마우스

젊은(2~4개월) 및 노령(18~26개월) 수컷 및 암컷 야생형 C57BL6/J, Lgr5-ki-eGFP-creER 및 Olfm4-ki-eGFP-creER 마우스를 그룹으로 수용하고 Fritz Lipmann Institute의 SOPF(Specific Opportunist Pathogen Free) 동물 시설에서는 12시간의 명암 주기를 가지며 온도 20 ± 2°C, rlH 55% ± 15에서 표준 마우스 먹이를 먹였습니다. 실험은 승인된 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 튀링겐 주 정부의 Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz(TLV) 기관(라이센스 번호: TG/J-0002858/A, TG/J-0003616/A, TG/J-0003681/A, FLI-17-109, FLI- 18-005, FLI-20-005).

소장 토굴 분리

확립된 프로토콜을 사용하여 소장 선와를 분리했습니다.⁶⁰ 일부 수정 사항이 있습니다. 간단히 말해서, 마우스 소장을 절개하고 차가운 PBS로 세척했습니다. 융모가 없는 장 조각(2cm)을 차가운 PBS로 세척하고 5mM EDTA/PBS로 옮긴 다음 회전기에서 30°C에서 4회 30분간 배양했습니다. 조직을 신선하고 차가운 PBS로 옮기고 70초 동안 수동으로 흔들었습니다. 선와 용액을 450μm 세포 여과기를 사용하여 여과하고 XNUMX×에서 원심분리했습니다. g 5°C에서 4분간 분리된 선와를 즉시 사용하거나 액체 질소에서 급속 냉동하고 추가 실험을 위해 -80°C에서 보관했습니다. RNA 분리를 위해 선와를 즉시 QIAzol Lysis Reagent(Qiagen)에 재현탁하고 -80°C에서 보관했습니다.

장 줄기 세포 분리 및 분류

Lgr5-eGFP 및 Olfm4-eGFP ISC를 분리하기 위해 새로 분리된 선와를 18ml TrypLE Express, 2ml의 10x DNase I 완충액(100mM Tris-HCl pH 7.5, 25mM MgCl)의 혼합물로 분리했습니다.₂, 5mM CaCl₂) 및 DNase I(1mg/ml) 10ml를 30°C에서 37분 동안 10분마다 짧게 교반합니다. 그런 다음 단일 세포 현탁액을 20μm 세포 여과기에 통과시키고 800×에서 원심분리했습니다. g 5°C에서 4분간 세포 펠릿을 3% 소 태아 혈청, 2mM EDTA, 2.5μM Y10 및 DAPI(27632:1)가 보충된 PBS를 함유한 1000ml FACS 염색 배지(FSM)에 재현탁시켰습니다. 단일 세포 현탁액을 FACS LSRII(BD Biosciences) 및 Lgr5-eGFP에 적용했습니다.^hi 또는 Olfm4-eGFP ISC는 이전에 설명한 대로 다운스트림 분석을 위해 분류되었습니다.⁶¹.

유기체 배양

소장 오가노이드를 확립된 프로토콜에 따라 배양했습니다.⁶². 간단히 말하면, 분리된 선와를 Matrigel과 혼합하고 24웰 플레이트에 플레이팅했습니다. Matrigel 중합 후, 선와 배양 배지(Advanced DMEM/F12, 1× Glutamax, 10 mM HEPES, N2 보충제(1:100), B27 보충제(1:50), 0.5 U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 50 ng/mL 마우스 재조합 상피 성장 인자, 100ng/mL 마우스 재조합 Noggin, 500ng/mL 인간 재조합 R-spondin1)을 첨가했습니다. IFNγ 치료를 위해 3주 동안 성장한 오가노이드를 계대배양하고 2일차에 IFNγ(24ng/ml)를 첨가했습니다. 1시간 후 오가노이드를 수집하고 PBS로 세척한 후 단일 세포 RNA-seq을 위해 처리했습니다. Stat2 신호 전달을 차단하기 위해 오가노이드를 Ruxolitinib(10μM) 유무에 관계없이 IFNγ 3ng/ml로 0.2일 동안 처리한 다음 FACS 또는 qRT-PCR 분석을 위해 수집했습니다. IFNγ는 re-seeding 실험과 Baricitinib(2μM) 실험을 위해 XNUMXng/ml의 농도로 사용되었습니다.

아넥신 V 염색

위에서 설명한 대로 오가노이드에서 단일 세포를 준비한 후, 세포를 200μl의 1X 결합 완충액과 1μl의 APC Annexin V(BD Bioscience의 세포사멸 검출 키트)에 재현탁한 후 실온에서 15분간 배양했습니다. 1X 결합 완충액으로 세척한 후, 세포를 1X 결합 완충액(100μl)에 재현탁하고 FACSAriaII(BD Biosciences)를 사용하여 분석하고 데이터를 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석했습니다.

BrdU 확산 분석

BrdU(10μM)를 수확 6시간 전에 오르가노이드에 첨가했습니다. 위에서 설명한 대로 오가노이드에서 단일 세포를 준비한 후 BD Bioscience의 BrdU 흐름 키트를 사용하여 오가노이드 배양에서 증식하는 세포의 비율을 정량화했습니다. 세포는 FACSAriaII를 사용하여 분석되었으며 FlowJo 소프트웨어가 분석에 사용되었습니다.

공동배양 실험

IFNγ 처리(0.2일 동안 2ng/ml) 또는 처리되지 않은 오르가노이드를 새로 분리하고 분류한 Cd45와 함께 배양했습니다.⁺ 어린 쥐의 세포를 3일 동안 배양했습니다. 대략 2×10⁵ Cd45⁺ 세포를 100개의 오가노이드와 혼합하고 Matrigel(30% 최종 농도)에 재현탁했습니다. 이후 배양물로부터 면역세포를 분리하고 염색 후 FACSAriaII를 이용하여 분석하였다. FlowJo 소프트웨어는 다양한 면역 세포 집단의 백분율 계산에 사용되었습니다.

IFNγ의 생체 내 차단

늙은 쥐에게 항마우스 IFNγ(25mg/kg) 또는 항IgG1 항체를 3주 동안 복강내 주사했습니다(주당 4회 주사). 장기 수확을 위해 마지막 주사 후 5일째에 마우스를 희생시켰습니다. 재생 실험을 위해, IFNγ 차단 후, 대조군으로서 5-플루오로우라실(150-FU)(7 mg/kg) 또는 DMSO를 마지막 주사 후 XNUMX일 복강내(ip) 주사하고, XNUMX일 후 장기 수확을 위해 마우스를 희생시켰다.

RNA 및 DNA 분리

QIAzol Lysis 시약(Qiagen)을 사용하여 선와의 총 RNA를 분리한 후 이소프로판올 침전을 수행했습니다. Lgr5-eGFP의 RNA^hi FACS로 분류된 ISC는 제조업체의 지침에 따라 ZR-Duet™ DNA/RNA MiniPrep Plus Kit(Zymo Research)를 사용하여 분리되었습니다. 분리된 RNA는 Nanodrop 8000(Thermo Fisher Scientific) 및 Qubit 3.0(Thermo Fisher Scientific)에서 정량화되었습니다. 분리된 RNA의 품질은 Fragment Analyser(Agilent)로 분석했습니다.

RNA 서열분석 라이브러리 준비

전체 리보가 고갈된 RNA-seq 라이브러리 준비는 이전에 설명한 대로 수행되었습니다.⁶³. 간단히 말해서, 제조업체의 지침에 따라 Ribo-Zero™ Gold Kit H/M/R Kit(illumina)를 사용하여 50~500ng의 총 RNA에서 리보솜 RNA가 고갈되었습니다. Ribo가 고갈된 RNA를 17μl의 EFP 완충액(illumina)에 재현탁하고 94°C에서 8분간 가열한 후 TruSeq™ RNA Library Preparation Kit v2(illumina)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 첫 번째 가닥 합성을 위한 입력으로 사용했습니다.

scRNA 서열 분석을 위한 세포 준비

실험에 따르면, 근위 소장 선와 또는 장 오가노이드를 1 ml의 단일 세포 분리 용액(1 mg/ml DNase I, 5 mM MgCl이 보충된 TrypLE)에 재현탁시켰습니다.₂, 80 μM Y27632), 처음 20분 동안 배양한 후 짧은 소용돌이로 37°C에서 10분 동안 배양했습니다. 29ml의 얼음처럼 차가운 PBS를 첨가하여 반응을 중단시키고 세포를 800x에서 원심분리했습니다. g 5°C에서 4분간 세포 펠릿을 80 μM Y27632가 보충된 FSM에 재현탁했습니다. 제조업체의 사양에 따라 TruStain FcX 항-마우스 항체로 세포를 미리 차단했습니다. 그런 다음 세포를 CD326(EpCAM)(G8.8), PE-Cyanine7 결합 쥐 단일클론 항체 및 다양한 TotalSeq 항-마우스 해시태그 항체로 어둠 속에서 얼음 위에서 30분 동안 처리했습니다. 그런 다음 세포를 450 ×에서 원심 분리했습니다. g 5°C에서 4분 동안 500μl의 신선한 FSM에 재현탁하고 FACS를 분류했습니다. EpCAM⁺ 어린 쥐와 늙은 쥐의 단일 세포를 1.5% BSA가 포함된 0.04μl PBS가 포함된 BSA 코팅 튜브에 유동 분류했습니다.

고유층 면역 세포는 근위 장 조직에서 분리되었습니다. 간단히 말하면, 선와 분리 후, 조직을 잘게 자르고 3% FBS가 보충된 RPMI 배지 중 1ml의 1mg/ml 콜라게나제-D 및 2mg/ml DNase I에서 인큐베이터 진탕기(80rpm)에서 50℃에서 37분 동안 배양했습니다. °C. p1000 팁을 사용하여 조직을 위아래로 여러 번 피펫팅했습니다. 상청액을 100 μm 스트레이너를 통해 2% FBS가 보충된 RPMI 배지에 통과시켰습니다. 남은 조직을 주사기 플런저로 파쇄하고 2% FBS가 첨가된 RPMI 배지로 세척하여 최대 세포수를 모았다. 상청액을 450×에서 원심분리하였다. g, 4°C에서 5분 동안. 펠릿을 40% FBS가 보충된 RPMI 배지 중 2% 퍼콜에 재현탁시켰습니다. 구배를 생성하기 위해 세포 현탁액을 팔콘 튜브에서 80% 퍼콜 이상으로 조심스럽게 피펫팅했습니다. 팔콘 튜브를 1600×에서 원심분리했습니다.g, 20분 동안 RT(원심분리기 중단 비활성화). 두 퍼콜 농도의 경계에서 조심스럽게 면역 세포를 수집하고 2% FBS가 보충된 PBS로 세척했습니다. 현탁액을 450×에서 원심분리하였다. g, 4°C에서 5분 동안. 펠렛을 2% FBS가 보충된 PBS에 재현탁하고 염색을 진행했습니다. 제조업체의 사양에 따라 TruStain FcX 항-마우스 항체로 세포를 차단했습니다. 각 구획에 대해 FITC 결합 CD45 및 서로 다른 TotalSeq 항-마우스 해시태그 항체를 사용하여 염색 및 해시 태깅을 동시에 수행했습니다. 항체에 대한 자세한 내용은 보충 표에서 확인할 수 있습니다. S2.

액적 기반 scRNA 시퀀싱

scRNA-seq은 10X Genomics 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 간단히 말하면, 준비된 단일 세포 현탁액을 Chromium Single Cell 3' Library & Gel bead chemistry v2(10x Genomics)를 사용하여 역전사 혼합물과 조심스럽게 혼합하고 Chromium Single Cell A Chip(10x Genomics)에 로드했습니다.

10X Genomics Chromium 시스템의 캡슐화 과정에서 세포는 물방울 내에서 용해되어 폴리아데닐화된 RNA를 방출한 다음 세포와 함께 캡처된 바코드 비드에 결합했습니다. 10x Genomics 사용자 매뉴얼의 지침에 따라 액적을 직접 역전사에 적용하고 에멀젼을 분해한 후 Dynabeads MyOne Silane(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 cDNA를 정제했습니다. XNUMX주기로 cDNA를 PCR 증폭한 후 Fragment Analyser(Agilent)에서 정제 및 품질 관리 검사를 거쳤습니다.

cDNA를 10분 동안 단편화하고 dA-테일링한 후 라이브러리를 생성하기 위해 어댑터 결찰 단계와 500주기의 인덱싱 PCR을 수행했습니다. 정량화 후 라이브러리는 PE 모드(R1: 26사이클, I1: 8사이클, R2: 57사이클)의 고출력 플로우 셀을 사용하여 NextSeqXNUMX 플랫폼(illumina)에서 시퀀싱되었습니다.

높은 처리량 시퀀싱

게놈 전체 실험을 위한 모든 샘플은 HiSeq2500 및 NextSeq500 플랫폼(Illumina, San Diego, CA, USA)에서 서열 분석되었습니다.

정량 실시간 PCR

cDNA 합성은 제조사의 프로토콜에 따라 iScript cDNA Synesis Kit(Biorad)를 사용하여 총 RNA 1μg을 사용하여 수행되었습니다. 정량적 실시간 PCR 분석은 SYBR GreenER qPCR SuperMix(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 Corbett RotorGene 6000(Qiagen)에서 수행되었습니다. 각 반응은 19 μl의 qPCR 혼합물과 1 μl의 1로 수행되었습니다.∶10 희석된 cDNA. qRT-PCR 조건은 10°C에서 95분, 50°C에서 10초, 95°C에서 10초, 56°C에서 20초, 68°C에서 3초의 68주기였습니다. 앰플리콘 데이터를 얻기 위해 각 PCR 실행 후에 용융 곡선 분석을 수행했습니다. 각 샘플을 XNUMX회 분석했습니다. 샘플의 농도는 상대 표준 곡선 방법을 사용하여 계산되었습니다. 분석된 모든 유전자 발현은 하우스키핑 유전자 베타-액틴으로 정규화되었습니다. 프라이머는 NCBI Primer-BLAST 도구를 사용하여 설계되었으며 해당 시퀀스는 보충 표에 나열되어 있습니다. S1.

염색질 면역침전(ChIP)-qRT-PCR 분석

이전에 설명한 대로 IFNγ 처리 및 처리되지 않은 오르가노이드에서 염색질 면역침전을 수행했습니다.⁶³. 간단히 말하면, 2시간 동안 IFNγ(24ng/ml)로 처리된 오가노이드를 세척하고, 파괴하고, RT에서 1분 동안 10% 포름알데히드를 첨가하여 교차 결합하고, RT에서 0.125분 동안 5M 글리신으로 켄칭한 다음 차가운 PBS로 두 번 세척했습니다. 가교된 오가노이드를 SDS ChIP 완충액(20mM Tris-HCl pH 8.0, 10mM EDTA, 1% SDS 및 프로테아제 억제제)에 재현탁하고 회전기에서 30°C에서 4분 동안 배양하고 높은 온도에서 18주기 동안 초음파 처리했습니다. Bioruptor Next Gen(Diagenode)을 사용하여 전원 설정(30초 ON, 30초 OFF) 및 12,000 ×에서 원심분리 g 10°C에서 4분 동안. 분리된 염색질을 ChIP 희석 완충액(10mM Tris-HCl pH 16.7, 8.0% SDS, 0.01% Triton X-1.1, 100mM EDTA, 1.2mM NaCl)으로 167배 희석하고 4μg의 항체와 함께 밤새 배양했습니다. 회전자에서는 °C입니다. 단백질 G 결합 자기 비드(Dynal, Thermo Fisher Scientific)를 PBS/4% BSA로 포화시키고 연어 정자를 밤새 1°C에서 초음파 처리했습니다. 다음날, 샘플을 회전기에서 4°C에서 4시간 동안 포화된 비드와 함께 배양한 후 차가운 저염 완충액(1mM Tris-HCl pH 20, 8.0% SDS, 0.1% Triton X-1) 100ml로 세척했습니다. , 2mM EDTA, 150mM NaCl), 차가운 고염 완충액(1mM Tris-HCl pH 20, 8.0% SDS, 0.1% Triton X-1, 100mM EDTA, 2mM NaCl) 500ml, 차가운 1ml LiCl 완충액(10mM Tris-HCl pH 8.0, 1% DOC, 250mM LiCl, 1mM EDTA, 1% NP-40) 및 1ml의 차가운 TE 완충액(10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM)으로 200회 EDTA). 면역침전된 염색질을 10μl의 용출 완충액(8.0mM Tris-HCl pH 1, 1mM EDTA, 150% SDS, 5mM NaCl, 30mM DTT)을 사용하여 회전기에서 실온에서 65분 동안 용출시키고 2°에서 가교결합 해제했습니다. C 밤새. 탈가교결합된 DNA를 제조사의 지시에 따라 QiaQuick PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 면역침전된 DNA는 SYBR GreenERkit(Invitrogen)과 다음 프라이머를 사용하여 정량적 실시간 PCR로 분석되었습니다: H1-Ab1(앞으로: CAGGTCCTGACCCCTGTTTA, 역방향: GTTTCAGGAAGGGACAGCCA), Wars(앞으로: CTGGCTGTGTAGTCCAAGGG, 역방향: GAAAGGGTGTGGCAAAGCAG). ChIP에 사용된 항체는 토끼 항-Stat9172(12, Cell Signaling), 토끼 항-IgG(370-1, Millipore)였습니다. 모든 항체는 250:XNUMX의 농도로 사용되었습니다. 항체에 대한 자세한 내용은 보충 표에서 확인할 수 있습니다. S2.

냉동 조직 절편의 면역형광

근위 장(십이지장)의 작은 조각(2cm)을 회전 장치에서 4°C에서 밤새 PBS 중 4% PFA에 고정했습니다. 고정 후, 조직을 PBS로 실온에서 15분간 20회 세척한 후 회전기에서 4℃에서 밤새 80% Sucrose로 탈수시켰다. 이어서, 고정된 조직을 최적 절단 온도(OCT) 화합물을 사용하여 캐스트에 장착하고 액체 질소를 사용하여 천천히 냉동시킨 후 -14 °C에서 보관했습니다. 면역형광 염색을 위해, 0.1 μm 절편을 절단하고 조직을 100% Triton X-10이 보충된 PBS에서 15분간 투과화시킨 다음 PBS로 실온에서 1분간 10회 세척했습니다. 투과화된 조직을 0.1% Tween 20(T-PBS)이 보충된 PBS 중 2% FBS로 4시간 동안 차단한 다음, 15% FBS가 보충된 T-PBS에서 1차 항체와 함께 1000°C의 습한 챔버에서 밤새 인큐베이션했습니다. . 1차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 조직을 PBS로 실온에서 15분 동안 200회 세척한 다음, DAPI(200:XNUMX)가 보충된 PBS 중 XNUMX차 항체와 함께 실온에서 XNUMX시간 동안 인큐베이션했습니다. XNUMX차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 조직을 PBS로 실온에서 XNUMX분 동안 XNUMX회 세척하고 마운팅했습니다. 이미징은 Fritz Lipmann Institute – Core Facility Imaging에서 수행되었습니다. 이미지는 광학 절편용 ApoTome 슬라이더 모듈이 있는 Axiovert XNUMX 도립 현미경을 사용하여 획득했습니다. 이미징은 XNUMXx 총 배율로 수행되었습니다.

면역형광에 사용된 20533차 항체는 토끼 단일클론 항-EpCAM [EPR63-1](Abcam; 250:4); 쥐 단클론성 항마우스 MHC 클래스 II(IA)(NIMR-1), PE(Thermo Fisher Scientific; 250:488). 면역형광에 사용된 1차 항체는 다음과 같습니다: Alexa Fluor 500 당나귀 항토끼 IgG(H+L)(Thermo Fisher Scientific; 568:1); Alexa Fluor 500 염소 항쥐 IgG(H + L)(Thermo Fisher Scientific, XNUMX:XNUMX). 항체에 대한 자세한 내용은 보충 표에서 확인할 수 있습니다. S2.

파라핀 내장 조직 절편의 면역형광

5μm 파라핀 절편을 자일렌에 5회 담그어(매회 100분) 파라핀 제거하고 일련의 등급별 에탄올 희석액 90%, 70%, 5%에 각각 5분 동안 담가서 재수화했습니다. 에피토프 검색은 끓을 때까지 900mM 구연산 나트륨 완충액 pH 10에서 최대 전력 마이크로파(6.5W)로 섹션을 10분 동안 예열한 다음 끓는점 이하 온도(600W)에서 20분 동안 예열하여 수행되었습니다. 1분 동안 냉각시킨 후, 절편을 PBS로 세척하고 습한 챔버에서 실온에서 1시간 동안 4% BSA/PBS로 차단했습니다. 섹션을 6차 항체인 항-Olfm5(Cell Signaling, D39141Y2A, #90007), 항-Muc15160(abcam, ab1) 및 항-Chga(abcam, ab16)로 4% BSA/PBS에서 0.1도에서 20시간 동안 염색했습니다. 습한 방에서. 이어서 PBST(3% Tween 5, 30 x 488분)로 세척하고 AF1과 접합된 250차 항-토끼 IgG와 함께 0.1분 동안 배양했습니다. 모든 항체는 20:3의 농도로 사용되었습니다. 슬라이드를 T-PBS(5% Tween 2, XNUMX x XNUMX분)로 세척하고 DAPI를 포함한 장착 매체로 장착했습니다. 염색된 부분의 이미지는 Zeiss의 Axio Imager를 사용하여 획득하고 ZEN blue 소프트웨어 vXNUMX(Zeiss)로 분석했습니다. 추가 이미지 분석을 위해 ZEN 소프트웨어의 계산 및 측정을 위한 그래픽 도구가 사용되었습니다. 항체에 대한 자세한 내용은 보충 표에서 확인할 수 있습니다. S2.

RNA 서열분석 데이터 분석

Fastq 파일 품질 검사는 FastQC v0.11.5를 사용하여 수행되었습니다. fastq 파일은 다음 매개변수 –bowtie9 –no-coverage-search -a 2.1.0와 함께 TopHat v1을 사용하여 mm5 게놈에 매핑되었습니다. 각 유전자에 포함된 읽기 수는 -s를 사용하여 HTSeq-Count 0.11.2로 계산됩니다. -a 0 -t 엑손 -m 교차점-비어 있지 않은 매개변수가 없습니다. 추가 분석 전에 모든 rRNA 유전자가 카운트 데이터에서 제거됩니다. DEG 및 정규화된 개수를 계산하기 위해 DESeq2 R 패키지 v1.20.0이 기본 매개변수와 함께 사용되었습니다. Pearson 상관 분석 및 표현식 플로팅에는 정규화된 개수가 사용되었습니다.

유전자 세트 농축 분석

유전자 세트 농축 분석을 위해 R의 스케일 함수(중심 = TRUE, 스케일 = TRUE 매개변수 사용)를 사용하여 표준화된 카운트(모든 샘플의 각 유전자에 대해)를 스케일링했습니다. 평균 Z 점수는 각 그룹에 대해 계산되었으며 플롯 그리기 및 다운스트림 분석에 사용되었습니다. 그만큼 p 값은 Wilcoxon 쌍 테스트(양측)를 사용하여 계산되었습니다. 상자 그림은 데이터의 사분위수 분포를 보여줍니다. 사분위간 범위(Q1.5~Q3)의 1배 거리가 하위 사분위수 아래에서 측정되고 이 거리 내에 속하는 데이터세트에서 관찰된 하위 지점까지 수염이 그려집니다. 다른 모든 관찰 지점은 이상값으로 표시됩니다.

장 선와 세포에 대한 scRNA 서열 분석 데이터 분석

원시 시퀀싱 데이터는 기본 옵션을 사용하여 Cell Ranger 소프트웨어(v2.1.0, 10X Genomics)의 'count' 명령으로 처리되었습니다. 필요한 참조는 쥐 게놈 mm10과 Ensembl(v87)의 유전자 주석을 입력으로 기반으로 Cell Ranger의 'mkref' 명령을 사용하여 구축되었습니다. 단백질 코딩, lincRNA 및 안티센스 유전자 특징('–attribute=gene_biotype:단백질_코딩 –attribute=gene_biotype:lincRNA –attribute=gene_biotype:antisense')만 포함하도록 Cell Ranger의 'mkgtf' 명령을 사용하여 주석을 필터링했습니다. 카운트 파일은 cellrangerRkit 패키지 v2.0.0을 사용하여 R에 직접 업로드되었습니다. 카운트 데이터에 대한 추가 분석 전에, 발현되지 않은 유전자를 제거하고 카운트를 각 셀의 총 카운트 수로 정규화하고(cellrangerRkit 패키지의 Normalize_barcode_sums_to_median 함수 사용) 모든 다운스트림 분석에 대해 로그 10으로 변환했습니다. PCA는 center = TRUE,scale인 prcomp 함수를 사용하여 계산되었습니다. = TRUE 매개변수. 세포의 클러스터링은 kmean 클러스터링(center = 9, nstart = 10)을 사용하여 수행되었으며 정의된 각 클러스터의 세포 유형은 각 세포 유형에 대해 잘 알려진 마커를 사용하여 결정되었습니다. 9개의 클러스터를 사용하여 Tuft 및 Enteroendocrine 세포가 동일한 클러스터에 있었으므로 kmean(center = 2, nstart = 10)을 사용하여 재클러스터링하여 이러한 세포 유형을 분리했습니다. 각 클러스터에 대한 마커를 정의하기 위해 우리는 각각 order_cell_by_clusters 및 Prioritize_top_genes(방법 = "sseq", min_mean = 0.1)를 사용했습니다. 마커의 발현은 원하는 클러스터와 다른 모든 세포(prioritize_top_genes 기능 사용) 및 log2 배수 변화가 ≥ 2인 유전자 사이에서 비교되었으며 조정되었습니다. p 값 <0.05가 마커로 선택되었습니다.

고유층 면역 세포 및 장 오르가노이드 세포에 대한 scRNA 서열분석 데이터 분석

Cell Ranger 소프트웨어 제품군(버전 3.1.0)을 사용하여 샘플 역다중화, 바코드 처리 및 mm3-10을 참조 게놈으로 사용하여 단일 세포 3.0.0' UMI 계산을 수행했습니다. 셀당 유효 판독(UMI)은 원시 판독을 다운샘플링하여 각 샘플에서 동일한 수준(셀당 UMI 수 중앙값: 1330)으로 조정되었습니다. 해시태그 읽기가 포함된 셀은 각 셀의 해시태그 비율에 따라 '단일 해시태그', '이중 해시태그', '삼중 해시태그', '다중 해시태그'로 서로 다른 카테고리로 정의되었습니다. 해시태그에 매핑된 읽기가 10개 미만인 셀은 폐기되었으며 다운스트림 분석을 위해 "단일 해시태그"로 정의된 셀만 보관되었습니다. 이후 모든 샘플의 유전자 바코드 매트릭스가 Seurat v3에 통합되었습니다. 그런 다음 각 세포에 다음 기준을 적용했습니다. 즉, 면역 세포의 경우 유전자 수는 200~1500, UMI 수는 <5000, 미토콘드리아 유전자 표준화 수는 8 미만입니다. 장 오가노이드 세포의 경우: 미토콘드리아 유전자 표준화된 수는 20 미만입니다. 필터링 후 남은 총 8997개의 면역 세포(젊은 샘플의 경우 4423개 세포, 오래된 샘플의 경우 4574개 세포) 및 13,054개의 장 오가노이드 세포(대조군은 5843개 세포, 대조군은 7211개 세포) IFNγ 처리군)은 다음 분석을 위해 남겨두었습니다. 대조 오가노이드와 IFNγ 처리 오가노이드의 단일 세포를 통합할 때 "정규 상관 분석(cca)" 보정을 통해 배치 효과가 제거되었습니다.

차원 축소, 그래프 클러스터링, UMAP/t-SNE 시각화

면역 세포의 경우, 데이터세트에서 높은 세포 간 변동을 나타내는 특징(7425개 유전자)의 하위 집합은 Seurat의 "mvp" 방법을 사용하여 선택됩니다(평균 컷오프는 0.0125에서 2 사이, 분산 컷오프는 >0.9). 이는 가변성과 평균 표현 간의 강력한 관계를 제어하면서 가변 기능을 식별할 수 있습니다. 기본적으로 특징은 평균 표현을 기준으로 20개의 빈으로 구분되었으며, z 점수는 각 빈 내 분산에 대해 계산되었습니다.

장내 오가노이드 세포의 경우, 데이터 세트에서 높은 세포 간 변동을 나타내는 특징의 하위 집합(유전자 2000개)은 Seurat의 "vst" 방법을 사용하여 선택됩니다. 특징값은 log(분산)과 log(평균)의 적합선 모델에 의해 주어진 관측 평균과 기대 분산을 사용하여 표준화되었습니다. 그런 다음 최대값으로 클리핑한 후 표준화된 값에 대해 피쳐 분산이 계산됩니다.

다운스트림 분석에서 가변 유전자에 초점을 맞추면 단일 세포 데이터 세트에서 생물학적 신호를 강조하는 데 도움이 됩니다. 우리는 데이터 세트의 변동성이 대부분 유지되도록 차원 축소를 위해 "mvp" 또는 "vst" 방법으로 식별된 모든 변수 유전자를 보수적으로 사용했습니다. 필터링된 해시태그 분리 유전자-바코드 매트릭스의 차원 축소는 PCA를 통해 이러한 가변 유전자에 적용되었습니다. 그런 다음 장 오가노이드에 대한 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection)와 면역 세포에 대한 t-SNE(t-distributed stochastic neighbor embedding)가 세포 시각화를 위한 상위 20개 주요 구성 요소에 대해 수행되었습니다. 한편, Seurat v3를 사용하여 차원이 축소된 데이터에 대해 그래프 기반 클러스터링을 수행했습니다.

클러스터에 대한 차등 분석 및 클러스터 특정 유전자 식별

Seurat v3에서 구현된 Wilcoxon 순위 합계 테스트는 차등 분석을 달성하기 위해 채택되었습니다. 각 클러스터에 대해 노화의 DEG는 각 클러스터의 모든 세포에 대한 평균 유전자 발현을 사용하여 생성되었습니다. 동일한 방식으로, 각 클러스터의 각 유전자의 평균 발현을 다른 모든 클러스터의 세포의 평균 발현과 비교하여 특정 클러스터에 풍부한 유전자를 식별했습니다. 각 클러스터의 발현 차이를 기준으로 순위에서 상위 몇 개의 클러스터 특정 유전자를 검사했습니다. 히트맵에 의한 시각화를 위해 각 유전자의 중심 발현을 사용했습니다. 면역 세포 하위 집합의 분류는 클러스터별 유전자의 주석을 통해 추론되었습니다. 알려진 마커를 참조하여 다양한 세포 유형을 수동으로 지정했습니다(보충 데이터 S4).

면역 세포 및 장내 오가노이드의 세포 비율 변화 테스트

노화 또는 치료 시 각 세포 유형의 상대적 존재비 변화를 나타내기 위해 승산비를 계산했습니다. 이 두 데이터 세트에서는 일부 세포 유형의 빈도에 극적인 변화가 관찰되었습니다. 이러한 변화의 통계적 유의성은 각 조건 비교 및 ​​세포 유형과 관련하여 관찰된 세포 수 변화의 정확한 초기하 확률(대체 없음)을 계산하여 평가되었습니다.

구체적으로, 모든 세포 유형의 m개와 n개 총 세포가 처리 조건과 대조 조건에서 각각 순서가 지정되어 있다는 점을 고려하여, 주어진 세포 유형에 대해 관찰된 C형 세포의 총 k개와 q개 수와 처리 조건은 각각 초기하 분포에 의해 주어진 널 모델에서 크게 벗어납니다. 이러한 값을 관찰할 확률은 다음 명령을 사용하여 'stats' 패키지의 R 함수 'phyper'를 사용하여 계산되었습니다. p = phyper(q, k, m, n)이며 초기하로 보고되었습니다. p 값. 승산비에 대한 신뢰 구간은 R 함수 'fisher.test'를 사용하여 계산되었습니다.

유전자 기능 주석

통계적으로 유의미한 DEG(조정됨) p 값 < 0.05)은 Canonical Pathway 및 Upstream Regulator 분석(Qiagen 2020, 버전 01-18-06)을 위해 QIAGEN IPA 소프트웨어에 업로드되었습니다. 강화된 경로와 후보 업스트림 규제자는 IPA에서 검색될 수 있습니다.

모티브 예측

모티프 예측은 "-start -4.9.1 -end 1000 -len 500 -p 8,10 -b" 설정으로 소프트웨어 HOMER-v4에 의해 진행되었습니다. 계산에는 이항 분포가 사용되었습니다. p 풍부한 모티프의 가치. 분석은 장내 분비 세포의 마커로 알려진 유전자의 프로모터 대 장세포의 마커로 알려진 유전자의 프로모터에 대해 수행되었습니다.

통계 및 재현성

표본 크기를 미리 결정하는 데 통계적 방법은 사용되지 않았습니다. 분석에서 제외된 데이터는 없습니다. 조사관은 실험 및 결과 평가 중에 할당에 대해 눈이 멀지 않았습니다.

보고 요약

연구 설계에 대한 추가 정보는 Nature 포트폴리오 보고 요약 이 기사에 링크되어 있습니다.

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• 출처: https://www.nature.com/articles/s41467-023-41683-y