Nanobot-synthese

Nanobots werden voorbereid zoals eerder beschreven³³. Kortom, MSNP's werden gesynthetiseerd met behulp van een gemodificeerde Stöber-methode⁴¹, waarbij triethanolamine (35 g), ultrazuiver water (20 ml) en hexadecyltrimethylammoniumbromide (CTAB; 570 mg) gedurende 95 min bij 30 °C onder roeren worden omgezet. Vervolgens werd tetraethylorthosilicaat (1.5 ml) druppelsgewijs toegevoegd; men liet het mengsel 2 uur reageren bij 95 °C en de resulterende MSNP's werden verzameld door centrifugatie en gewassen in ethanol (driemaal, 2,500g, 5 minuten). Om de CTAB-matrijs te verwijderen, werden MSNP's gedurende 1.8 uur onder terugvloeiing in zure methanol (30 ml HCl, 24 ml methanol) geplaatst. Vervolgens werden MSNP's verzameld door centrifugatie en driemaal gewassen in ethanol (2,500g, 5 min) voordat aminemodificatie wordt opgenomen door APTES (6 μl per mg MSNP) toe te voegen aan MSNP's (1 mg ml^-1) in een 70% ethanolische oplossing bij 70°C, krachtig roeren gedurende 1 uur. MSNP's-NH₂ werden verzameld en driemaal gewassen in ethanol en driemaal in water door centrifugeren (driemaal, 1,150g, 5 minuten). MSNP's-NH₂ werden geresuspendeerd in PBS in een concentratie van 1 mg ml^-1 en een totaal volume van 900 µl, en geactiveerd met glutaaraldehyde (100 µl) gedurende 2.5 uur bij kamertemperatuur. De geactiveerde MSNPs-NH₂ werden verzameld en driemaal gewassen in PBS door centrifugatie (1,150g, 5 min), geresuspendeerd in een oplossing van urease (3 mg ml^-1) en heterobifunctionele PEG (1 μg PEG per mg 5 kDa HS-MSNPs-NH₂) in PBS, en 24 uur bij kamertemperatuur gereageerd. De resulterende nanobots werden vervolgens verzameld en driemaal gewassen in PBS door middel van centrifugatie (1,150g, 5 min) voordat ze opnieuw worden gesuspendeerd in een dispersie van AuNP's, bereid zoals eerder beschreven⁵¹, laat ze 10 minuten reageren en was ze grondig door te centrifugeren (driemaal, 1,150g, 5 minuten).

Hydrodynamische grootteverdeling en oppervlaktelading van de MSNP's, MSNP's-NH₂werden nanobots en met AuNP versierde nanobots bepaald met behulp van respectievelijk een Wyatt Mobius dynamisch lichtverstrooiingssysteem en een Malvern Zetasizer. In alle gevallen bedroeg de concentratie 20 µg ml^-1 en acquisitietijd 5 s, met behulp van drie runs per experiment. Er zijn drie metingen per deeltjestype uitgevoerd.

Synthese van FITC MSNP's

Een mengsel van FITC (2 mg), ethanol (5 ml) en APTES (400 µl) werd bereid en gedurende 30 minuten geroerd. Vervolgens werd het eerder beschreven protocol voor MSNP-synthese gevolgd, behalve dat we tetraethylorthosilicaat (1.25 ml) druppelsgewijs toevoegden in combinatie met het FITC-APTES-mengsel (250 µl). De functionaliteitsstappen om FITC-gelabelde nanobots te verkrijgen waren zoals hierboven vermeld.

Synthese van AuNP's

AuNP's werden gesynthetiseerd met behulp van een gerapporteerde methode³³. Kortom, alle materialen werden gereinigd met vers bereide aqua regia, grondig gespoeld met water en aan de lucht gedroogd. Vervolgens werd een 1 mM AuCl₄ De oplossing werd onder roeren tot het kookpunt verwarmd in een rondbodemkolf die in een refluxsysteem was geïntegreerd. Hierna werd 10 ml natriumcitraatoplossing (30.8 mM) toegevoegd en werd de oplossing 20 minuten gekookt, wat resulteerde in een rode kleur. Vervolgens liet men de oplossing onder roeren gedurende 1 uur afkoelen tot kamertemperatuur. De resulterende AuNP's werden in het donker opgeslagen en karakterisering werd uitgevoerd met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie.

Enzymatische activiteit

Enzymatische activiteit van nanobots, ¹⁸F-nanobots en ¹³¹I-nanobots zijn gemeten met fenolrood. Om dit te doen, wordt 2 µl nanobots (1 mg ml^-1) werden toegevoegd aan een plaat met 96 putjes en gemengd met 200 µl verschillende ureumoplossingen (0, 50, 100, 200 mM) in 1.1 mM fenolrood. De absorptie bij 560 nm werd in de loop van de tijd gemeten bij 37 °C.

Bewegingsdynamiek van Nanobot door optische microscopie

Optische video's van nanobots werden verkregen met behulp van een Leica Thunder-microscoop, gekoppeld aan een Hamamatsu hogesnelheids-CCD-camera en een objectief van × 1.25. Hiervoor werden de nanobots gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in 50 µl PBS (eindconcentratie van 20 mg  ml^-1). Vervolgens werd een petrischaaltje gevuld met 3 ml PBS of een 300 mM oplossing van ureum (in PBS) en onder de microscoop bekeken. Een druppel van 5 µl met nanobots (20 mg  ml^-1) werd vervolgens toegevoegd aan de met vloeistof gevulde petrischaal en video's werden opgenomen met 25 frames per seconde. Videopixelintensiteitsverdelingen in ROI's werden met intervallen van 15 seconden geanalyseerd met behulp van ImageJ-software.

Radiolabeling van nanobots met [¹⁸F]F-PyTFP

Synthese van [¹⁸F]F-PyTFP

[¹⁸F]F-PyTFP werd gesynthetiseerd in een Neptis xSeed-module (Optimized Radiochemical Applications), volgens een eerder gerapporteerde methode³³.

Synthese van ¹⁸F-gelabelde nanobots

Nanobots werden gelabeld met [¹⁸F]F-PyTFP, op basis van een eerder vastgestelde procedure met kleine aanpassingen³³. Kortom, 200 µl nanobotoplossing (1 mg ml^-1) werd gecentrifugeerd (10 min, 13,853g), geresuspendeerd in 10 µl PBS (1 µM, pH 8) en geïncubeerd met 4 µl [¹⁸F]F-PyTFP in acetonitril (ongeveer 37 MBq) gedurende 35 minuten bij kamertemperatuur. Na incubatie werd het reactiemengsel verdund met water (200 µl) en gezuiverd door centrifugatie (5 min, 13,853g). De resulterende pellet werd vervolgens driemaal met water gespoeld voordat deze werd gemeten in een dosiskalibrator (CPCRC-25R, Capintec). De radiochemische opbrengst werd berekend als de verhouding tussen de hoeveelheid radioactiviteit die na het wassen in de nanobots aanwezig was en de initiële hoeveelheid radioactiviteit. De radiochemische zuiverheid na zuivering was ≥99%, zoals bepaald door radio-dunnelaagchromatografie (radio-TLC) met behulp van iTLC-SG-chromatografiepapier (Agilent Technologies) en dichloormethaan en methanol (2:1) als respectievelijk de stationaire en mobiele fasen. TLC-platen werden geanalyseerd met behulp van een TLC-lezer (MiniGITA, Raytest).

Stabiliteit van ¹⁸F-nanobots

De stabiliteit van ¹⁸F-gelabelde nanobots werden bepaald met behulp van de volgende media: (1) 300 mM ureum, (2) water en (3) urine van tumordragende dieren. ¹⁸F-gelabelde nanobots (10 µl) werden gedurende 100 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met de overeenkomstige oplossing (1 µl). Vervolgens werden de nanobots en het supernatant gescheiden door centrifugatie en verzameld, en werd de radioactiviteit gemeten in een dosiskalibrator (CPCRC-25R).

Radiolabeling van nanobots met ¹³¹I

De radiojodering van urease-nanobots werd uitgevoerd door nanobots te incuberen met injecteerbare [¹³¹I]NaI-oplossing (925 MBq ml^-1; GE Gezondheidszorg). Kortom: 400 µl urease-nanobotoplossing (1 mg ml^-1) werd gecentrifugeerd (13,853g, 5 min), geresuspendeerd in 100 µl PBS (10 mM, pH 7.4) en geïncubeerd met 25 µl of 185 µl injecteerbare [¹³¹I]NaI (respectievelijk ongeveer 42.55 of 277.5 MBq) gedurende 30 minuten, afhankelijk van de gewenste eindactiviteit. Na incubatie werd het reactiemengsel gezuiverd door centrifugatie (13,853g, 5 minuten). Het resulterende neerslag werd driemaal gewassen met water (100 µl). De radioactiviteit in het supernatant en het neerslag werd bepaald met behulp van een dosiskalibrator (CPCRC-25R), en beide fracties werden geanalyseerd met radio-TLC, zoals voor ¹⁸F-nanobots.

Ontwikkeling van diermodellen

Muizen werden onderhouden en behandeld in overeenstemming met Richtlijn 2010/63/UE van de Europese Raad en interne richtlijnen. Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van CIC biomaGUNE en de lokale autoriteiten (Diputación Foral de Guipuzcoa, PRO-AE-SS-276). Beeldanalyse (zowel PET als MRI) was blind voor de groepsverdeling van de dieren.

Het orthotopische muizenmodel van blaaskanker werd gegenereerd door intravesicale toediening van MB49-cellen (muizencarcinoomblaascellijn) aan vrouwelijke C57BL/6JRj-muizen (8 weken oud, Janvier). Voor experimenten gericht op het bepalen van tumoraccumulatie (vier groepen; details hieronder) werden zes dieren per groep geïnoculeerd, zoals bepaald met behulp van precisieanalyse, met de volgende aannames: vereiste precisie, 20%; verwachte SD, ±20%; vertrouwen, 95%; dierverlies, 20%. Voor experimenten met therapeutische werkzaamheid (zes groepen; details hieronder) werden tien dieren per groep opgenomen, zoals berekend met behulp van een eenzijdige Student-methode. t-test, verschil tussen twee onafhankelijke gemiddelden, met de volgende aannames: nulhypothese, behandeling heeft geen invloed op tumorgroei; α, 0.05; 1 − β, 0.95; SD, ±50%; verwachte verschillen tussen groepen, 50%; dierverlies, 20%. Omdat het experiment om operationele redenen in twee batches werd uitgevoerd, werd in beide batches één controlegroep opgenomen (Tabel 2), en vervolgens werden alle dieren samengevoegd. Om de tumor te vestigen werden muizen verdoofd door inhalatie van 3% isofluraan in zuivere O₂ en onderhouden door 1.0-1.5% isofluraan in 100% O₂. Vervolgens werd de blaas geleegd en werden er chemische laesies op het urotheel geïnduceerd door intravesicaal 50 µl polyethyleentereftalaat in te druppelen.l-lysine (Sigma-Aldrich) via een 24-gauge katheter gedurende 15 minuten. Vervolgens werd de blaas opnieuw geleegd en werden MB49-cellen (10⁵ cellen) in DMEM met een hoog glucosegehalte (100 µl) werden gedurende 1 uur geïnstilleerd voordat de katheter werd verwijderd en de blaas werd geleegd via buikmassage. Tijdens de experimenten werden muizen gevolgd en gewogen voor monitoring van gezondheid en welzijn. Er werd een menselijk eindpunt toegepast als het gewichtsverlies meer dan 20% bedroeg of op basis van klinische symptomen, volgens de criteria van de verantwoordelijke dierenarts.

Volgen van de tumorgrootte

MRI-onderzoeken werden 7 en 14 dagen na tumorinductie uitgevoerd met behulp van een 7T Bruker BioSpec USR 70/30 scanner (Bruker BioSpin) uitgerust met een BGA-12S gradiëntinsert van 440 mT m^-1 en een 112/086 QSN-resonator (T12053V3) voor radiofrequentie¹⁴ transmissie en een oppervlaktespoel van rattenhersenen (T11205V3) voor RF-ontvangst (beide werkend op 300 MHz). Dieren werden verdoofd met isofluraan (4% voor inductie en 1.5% voor onderhoud in een 50% O₂/50% N₂ mengsel) en op een MR-compatibele houder geplaatst. De lichaamstemperatuur en de ademhalingssnelheid werden continu gevolgd met behulp van een MR-compatibel monitoringapparaat (model 1030 SA, Small Animal Instruments), gekoppeld aan een luchtverwarmersysteem voor kleine knaagdieren om de lichaamstemperatuur op peil te houden. Na het verkrijgen van referentiebeelden werd een op spin-echo gebaseerde diffusiegewogen beeldvormingsreeks gebruikt om tumoren in beeld te brengen, met behulp van de volgende parameters: echotijd (T_E) = 22.3 ms, herhalingstijd (T_R) = 2,500 ms, n = 2 gemiddelden, één A0-afbeelding (basisafbeelding met b = 0 s mm^-2) en één DW-afbeelding verkregen met behulp van diffusiegradiënten in de (1, 0, 0) richting met een gradiëntduur δ = 4.5 ms en een gradiëntscheiding Δ = 10.6 ms, gevend b = 650 s mm^-2, een 16 × 16 mm² gezichtsveld, beeldmatrixgrootte van 160 x 160 punten, 20 opeenvolgende plakjes van 0.5 mm dikte (geen opening, verkregen in interleaved-modus) en een bandbreedte van 192.9 Hz per pixel. Om tumoren te visualiseren, werden de beelden nabewerkt met ImageJ-software, waarbij de beelden werden verdeeld die waren verkregen met een diffusiegradiënt (b = 650 s mm^-2) door degenen die zijn verworven zonder (b = 0 s mm^-2), en het toepassen van een 3D Gaussiaans filter (σ_x = σ_y = σ_z = 0.7) aan het resultaat. Tumoren werden handmatig afgebakend om hun volume te bepalen.

In vivo biodistributie

Op dag 15 na tumorinductie werden muizen gerandomiseerd in vier groepen om homogene gemiddelde tumorvolumeverdelingen over de groepen te verkrijgen. PET-CT-scans (MOLECUBES β- en X-CUBE-scanners) werden 3 uur na intravesicale toediening van 100 µl ¹⁸F-BSA (groep 1 en 2) of ¹⁸F-urease (groepen 3 en 4) nanobots in een concentratie van 200 μg ml^-1, waarbij water (groepen 1 en 3) of 300 mM ureum in water (groepen 2 en 4) als drager wordt gebruikt (tabel 1). Voor beeldverwerving werden de dieren geïnduceerd met anesthesie (5% isofluraan in zuivere zuurstof) en in rugligging geplaatst voordat ze het buikgebied masseerden voor evacuatie van de blaas. Direct daarna het overeenkomstige ¹⁸F-gelabelde nanobots (¹⁸F-BSA/¹⁸F-urease in water/ureum) werden via een 24-gauge katheter in de blaas gedruppeld en gedurende 1 uur geïncubeerd, voordat de katheter werd verwijderd, de blaas werd geleegd en de muizen werden achtergelaten om te herstellen van de anesthesie. Bij t = 3 uur na toediening werden de dieren opnieuw verdoofd en werden gedurende 10 minuten statische PET-beelden van het hele lichaam verkregen, gevolgd door CT-scans. PET-beelden werden gereconstrueerd met behulp van het 3D-geordende reconstructie-algoritme voor subsetverwachtingsmaximalisatie met willekeurige, verstrooiings- en verzwakkingscorrecties. PET-CT-beelden van dezelfde muis werden mede geregistreerd en geanalyseerd met behulp van de PMOD-beeldverwerkingstool. Grafieken van de concentratie van radioactiviteit versus de tijd werden verkregen door een interessant volume op het bovenste blaasgebied te creëren met behulp van een 3D-contourinstrument en de activiteit (gecorrigeerd voor verval) te meten in kilobecquerel per orgaan. De resultaten werden gecorrigeerd door een kalibratiefactor toe te passen en vervolgens genormaliseerd op basis van het MRI-afgeleide tumorvolume.

Ex-vivo-onderzoeken

Histopathologische analyses

Na voltooiing van alle beeldvorming werden geselecteerde blazen (n = 3 per groep) van tumordragende en gezonde dieren werden onder aseptische omstandigheden verwijderd en onmiddellijk gefixeerd in 4% formaldehyde. Vervolgens werden de blazen ingebed in paraffine voordat secties van 2-3 µm werden genomen voor hematoxyline-eosinekleuring. Representatieve beelden werden verkregen onder alle omstandigheden voor histopathologisch onderzoek.

ICP-MS-analyse

Metingen werden uitgevoerd op een Thermo iCAP Q ICP-MS (Thermo Fisher Scientific) gekoppeld aan een ASX-560 autosampler (CETAC Tech). Nadat alle beeldvorming was voltooid, werden de dieren gedood en werden blazen geselecteerd (n = 2 per groep; vier groepen) verzameld en verteerd in 1 ml HNO₃:HCl (4:1 mengsel). De dispersie werd gekookt totdat de organen volledig waren opgelost. Vervolgens werd de oplossing afgekoeld tot kamertemperatuur en geanalyseerd met behulp van ICP-MS om de concentratie Au in elk monster te bepalen, waarbij de resultaten werden omgezet in percentages geïnjecteerde dosis per gram weefsel (%ID g^-1).

Immunohistochemie en confocale microscopiebeeldvorming

Voor immunohistochemische analyses ontvingen tumordragende dieren FITC-gelabelde nanobots in water of 300 mM ureum (n = 4 per groep), zoals hierboven beschreven, voor PET-CT-onderzoeken. Bovendien dienden tumordragende dieren zonder nanobots als controlegroep (n = 2). In alle gevallen werden de blazen verzameld, ingevroren en in secties van 10 µm gesneden die onmiddellijk gedurende 10 minuten in 15% formaldehyde werden gefixeerd, gewassen met 10 mM PBS en vervolgens geïncubeerd in 50 mM NH.₄Cl in PBS gedurende 5 minuten voordat u opnieuw spoelt met PBS. Permeabilisatie werd uitgevoerd met methanol:aceton (1:1) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en 0.1% Triton in PBS gedurende 5 minuten. Na het wassen met PBS werden de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur verzadigd met een oplossing van 0.5% BSA – 15% Tween in PBS en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met anti-FITC van muizen (1:100, Abcam) in 5% BSA –0.5% Tween. Secties werden driemaal gewassen met 10 mM PBS gedurende 5 minuten en 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met secundair antilichaam Alex Fluor 647 ezel anti-muis IgG (Molecular Probes, Life Technologies, 1: 1,000) in 5% BSA – 0.5% Tween. in PBS, opnieuw gewassen in PBS (3 x 5 min) en gemonteerd met een ProLong antifade-kit met 4,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI; Molecular Probes, Life Technologies). Beelden werden verkregen met een Leica STELLARIS 5 confocale microscoop (UPV/EHU Scientific Park) met identieke instellingen voor alle secties: vergroting van ×10 met tegelafbeelding en stiksel (typisch 4 × 5 gezichtsveld). Laserlijn- en detectievensters waren 405 nm en 440–503 nm voor DAPI, 489 nm en 494–602 nm voor FITC witte laser en 653 nm en 660–836 nm voor Alexa647 witte laser.

Optische zuivering

Na perfusie met 4% paraformaldehyde en PBS werden blaasmonsters verwijderd en gedurende de nacht bij 4°C verder gefixeerd in 4% paraformaldehyde, vervolgens ingebed in een injectiespuit van 5 ml met 0.8% agarose met een laag smeltpunt om een ​​cilindrisch blok te vormen en een gemakkelijke behandeling mogelijk te maken. montage in de kwartskuvet. Het hele blok werd geleidelijk gedehydrateerd met behulp van methanol:H₂O bij 4 °C (30%:70% gedurende 1 h, 50%:50% gedurende 1 h, 70%:30% gedurende 1 h, 100%:0% gedurende 1 h, daarna 100% methanol gedurende de nacht en opnieuw gedurende 4 uur) en uiteindelijk ondergedompeld in benzylalcohol-benzylbenzoaat (BABB) als oplossing voor het matchen van de brekingsindex voor beeldvorming. Voor in vitro vergelijkingen van groene FITC-nanobots met commerciële rode deeltjes hebben we DiagNano (Creative Diagnostics) rood fluorescerende silica-nanodeeltjes met een diameter van 1 µm gebruikt, die bestand zijn tegen BABB-klaring.

Autofluorescentie en gepolariseerde sLS-beeldvorming

Light-sheet-beeldvorming werd uitgevoerd op MacroSPIM, een aangepast systeem voor beeldvorming van hele organen, ontwikkeld bij IRB Barcelona^44,45. Kort gezegd worden monsters ingebed in een agaroseblok, samen met het monster geklaard en in beeld gebracht in een kwartscuvette. Autofluorescentiebeeldvorming maakte gebruik van lasers bij 488, 561 of 638 nm die verlichting leverden door een achromatische doublet cilindrische lens van 50 mm (ACY254-050-A, Thorlabs). Om streepartefacten te verminderen, wordt de lichtplaat met een resonante scanner SC-10 (EOPC) langs een 4f-telescoop met G322288322 100 mm achromatische doubletlenzen (QI Optic Photonics) gedraaid. Autofluorescentie van weefsel wordt verzameld via band- of long-pass fluorescentiefilters en opgenomen met een ORCA Flash v2-camera (Hamamatsu Photonics). Beeldvorming werd uitgevoerd bij ×9.6 met een ×8 zoomlens, ×2 lens en ×0.6 buislens. De lichtplaat werd over het gezichtsveld afgevlakt, wat een axiale resolutie van 5-6 µm opleverde. De 3D-beeldvorming gebeurde in stappen van 2.5 µm. Beeldvorming van de hele blaas werd uitgevoerd in 2 × 3 of 3 × 4 XY tegels, afhankelijk van de orgelgrootte.

sLS-beeldvorming werd bereikt door het fluorescentiefilter te verwijderen of een filter te gebruiken dat de laser doorlaat. Het draaien van de lichtplaat verminderde de ruis van de laserspikkels, wat resulteerde in een temporele middeling van de lasercoherentie, zoals eerder weergegeven⁵². De oriëntatie van de lineaire lichtbladpolarisatie bij verlichting werd geregeld door een halfgolfplaat (AHWP05M-600, Thorlabs) vóór de draaiscanner te draaien. Het gedetecteerde signaal werd in polarisatie geselecteerd met behulp van een roterende lineaire polarisator (LPVISC100, Thorlabs) vóór het filterwiel bij detectie, waardoor >50% intensiteitsverlies bij fluorescentiedetectie werd geïntroduceerd. Hoewel de sLS-signaalverdeling in het algemeen verandert met de oriëntatie van de polarisator, blijft het autofluorescentiesignaal van het weefsel onaangetast door de rotatie van de polarisator. sLS levert een ruimtelijke resolutie op van 2.4 ± 0.3 µm in BABB, wat vergelijkbaar is met de resolutie bij fluorescentielichtbeeldvorming (bevestigd door een Gaussische functie aan te passen aan de XY beeldreactie van een enkel deeltje, aanvullende figuur. 8l–m) en dichtbij de theoretische resolutie in lucht (1.53  µm met numerieke opening (NA) = 0.2 bij maximale macrozoom ×8).

Beeldverwerking en 3D-analyse

Beeldverwerking, segmentatie en analyse van light-sheet datasets werd gedaan met ImageJ/Fiji, terwijl Fig. 3 en 4 zijn gegenereerd met Imaris Viewer 9.9 (https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer) en aanvullende video 3 werd gegenereerd met Imaris 9 (https://imaris.oxinst.com/) (Bitplane, Oxford-instrumenten). Betegelde light-sheet-datasets werden gestikt met MozaïekExplorerJ⁵³. 3D-segmentatie van blaasweefsel werd uitgevoerd met behulp van aangepaste ImageJ/Fiji-macro's voor semi-automatische 3D-annotatie van grote volumes in virtuele modus. Kortom, een eerste script, ‘Macro1’, laadt 3D-beeldstapels, maakt gebruikersannotatie van ROI’s in verschillende vlakken mogelijk en interpoleert automatisch de ROI’s om 3D-maskers te genereren en te exporteren. ROI's werden om de 15 vlakken getekend (elke 37.5 µm) om een ​​goede continuïteit van de segmentatie te vergemakkelijken en tegelijkertijd de annotaties tot een redelijk minimum te beperken. Een tweede script, ‘Macro2’, voert de wiskundige of Booleaanse bewerkingen uit, vlak voor vlak, zonder de volledige stapels in het geheugen te laden, hetzij tussen 3D-maskers, hetzij tussen een 3D-masker en de originele gegevens, en slaat het resultaat op als een nieuwe stapel. Alle maskers werden gegenereerd door autofluorescentiebeelden te annoteren.

Zowel de tumor- als de gezonde weefseloppervlaktelagen (Fig. 3) werden afgebakend met behulp van Fiji's toverstaf en lasso-instrumenten op de blaasholte in een masker. Door deze eerste iteratie BC1 te noemen, zullen daaropvolgende uitvoeringen van Macro1 deze 3D-contour automatisch met een gedefinieerde pixelhoeveelheid uitzetten om nieuwe maskeriteraties op te leveren, BC2, BC3 enzovoort, met toenemende dilataties. De eerste laag die zowel tumor- als gezond weefsel bevat, masker L1, wordt verkregen door masker BC1 af te trekken van BC2 enzovoort, waardoor L2 en L3 als concentrische lagen ontstaan. Het tumorvolume dat zich het dichtst bij de holte bevond, werd verkregen door de tumor te annoteren met staaf- en lasso-instrumenten om een ​​masker T1 te creëren, terwijl de gezonde 3D-laag van urotheel afzonderlijk in masker U1 werd gedetecteerd. Als u U1 van L1 aftrekt, krijgt u de oppervlaktelaag van de tumor, enzovoort: L2 − U1, L3 − U1. Omgekeerd wordt de eerste laag van het urotheel verkregen door T1 van L1 af te trekken. Alle lagen in afb. 3 werden gedefinieerd als een dikte van 33 µm.

Dezelfde reeks macro's en procedures (ImageJ wandtool, digitale erosie van 500 µm enzovoort) werden gebruikt om het binnenste deel van het blaasweefsel af te bakenen en te segmenteren en vervolgens het interne weefselvolume van de blaas te schatten (Fig. 4, zie hierboven voor details). Histogrammen van de verstrooide signaalintensiteit werden in Fiji gemaakt door het verstrooide signaal en het masker te combineren.

RNT gebruikt ¹³¹I-nanobots

Tussen dag 8 en 15 na tumorimplantatie werden de dieren verdeeld in zes groepen (groepen 1-6), in een poging vergelijkbare gemiddelde tumorvolumes over de groepen heen te bereiken (Tabel 2). Voor de experimenten werden dieren geïnduceerd met anesthesie (5% isofluraan in zuivere O₂) en in rugligging voordat de blaas wordt geleegd door de buikstreek te masseren. Onmiddellijk daarna 100 µl van de juiste behandeling in een concentratie van 400 µg ml^-1 (Tafel 2) werd in de blaas gebracht met behulp van een 24-gauge katheter. Behandeling en medium (water of ureum) bleven gedurende 1 uur in de blaas voordat de katheter werd verwijderd. De blaas werd opnieuw geleegd door buikmassage en de muizen herstelden van de anesthesie in hun kooien, waarbij 24 uur na de behandeling het zaagsel van de dierenkooi werd vervangen om radioactieve besmetting te verwijderen.

Therapeutische werkzaamheid bepaald door middel van MRI

Op elke muis werden twee MRI-onderzoeken uitgevoerd: (1) tussen dag 7 en 14 na tumorinenting om dieren willekeurig over groepen te verdelen en initiële tumorvolumes (voorbehandeling) te meten; (2) tussen dag 16 en 21 na tumorinenting (na de behandeling) om de therapeutische werkzaamheid te evalueren. MRI werd uitgevoerd met behulp van 7 T Bruker BioSpec- en 11.7 T Bruker BioSpec-scanners (beide met ParaVision 7-software), afhankelijk van beschikbaarheid. Dit had geen invloed op de resultaten, aangezien het externe veld niet kritisch is voor anatomische beeldvorming¹⁴. Beeldvormingsexperimenten werden uitgevoerd met behulp van dezelfde beeldvormingsparameters en verwerking zoals hierboven uitgelegd (Volgen van de tumorgrootte). In het geval van de 11.7 T scanner bestond de opstelling uit een muishartoppervlakspoel voor ontvangst en een volumetrische spoel voor verzending. De tumorvolumes in elke plak werden bepaald uit handmatig getrokken interessante volumes die het tumorgebied bedekten.

statistische analyse

In onderzoeken met PET-beeldvorming zijn de percentages van de geïnjecteerde dosis (% ID) en de geïnjecteerde dosis per tumorvolume (% ID cm^-3) werden vergeleken met behulp van eenwegs-ANOVA. Verschillen tussen groepen werden bepaald met behulp van de meervoudige vergelijkingstest van Tukey. NTV in RNT-sectie werd verkregen van a t-test van ongepaarde waarden. Er werd aangenomen dat de gegevensverdeling normaal was, maar dit werd niet formeel getest. Statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism v.8.

Rapportage samenvatting

Nadere informatie over onderzoeksontwerp is beschikbaar in de Samenvatting van de rapportage over de natuurportfolio gekoppeld aan dit artikel.

• Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
• PlatoData.Network Verticale generatieve AI. Versterk jezelf. Toegang hier.
• PlatoAiStream. Web3-intelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
• PlatoESG. carbon, CleanTech, Energie, Milieu, Zonne, Afvalbeheer. Toegang hier.
• Plato Gezondheid. Intelligentie op het gebied van biotech en klinische proeven. Toegang hier.
• Bron: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01577-y