2238) gedurende 15 minuten bij 37°C, werd RNA gezuiverd door middel van fenol-chloroform-extractie (zoals besproken in de paragraaf 'RNA-isolatie, reverse transcriptie en kwantitatieve PCR'). RNA werd gekwantificeerd door Nanodrop ND-1000 en vervolgens naar behoefte verdund in een mix van 10% Danieau-buffer [8 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO₄, 0.6 mM Ca (NR₃)₂, 2.5 mM HEPES, pH 7.6], 10% fenolrood (Merck, cat. 1072410025) en RNase-vrij water.

Om de injectiedosis te selecteren die het hoogste aantal misvormingen met het laagste sterftecijfer veroorzaakte, injecteerden we toenemende doses Q74eGFP-mRNA variërend van 150 tot 1000 pg/embryo en fenotypisch scoorden we 24 hpf-embryo's. Zodra de dosis van 250 pg/embryo was vastgesteld, werden embryo's onder een lichtmicroscoop geïnjecteerd met in vitro getranscribeerde mRNA's. Micro-geïnjecteerde embryo's werden vervolgens overgebracht naar viswater en geïncubeerd bij 28 °C. Onbevruchte eieren werden 4 uur na micro-injectie herkend en weggegooid. 24 hpf kikkervisjes werden gedechorioneerd met behulp van speciale naalden onder een lichtmicroscoop.

Gehele montage kleuringen

Geïnjecteerde embryo's werden verdoofd met tricaïne en geïmmobiliseerd in 1.5% methylcellulose of 2% laagsmeltende agarose en geanalyseerd met behulp van een Leica M165FC fluorescentiemicroscoop. Confocale zebravisbeelden werden verkregen met een Nikon C2 H600L confocale microscoop.

Voor Acridine Orange hemi (zinkchloride) zout in vivo kleuring (Merck, cat. A6014), werden 24 hpf-embryo's gedechorioneerd, overgebracht naar een plaat met 6 putjes en geïncubeerd in ongeveer 2 ml Acridine Orange (20 μg / ml) per putje in viswater gedurende 15 minuten bij 28 °C. De Acridine-oplossing werd vervolgens verwijderd en de embryo's werden driemaal gewassen met 1 ml viswater. Voordat ze door een fluorescentiemicroscoop op een glasplaatje werden geobserveerd, werden de kikkervisjes verdoofd met tricaïne.

Voor de TUNEL-test werden ApopTag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit (Merck, cat. S7110) en collagenase (Merck, cat. C9891) gebruikt. 7 embryo's - 30 uur na micro-injectie per aandoening werden in een Eppendorf geplaatst, verdoofd met tricaïne en overnacht gefixeerd in 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 ° C. Vervolgens werd PFA verwijderd en werden de monsters onder schudden gewassen met PBS (3 keer, elk 10 minuten). Embryo's werden gedehydrateerd door een reeks methanoloplossingen variërend van 10% tot 100% en overnacht ingevroren bij -20 ° C. Vervolgens werden de embryo's gerehydrateerd met een reeks van 70-50-30% methanoloplossingen en gedurende 20 minuten onder schudden gewassen met PBS met Tween-10. Daarna werd gedurende 8 minuten onder schudden collagenase aangebracht en de overmaat werd weggewassen door PBS met Tween-20 wasstappen (3 keer, elk 5 minuten). Monsters werden gedurende 1 uur in de equilibratiebuffer onder schudden geïncubeerd, daarna gedurende 2 uur bij 37°C in werksterkte TdT. De reactie werd gestopt door de monsters tweemaal te wassen in de werksterkte Stop/Wash-buffer. Vervolgens was er een blokkeerstap van 1 uur met PBS met Tween-20 onder schudden, en daarna werden de embryo's overnacht geïncubeerd in een Working Strength anti-digoxigenine conjugaatoplossing bij 4°C in het donker. De ochtend erna werd de antilichaamoplossing verwijderd, monsters werden gewassen met PBS (4 keer, elk 10 minuten) en geanalyseerd met een confocale microscoop. Voorste structuren van de zebravislarven werden gescand in 70 stapels van elk 3.475 μm, die hun volledige diepte besloegen. We kwantificeerden de fracties van het fluorescerende positieve gebied over het totale gebied (exclusief het dooiergebied). Voor kwantificeringsanalyses werden alle afbeeldingen verkregen met dezelfde belichtingsparameters en verwerkt met behulp van Fiji-software (v2.9.0). Statistische analyses zijn uitgevoerd met Past (v.4.03) en Prism (v.9.5.0).

AAV-PHP.eB vectorinjectie, muisfenotypering en weefselverzameling

AAV-PHP.eB-virusdeeltjes werden geproduceerd en getitreerd in het laboratorium van Broccoli, zoals eerder beschreven⁷⁵. Deze virale vector werd gemodificeerd om onder controle van de Ef-1ɑ-promoter het kandidaat-gen tot expressie te brengen Mtf1 of eGFP als controle. Vasculaire injectie werd uitgevoerd in een houder die de staart in een verwarmde groef plaatste. De staart werd afgeveegd met alcohol en vervolgens intraveneus geïnjecteerd. WT- en R6/2-muizen werden gerandomiseerd in groepen en op een leeftijd van 4.2 weken in de staartader geïnjecteerd. Na injectie werden alle muizen tweemaal per week gewogen. Fenotypering werd tweemaal per week uitgevoerd, blind voor genotype en behandeling. Het evenwicht en de motorische coördinatie werden beoordeeld door middel van de Rotarod-test en de Horizontale Laddertaak. Totaal DNA werd geïsoleerd uit dierlijke weefsels (cortex en striatum) met behulp van de Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kits (QIAGEN, cat. 9504).

Veeteelt

Alle zebravisexperimenten werden uitgevoerd in de Fish Facility van de afdeling Biologie van de Universiteit van Padova. Zebravislarven werden maximaal drie dagen gehouden in petrischalen met viswater (60 mg Instant Ocean, cat. SS15-10, per liter gedestilleerd water) bij neutrale pH bij 28 °C, volgens standaardprocedures (http://ZFIN.org).

Bij IRCCS Neuromed werden muizenkolonies opgericht. Kweekparen van de R6/2-lijn van transgene vrouwelijke muizen [stamnaam: B6CBA-tgN (HDexon1) 62Gpb/1 J] met ~Er werden 160 ± 10 CAG-repeat-uitbreidingen gekocht bij de Jackson Laboratories. Muizen werden gehuisvest onder standaardomstandigheden (22 ± 1 ° C, 60% relatieve vochtigheid, 12 uur licht / donker schema, 3-4 muizen / kooi, met vrije toegang tot voedsel en water). Mannelijke R6/2-muizen (5-6 weken oud) werden gekruist met vrouwelijke B6CBA WT-muizen (5-6 weken oud) voor kolonieonderhoud; de resulterende WT- en R6/2-muizen werden gebruikt voor alle experimenten die in dit onderzoek werden uitgevoerd. Een volledige lijst van muizen die in dit onderzoek zijn gebruikt, met vermelding van leeftijd, geslacht, behandelingen en metingen, wordt vermeld in de aanvullende tabel 4. Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van de IRCCS Neuromed Animal Care Review Board en door Istituto Superiore di Sanità (ISS-vergunningsnummer: 548/2022-PR) en werden uitgevoerd volgens de richtlijn 2010/63/EU voor dierproeven.

Testen van motorisch gedrag

Alle gedragstesten zijn uitgevoerd tijdens de lichtfase van de licht/donkercyclus. Muizen werden voor en na de behandeling op de aangegeven tijdstippen getest. Voordat ze werden getraind en getest, ondergingen muizen een periode van gewenning aan de testruimte en apparatuur. Alle muizen kregen gedurende twee opeenvolgende dagen training op elk instrument en elke taak voordat ze metingen van motorisch gedrag uitvoerden. Muizen werden getest met een vaste snelheid (0.1 rcf) op een rotarod-apparaat gedurende 1 minuut. Elke muis werd getest in drie opeenvolgende proeven van elk 1 minuut, met 1 minuut rust tussen de proeven. De tijd die in elk van de drie proeven op de rotarod werd doorgebracht, werd gemiddeld om de totale tijd voor elke muis te geven. Bij de horizontale laddertaak liepen de muizen spontaan over een horizontale ladder met variabele en onregelmatige afstanden tussen de sporten. In elke testsessie werden de muisprestaties geëvalueerd met behulp van een gevestigd scoresysteem voor bezoekersaantallen¹⁵⁰, wat een kwalitatieve en kwantitatieve evaluatie van de plaatsing van de voor- en achterpoten op de laddersporten mogelijk maakt. Alle motortesten werden uitgevoerd door dezelfde onderzoeker die gedurende de hele analyse blind was voor het genotype van de muis en de experimentele groep.

Sluitingsanalyse

De klemscore wordt bepaald over 30 seconden. In het bijzonder werden muizen vanaf een hoogte van 50 cm aan hun staart opgehangen en een reactie op het omklemmen van ledematen werd gedefinieerd als het terugtrekken van een ledemaat naar de romp gedurende meer dan 2 seconden. De volgende scores werden gebruikt: 0 (afwezigheid van omklemmen), 0.5 (terugtrekken van een enkel ledemaat), 1 (terugtrekken van twee willekeurige ledematen), 1.5 (terugtrekken van drie willekeurige ledematen), 2 (terugtrekken van alle vier de ledematen).

Dihydroethidium (DHE)

WT- en R6/2-muizen werden opgeofferd door cervicale dislocatie. Hersenen werden verwijderd en bijgesneden door de reukbollen en het ruggenmerg te verwijderen. De resterende hersenen werden verwerkt en ingebed in paraffinewas, coronale secties van 10 µm werden gesneden op een RM 2245 microtoom (Leica Microsystems) en dreef in een waterbad van 40 ° C met gedestilleerd water. Secties werden overgebracht op objectglaasjes die geschikt waren voor immunohistochemie en een nacht bij kamertemperatuur laten drogen. Monsters werden gedurende 30 minuten gedeparaffineerd in xyleen, overgebracht naar 100% alcohol gedurende 10 minuten en daarna eenmaal door respectievelijk 95%, 70% en 50% alcohol gedurende elk 10 minuten, tweemaal gewassen in PBS. In situ productie van superoxidevorming werd gedetecteerd door fluorescentie met DHE (Sigma-Aldrich, cat. D7008). Monsters werden geïncubeerd met DHE (2 µM) in een tegen licht beschermde bevochtigde kamer bij 37°C gedurende 30 minuten. Objectglaasjes werden tweemaal gespoeld met PBS en bekeken onder de microscoop. Voor elke kleuring werden vier muizen per experimentele groep gebruikt en werden drie coronale secties voor elk dier verkregen met de Nikon ECLIPSE Ni-microscoop en geanalyseerd door NIS-Elements Image Software (v. 4.40, Nikon) en Fiji-software 2.9.0.

mHTT aggregeert immunokleuring

WT- en R6/2-muizen werden opgeofferd door cervicale dislocatie. Hersenen werden verwijderd en bijgesneden door de reukbollen en het ruggenmerg te verwijderen. De resterende hersenen werden verwerkt en ingebed in paraffinewas, coronale secties van 10 µm werden gesneden op een RM 2245 microtoom (Leica Microsystems) en dreef in een waterbad van 40 ° C met gedestilleerd water. Secties werden overgebracht op objectglaasjes die geschikt waren voor immunohistochemie en een nacht bij kamertemperatuur laten drogen. Monsters werden gedurende 30 minuten gedeparaffineerd in xyleen, overgebracht naar 100% alcohol gedurende 10 minuten en vervolgens eenmaal door respectievelijk 95%, 70% en 50% alcohol gedurende elk 10 minuten, tweemaal gewassen in PBS. Om het antigene epitoop te ontmaskeren, werd antigeen-terugwinning uitgevoerd met behulp van de citraatbuffermethode (incubeer met citraatbuffer 10 mM, pH 6.0 bij 95-100 °C gedurende 15 minuten en laat de objectglaasjes vervolgens 15 minuten afkoelen). Objectglaasjes werden twee keer gewassen met PBS, permeabel gemaakt in TBS-Triton 0.1% gedurende 10 minuten, vervolgens geïncubeerd in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur met blokkeerbuffer (paardenserum 10% in PBS) gedurende 1 uur. De blokkeerbuffer werd verwijderd en de objectglaasjes werden 's nachts bij 4 ° C in een bevochtigde kamer geïncubeerd met behulp van een muis-anti-HTT-antilichaam (kloon EM48, voor details zie aanvullende tabel 2). Na drie keer wassen met PBS werden de cellen 1 uur geïncubeerd met secundaire antilichamen in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Kernen werden gekleurd met DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindool; Sigma-Aldrich, cat. F6057). Vier muizen per experimentele groep werden gebruikt en drie coronale secties voor elk dier werden verkregen met de Nikon ECLIPSE Ni-microscoop en geanalyseerd door NIS-Elements Image Software (v. 4.40, Nikon) en Fiji-software 2.9.0.

Statistieken en reproduceerbaarheid

Er is geen statistische methode gebruikt om de steekproefomvang vooraf te bepalen, maar onze steekproefomvang is vergelijkbaar met die welke gewoonlijk worden gebruikt in ons onderzoeksgebied. Er zijn geen gegevens uitgesloten van de analyses. De gegevensdistributie werd als normaal beschouwd, maar dit werd niet formeel getest. P-waarden voor experimenten met herhaalde metingen (Fig. 1c, Fig. 4f, Fig. 7b (links), 7c (links) en 7g, Fig. 8d, fAanvullende Fig. 1eAanvullende Fig. 4a, cAanvullende Fig. 8cAanvullende Fig. 9c) werden berekend met Two-way Repeated Measure ANOVA met Bonferroni's correctie. Voor experimenten met cellijnen hebben we willekeurig een fractie van elke celpopulatie toegewezen aan verschillende biologische replicaten. Voor de analyse van immunokleuring en flowcytometriegegevens hebben we willekeurige velden of willekeurige fracties van cellen geanalyseerd. Andere soorten experimenten waren niet gerandomiseerd. Gegevensverzameling en -analyse zijn niet blind uitgevoerd voor de omstandigheden van de experimenten, maar gegevensanalyses zijn uitgevoerd met identieke parameters en software. Analyse van het motorische gedrag van muizen werd blind uitgevoerd. Gegevensrepresentatie en statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van R-software (v. 4.0.0 en v. 4.1.0) en PAST (v4.03), tenzij anders vermeld. Alle staven, foutstaven en boxplots zijn gedefinieerd in figuurlegenda's. Het aantal biologische herhalingen en onafhankelijke experimenten, beide >2, wordt aangegeven in de legenda's van de figuren. De gebruikte statistische tests zijn aangegeven in figuurlegenda's. Alle qPCR-experimenten werden uitgevoerd met drie technische replica's. De belangrijkste experimentele resultaten zijn verkregen door 2 onafhankelijke operators.

Rapportage samenvatting

Nadere informatie over onderzoeksontwerp is beschikbaar in de Samenvatting van de rapportage over de natuurportfolio gekoppeld aan dit artikel.

• Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
• PlatoData.Network Verticale generatieve AI. Versterk jezelf. Toegang hier.
• PlatoAiStream. Web3-intelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
• PlatoESG. Automotive / EV's, carbon, CleanTech, Energie, Milieu, Zonne, Afvalbeheer. Toegang hier.
• BlockOffsets. Eigendom voor milieucompensatie moderniseren. Toegang hier.
• Bron: https://www.nature.com/articles/s41467-023-39552-9