Dieren

Experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Protocollen werden goedgekeurd door de Lokale Dierethische Commissie (Commissie Charles Darwin nr. 5, registratienummers 9529 en 26889) en uitgevoerd in overeenstemming met Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement. Long-Evans mannelijke ratten tussen 2 en 12 maanden oud en WT mannelijke muizen (C57BL / 6J) van 9 weken oud werden verkregen van Janvier Laboratories; P23H (lijn 1) mannelijke transgene ratten (9-22 maanden) werden lokaal grootgebracht.

Plasmideklonering en AAV-productie

Plasmiden die de E. coli mscL sequentie in de WT-vorm en met de G22S-mutatie werden verkregen van Francesco Difato (Addgene plasmiden #107454 en #107455)²⁸. Om zich te richten op RGC's, de SNCG-promotor³¹ werd ingebracht in een AAV-backbone-plasmide dat de mscL sequentie gefuseerd aan het tdTomato-gen en het Kir2.1 ER-exportsignaal, om expressie aan het plasmamembraan te stimuleren. Een AAV2.7m8-vector werd gebruikt voor intravitreale toediening. Voor het richten op neuronen in de V1-corticale lagen werd de SNCG-promoter vervangen door de CamKII-promoter en werd een AAV9.7m8-vector gekozen. Recombinante AAV's werden geproduceerd door de plasmide-cotransfectiemethode en de resulterende lysaten werden gezuiverd door iodixanol-zuivering³¹.

Amerikaanse stimulans

Er werden drie gefocusseerde Amerikaanse transducers met verschillende centrale frequenties gebruikt: 0.50 MHz (diameter, Ø = 1.00″ = 25.4mm; brandpuntsafstand, f = 1.25″ = 31.7 mm) (V301-SU, Olympus), 2.25 MHz (Ø = 0.50″ = 12.7mm, f = 1.00″ = 25.4 mm) (V306-SU, Olympus) en 15.00 MHz (Ø = 0.50″ = 12.7mm, f = 1.00″ = 25.4 mm) (V319-SU, Olympus), overeenkomend met numerieke openingen van F/Ø = 1.25 en 2.00. Akoestische velden die door die drie gefocuste transducers worden uitgestraald, worden weergegeven in Fig. 1 (simulaties) en uitgebreide gegevens Fig. 3 (experimentele metingen). Een TiePie Handyscope (HS5, TiePie Engineering) werd gebruikt om de stimulusgolfvorm te produceren, die vervolgens door een 80 dB RF-vermogensversterker (VBA 230-80, Vectawave) werd geleid die op de transducer was aangesloten. Transducerdrukoutputs (druk bij focus, driedimensionale (3D) drukkaarten) werden gemeten in een ontgaste watertank met een Royer-Dieulesaint heterodyne interferometer⁴⁷. US-stimuli gebruikt voor ex vivo en in vivo stimulatie hadden de volgende kenmerken: 1 kHz pulsherhalingsfrequentie met een duty cycle van 50%, sonicatieduur tussen 10 en 200 ms en interstimulusinterval tussen 0.01 en 2.00 s. Akoestische piekdrukken varieerden van 0.11 tot 0.88 MPa, 0.30 tot 1.60 MPa en 0.20 tot 1.27 MPa voor respectievelijk de 0.50, 2.25 en 15.00 MHz-transducers. De overeenkomstige geschatte waarden voor ruimtelijke piekpulsgemiddelde intensiteit (Isppa) waren 0.39–25.14, 2.92–83.12 en 1.30–52.37 W cm^-2.

Intravitreale genafgifte en beeldvorming van het netvlies

Ratten werden verdoofd⁴⁸ en AAV-suspensie (2 µl), die tussen 8 en 14 x 10 bevat¹⁰ virusdeeltjes, werd geïnjecteerd in het midden van de glasvochtholte. Een maand later werd tdTomato-fluorescentiebeeldvorming uitgevoerd op de geïnjecteerde ogen, met een MICRON IV-microscoop voor retinale beeldvorming (Phoenix Research Laboratories) en Micron Discover v.2.2.

MEA-opnames

Stukjes netvlies werden platgedrukt op een filtermembraan (Whatman, GE Healthcare Life Sciences) en geplaatst op een MEA (elektrodediameter, 30 µm; afstand, 200 µm; MEA256 200/30 iR-ITO, MultiChannel Systems) gecoat met poly-l-lysine (0.1%, Sigma), met RGC's tegenover de elektroden³¹. AMPA / kaïnaatglutamaatreceptorantagonist 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dion (CNQX, 25 μM, Sigma-Aldrich), de NMDA glutamaatreceptorantagonist [3H]3-(2-carboxypiperazin-4-yl) propyl -1-fosfonzuur (CPP, 10 μM, Sigma-Aldrich) en een selectieve groep III metabotrope glutamaatreceptoragonist, l-(+)-2-amino-4-fosfonoboterzuur (LAP4, 50 μM, Tocris Bioscience), werd in een bad aangebracht via de perfusielijn. Lichtstimuli werden afgeleverd met een digitaal microspiegelbeeldscherm (Vialux; resolutie, 1,024 × 768) gekoppeld aan een witte lichtgevende diodelichtbron (MNWHL4, Thorlabs) gericht op het fotoreceptorvlak (bestraling, 1 μW cm^-2). Amerikaanse transducers werden gekoppeld aan een op maat gemaakte koppelingskegel gevuld met ontgast water en gemonteerd op een gemotoriseerd podium (PT3/M-Z8, Thorlabs) orthogonaal boven het netvlies geplaatst. Het gereflecteerde signaal van de MEA-chip en het netvlies werd gedetecteerd met een US key device (Lecoeur Electronique). De afstand tussen het netvlies en de transducer was gelijk aan de brandpuntsafstand van de transducer; dit werd geverifieerd met de vliegtijd van het gereflecteerde signaal. Van RGC-opnames met een 252-kanaals voorversterker en MC_Rack v. 4.6.2 (MultiChannel Systems), werden spikes gesorteerd met Spyking CIRCUS 0.5-software⁴⁹. RGC-reacties werden geanalyseerd met aangepaste scripts geschreven in MATLAB (MathWorks 2018b) voor classificatie als AAN, AAN-UIT of UIT, met de responsdominantie-index⁵⁰. Latenties werden berekend als de tijd tussen het begin van de stimulus en het maximum van de afgeleide van de spike density function (SDF). Twee klassen US-reagerende cellen werden geïdentificeerd op basis van latentie - SL en LL - door een drempel vast te stellen die gelijk is aan het minimum van de latentieverdeling van de reacties van NT-cellen op US (45 ms). We hebben de piekwaarde bepaald A van de SDF voor de berekening van de responsduur, die werd gedefinieerd als het tijdsinterval tussen de twee tijdstippen waarvoor de SDF gelijk was aan A/e (waar A is piekdepolarisatie en e is het getal van Euler). De Fano-factor, die de variabiliteit van het aantal pieken kwantificeert, werd berekend als de verhouding van de variantie van het aantal pieken tot het gemiddelde. De Euclidische afstand tussen twee geactiveerde cellen werd gewogen volgens de maximale vuursnelheid van de cellen. De verhouding van het aantal geactiveerde cellen tot de grootte van het gestimuleerde gebied op de MEA-chip werd berekend rekening houdend met de grootte van het Amerikaanse brandpunt voor 2.25 en 15.00 MHz en de grootte van de MEA voor 0.50 MHz, omdat het brandpunt groter was dan de MEA voor deze frequentie. Het midden van de respons werd geschat door de maximale vuursnelheid van elke cel te wegen op basis van de afstand tot andere reagerende cellen, en de verplaatsing van de respons werd berekend als de Euclidische afstand tussen twee centrum-van-responsposities.

Intracraniale injecties

AAV-suspensies werden geïnjecteerd in de rechterhersenhelft op twee verschillende locaties bij ratten (2.6 mm ML, 6.8 mm AP en 3.1 mm ML, 7.2 mm AP vanaf de bregma) of op één locatie bij muizen (2.5 mm ML, 3.5 mm AP vanaf de bregma)⁴⁸. Voor ratteninjecties is de suspensie (200 nl met 0.2–8.0 × 10¹⁵ virale deeltjes) werd geïnjecteerd op drie verschillende diepten (1,100, 1,350 en 1,500 µm vanaf het corticale oppervlak) met een microspuitpompcontroller (Micro4, World Precision Instruments) die werkte met een snelheid van 50 nl min^-1 en 10 µl Hamilton-spuit. Bij muizen werd de AAV-suspensie (1 µl met 0.2–8.0 × 10¹⁵ virale deeltjes) werd geïnjecteerd op 400 µm van het corticale oppervlak met een snelheid van 100 nl min^-1.

In vivo extracellulaire opnames

Een maand na AAV-injecties werd een kleine craniotomie (5 × 5 mm²) werd uitgevoerd boven V1 in de rechterhersenhelft⁴⁸. De tdTomato-fluorescentie werd gecontroleerd met een MICRON IV retinale beeldmicroscoop en Micron Discover v. 2.2 (Phoenix Research Laboratories). Een µEcog-elektrode-array met 32 ​​plaatsen (elektrodediameter, 30 µm; elektrode-afstand, 300 µm; FlexMEA36, MultiChannel Systems) werd over het getransfecteerde gebied of in een vergelijkbare zone voor controleratten geplaatst. MEA-opnamen werden uitgevoerd met een siliciummicrosonde met 16 plaatsen die onder een hoek van 45° ten opzichte van het hersenoppervlak was gekanteld (elektrodediameter, 30 µm; afstand 50 µm; A1x16-5mm-50-703, NeuroNexus Technologies) en MC_Rack v. 4.6.2. De MEA werd 1,100 µm in de cortex voortbewogen met een drie-assige micromanipulator (Sutter Instruments). Amerikaanse transducers werden aan de hersenen gekoppeld met een op maat gemaakte koppelingskegel gevuld met ontgast water en Amerikaanse gel op een gemotoriseerd podium. De afstand tussen de cortex en de transducer was gelijk aan de brandpuntsafstand van de transducer. Visuele prikkels werden gegenereerd door een met wit licht gecollimeerde lichtemitterende diode (MNWHL4, Thorlabs) die op 15 cm afstand van het oog was geplaatst (4.5 mW cm^-2 op het hoornvlies). Opnames werden gedigitaliseerd met 32-kanaals en 16-kanaals versterkers (model ME32/16-FAI-μPA, MultiChannel Systems). De µEcog-opnamen werden geanalyseerd met op maat ontwikkelde MATLAB-scripts en de MEA-opnames werden geanalyseerd met Spyking CIRCUS-software en op maat ontwikkelde MATLAB-scripts. De responsduur werd berekend als het interval tussen de twee tijdstippen waarop de corticaal opgewekte potentiaal gelijk was aan A/e. Het geactiveerde gebied werd gedefinieerd als het gebied van de pseudokleuractiveringskaart waarover de piekdepolarisatie het achtergrondruisniveau, berekend als 2 × sd van het signaal, overschreed. Het responscentrum werd geschat door de piekdepolarisatie van elke elektrode te wegen op basis van de afstand tot de andere elektroden. De relatieve verplaatsing ervan bij het verplaatsen van de Amerikaanse transducer werd berekend als de Euclidische afstand van de twee posities. Voor intracorticale opnames werd de cellatentie geschat als de tijd tussen het begin van de stimulus en het maximum van de afgeleide van SDF.

Chirurgie voor in vivo gedragstesten

C57BL6J-muizen werden subcutaan geïnjecteerd met buprenorfine (0.05 mg kg^-1) (Buprécare, Axience) en dexamethason (0.7 mg kg^-1) (Dexazon, Virbac). Dieren werden verdoofd met isofluraan (5% inductie en 2% onderhoud, in een lucht/zuurstofmengsel) en de kop werd geschoren en schoongemaakt met een antiseptische oplossing. De dieren werden met hun kop gefixeerd op een stereotactisch frame met een isofluraanafgiftesysteem en oogzalf, en een zwarte tissue werd over de ogen aangebracht. De lichaamstemperatuur werd op 37°C gehouden. Na een lokale injectie met lidocaïne (4 mg kg^-1) (Laocaïne, Centravet), werd er een sneetje in de huid gemaakt. Na een kleine craniotomie (ongeveer 5.0 × 5.0 mm) werden twee schroeven in de schedel vastgezet²) werd uitgevoerd boven V1 in de rechterhersenhelft (0.5 mm stalen boor) en er werd een cortexbuffer aangebracht. De cortex was bedekt met een TPX-plastic folie (125 µm dik) en afgedicht met dentaal acrylcement (Tetric Evoflow). Voor gedragsexperimenten werd vervolgens een metalen hoofdbalk (PhenoSys) voor hoofdfixatie op de schedel op de linkerhersenhelft gelijmd met tandcement (FujiCEM 2). Dieren werden in een herstelkamer geplaatst, met een subcutane injectie van fysiologisch serum en zalf op de ogen (Ophtalon, Centravet). Buprenorfine werd geïnjecteerd tijdens monitoring na de operatie.

Gedragstests voor muizen

Muizen werden op een waterbeperkingsschema geplaatst totdat ze ongeveer 80-85% van hun gewicht bereikten. Na gewenning aan de testomstandigheden³⁶, werden muizen getraind om op een LS te reageren door een vrijwillige detectietaak uit te voeren: het likken van een waterhoos (stompe naald van 18 gauge, ongeveer 5 mm van de mond) als reactie op witlicht full-field stimulatie (200 en 50 ms lang) van het linkeroog (verwijd met tropicamide, Mydriaticum Dispersa) gedurende 35 proeven per stimulatieduur en dus 70 proeven per dag. Water (~ 4 μl) werd automatisch afgegeven 500 ms nadat het licht was ingeschakeld, via een gekalibreerd watersysteem. Het gedragsprotocol en de likdetectie werden aangestuurd door een op maat gemaakt systeem³⁶. De volgende vier dagen (tweedaagse pauze tijdens het weekend) werden US-stimulaties afgegeven op V1 gedurende 50 ms bij drie verschillende drukwaarden (0.2, 0.7 en 1.2 MPa). Deze drukwaarden werden elke dag in een andere volgorde afgeleverd (elk 35 proeven). De intertriale intervallen varieerden willekeurig en varieerden tussen 10 en 30 s. De 15 MHz US-transducer werd aan de hersenen gekoppeld met een op maat gemaakte koppelkegel gevuld met water en US-gel. Het slagingspercentage werd berekend door het aantal proeven te tellen waarin de muizen anticiperende likken uitvoerden (tussen het begin van de stimulus en het openen van de waterklep). De anticiperende liksnelheid (fig. 6e) voor de sessie werd berekend door aftrekking van de anticiperende liksnelheid van een proef, de spontane liksnelheid (berekend op alle 1 s tijdvensters vóór het begin van elke individuele stimulus (Fig. 6a) voor alle proeven) en vermenigvuldigen met het slagingspercentage. De liklatentie werd berekend door de tijd tot de eerste anticiperende likbeurt na het begin van de stimulus te bepalen. De muizen die voor analyse werden bewaard, vertoonden een slagingspercentage van meer dan of gelijk aan 60% op de vierde dag na LS. Vervolgens werden lichte of US-sessies die dwangmatig likgedrag vertoonden, uitgesloten op basis van de uitbijter-identificatie gemaakt met behulp van de ROUT-methode (Q = 1%) op de spontane likfrequentie van de sessie, waarbij het gemiddelde wordt genomen van de metingen van alle proeven van de sessie in het tijdvenster van 1 s vóór het begin van de stimulus van de proef.

Immunohistochemie en confocale beeldvorming

Monsters werden overnacht bij 4 ° C geïncubeerd met een monoklonaal anti-RBPMS-antilichaam (1: 500, konijn; ABN1362, Merck Millipore) voor het netvlies³¹, met een monoklonaal anti-NeuN-antilichaam (1:500, muis, kloon A60; MAB377, Merck Millipore) voor hersencoupes⁴⁸. De secties werden vervolgens geïncubeerd met secundaire antilichamen geconjugeerd met Alexa Fluor 488 (1: 500, ezel-antimuis en ezel-antikonijn IgG 488, polyklonaal; respectievelijk A-21202 en A-21206, Invitrogen) en DAPI (1: 1,000 ; D9542, Merck Millipore) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Een Olympus FV1000 confocale microscoop met × 20 objectief (UPLSAPO 20XO met een numerieke apertuur van 0.85) werd gebruikt om de beelden van plat gemonteerde netvliezen en hersensecties te verkrijgen (FV10-ASW v. 4.2 software).

Op de confocale afbeeldingen verwerkt met Fiji (ImageJ v. 1.53q), werden RBPMS- en NeuN-positieve cellen automatisch geteld met de plug-in 'deeltjes analyseren'. De cellen werden handmatig geteld door twee verschillende gebruikers, met de 'celteller'-plug-in. Kwantificering werd uitgevoerd door confocale stapels te verwerven in ten minste vier willekeurig gekozen getransfecteerde gebieden van 0.4 mm² (Uitgebreide gegevens Afb. 1). Voor V1-neuronen werd voor elk dier de sagittale hersenplak met de grootste tdTomato-fluorescentiezone geselecteerd. Een interessegebied werd handmatig gedefinieerd in V1 en de kwantificaties werden uitgevoerd in ten minste zes willekeurig gekozen gebieden van 0.4 mm².

Door de VS geïnduceerde simulaties van weefselverwarming

Er werd een drievoudig proces gebruikt voor de schatting van thermische effecten: (1) simulatie van de akoestische velden gegenereerd door de drie transducers, met realistische akoestische parameters; (2) verificatie dat niet-lineaire akoestiek geen belangrijke rol speelde bij warmteoverdracht; en (3) realistische simulaties van warmteoverdracht en temperatuurstijging geïnduceerd bij de focus door US in een lineair regime voor de parameters die in deze studie worden gebruikt.

Voor niet-lineaire simulaties hebben we de k-Wave-toolbox van MATLAB gebruikt door de geometrie van de transducer in drie dimensies te definiëren en de volgende parameters voor het voortplantingsmedium (water) te gebruiken: geluidssnelheid, c = 1,500 m s^-1; volumetrische massa, ρ = 1,000 kgm^-3; niet-lineariteitscoëfficiënt, B/A = 5; verzwakkingscoëfficiënt, α = 2.2 x 10^-3 dB cm^-1 MHz^-y; frequentievermogenswet van de verzwakkingscoëfficiënt, y = 2 (ref. ⁵¹). We simuleerden quasi-monochromatische 3D-golfvelden met behulp van lange uitbarstingen van 50 cycli; dit gaf ons het maximale drukveld in drie dimensies, evenals de golfvorm bij de focus. Simulaties werden gekalibreerd door de ingangsdruk (excitatie van de gesimuleerde transducer) aan te passen om de druk bij het brandpunt gemeten in de watertank met echte transducers te bereiken. De brandpuntdiameter over de volledige breedte bij half-maximum (FWHM) in de x-y vlak was 4.360, 1.610 en 0.276 mm, en de lengte van de hoofdas in de x-z vlak was 32.3, 20.6 en 3.75 mm voor respectievelijk de 0.50, 2.25 en 15.00 MHz transducers (fig. 1b-d). Niet-lineaire effecten werden geëvalueerd door de relatieve harmonische inhoud van de golfvorm bij de focus te schatten. In het voorbeeld van de 15 MHz focustransducer in Fig. 1d, werden de experimentele en gesimuleerde signalen op het brandpunt vergeleken en bleken zeer concordant te zijn (Extended Data Fig. 4a). Bovendien is de amplitude van de tweede harmonische 19.8 dB onder de grondtoon (20.9 dB in het gesimuleerde geval), wat betekent dat als de grondenergie E, de tweede harmonische heeft energie E/95 (Uitgebreide gegevens Afb. 4b). Daarom kunnen we de niet-lineaire effecten redelijkerwijs verwaarlozen in de berekeningen van de thermische effecten, aangezien ze goed zijn voor ~ 1% van de betrokken energie. Dezelfde conclusies werden getrokken bij 0.5 MHz en 15.0 MHz. Benaderingen van lineaire golfvoortplanting verminderden de rekenkosten van de simulaties aanzienlijk. Lineaire voortplantingssimulaties werden uitgevoerd met de Field II-toolbox in MATLAB^52,53, in de monochromatische modus, met dezelfde mediumeigenschappen als k-Wave (water), om de 3D maximale drukvelden te verkrijgen. Deze maximale drukvelden werden gebruikt om een ​​warmtebronterm op te bouwen (Q_{mathrm{VS}} = frac{{alpha _{mathrm{np}}p_{mathrm{max}}^2}}{{rho _mathrm{b}c_mathrm{b}}}), Waar α_np is de absorptiecoëfficiënt van de hersenen bij de beschouwde frequentie (59.04 Np m^-1 bij 15 MHz, gerekend vanaf α_hersenen = 0.21 dB cm^-1 MHz^-y en y = 1.18), de volumetrische massa van de hersenen ρ_hersenen = 1,046 kgm^-3, de geluidssnelheid van de hersenen c_hersenen = 154 seconden^-1 en p_max is het 3D maximale drukveld. Deze bronterm werd vervolgens gebruikt bij het oplossen van een biowarmtevergelijking van Penne (rho _{mathrm{brain}}C_{mathrm{brain}}timesfrac{{partiële T}}{{partiële t}} = mathrm{div}links( {K_mathrm{t}timesnabla T} rechts) – rho _{ mathrm{bloed}}C_{mathrm{bloed}}P_{mathrm{bloed}}links( {T – T_mathrm{a}} rechts) + Q) in k-Wave, waar C_hersenen is de specifieke warmtecapaciteit van het bloed (3,630 J kg^-1 ° C^-1), K_t is de thermische geleidbaarheid van de hersenen (0.51 W m^-1 ° C^-1), ρ_bloed is de bloeddichtheid (1,050 kg m^-3), C_bloed is de specifieke warmtecapaciteit van het bloed (3,617 J kg^-1 ° C^-1), P_bloed is de bloedperfusiecoëfficiënt (9.7 × 10^-3 s^-1), T_a is de arteriële temperatuur (37 °C), Q = Q_US + ρ_hersenenγ_hersenen en γ_hersenen is de warmteontwikkeling van het hersenweefsel (11.37 W kg^-1) (scheidsrechters. ^54,55). De beginvoorwaarde voor de hersentemperatuur was ingesteld op T₀ = 37°C.

Deze simulatie komt overeen met het worst-case scenario met betrekking tot de gegeven temperatuurstijging. (1) De akoestische voortplanting wordt alleen in water gesimuleerd (niet-gereduceerde waarde), met een lagere dempingscoëfficiënt (2.2 × 10^-3 dB cm MHz^-2.00) dan de hersenen (0.59 dB cm MHz^-1.27), zelfs als een deel van de voortplanting in de hersenen plaatsvindt. De p_max kaarten zijn daarom overschat. (2) Thermische absorptie wordt alleen in het hersenweefsel gesimuleerd, met een hogere absorptiecoëfficiënt (0.21 dB cm MHz^-1.18) dan water, zelfs als een deel van het maximale drukveld zich daadwerkelijk in het water van de akoestische koppelconus bevindt. Daarom, Q_US wordt een beetje overschat. We brachten de temperatuur in kaart in drie ruimtelijke dimensies en tijd, en zochten naar het punt van maximale temperatuurstijging (Extended Data Fig. 4c-f).

statistische analyse

Statistische analyses werden uitgevoerd met Prism-software (Prism 9, GraphPad). Waarden worden uitgedrukt en weergegeven als gemiddelde waarden ± standaardfout van het gemiddelde (sem) op figuren en in de tekst, tenzij anders aangegeven. Gegevens werden geanalyseerd in ongepaarde Welch's t-testen (tweezijdig) of een ongepaard veelvoud t-test met Sidak-Bonferroni-correctie voor meerdere vergelijkingen. Statistische tests worden gegeven in de figuurlegenda's.

Rapportage samenvatting

Nadere informatie over onderzoeksontwerp is beschikbaar in de Samenvatting van de rapportage over de natuurportfolio gekoppeld aan dit artikel.

• Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
• Platoblockchain. Web3 Metaverse Intelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
• Bron: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01359-6