C9orf72-ALS 인간 IPSC 소교세포는 MMP9를 통해 공동 배양된 운동 뉴런에 염증을 일으키고 독성이 있습니다 - Nature Communications

윤리 강령

모든 iPSC 계통은 이전에 사우스 웨일즈 연구 윤리 위원회(WA/12/0186) 및 사우스 센트럴 버크셔 연구 윤리 위원회(REC10/H0505/71)가 부여한 윤리적 승인에 따라 수집된 서명된 사전 동의에 따라 피부 생검 섬유아세포에서 파생되었습니다. 표준화된 프로토콜에 따라 옥스퍼드 대학교 제임스 마틴 줄기 세포 시설에서 수행됩니다. iPSC 계열은 모두 이전에 발표되었습니다(아래 및 보충 표 참조). 1).

iPSC 문화

HRE를 보유하고 있는 XNUMX명의 서로 다른 ALS 환자로부터 유래된 XNUMX개의 iPSC 계통 C9orf72 대조군으로는 이전에 상동성 지정 복구를 사용한 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 통해 생성된 동종 계통입니다.¹⁸, 그리고 XNUMX개의 성별 및 연령이 일치하는 건강한 대조 iPSC 라인이 이 연구에 사용되었습니다. 모든 iPSC 계통은 이전에 발표되었으며 광범위하게 특성화되었습니다(인구통계 및 특성화에 대한 자세한 내용은 보충 표 참조). 1). iPSC는 매일 배지를 교체하면서 Geltrex™(A1, ThermoFisher)의 mTeSR™85850(1413302, StemCell Technologies)에서 배양되었습니다. 세포를 EDTA(0.5mM)를 사용하여 계대배양하고 연구를 위한 일관된 냉동 세포 스톡(50% mTeSR™1, 30% 배아 줄기 세포 소 태아 혈청(16141002, Merck)에 냉동 보존), 10% KnockOut™ DMEM( 10829018, ThermoFisher), 10% DMSO(D2650, Merck)) 실험 중 최대 3회 후속 계대를 사용했으며 MycoAlert를 사용하여 마이코플라스마에 대해 음성 테스트를 거쳤습니다.^TM 마이코플라스마 검출 키트(Lonza).

iPSC 유래 운동 뉴런의 분화

iPSC는 이전에 발표된 프로토콜을 사용하여 MN으로 차별화되었습니다.³⁹. 간단히 말하면, N12(50X), B50(2X), 1-머캅토에탄올(27X), 항생제-항진균제(1X, 모두 ThermoFisher), 아스코르브산(2μM)이 보충된 DMEM-F1/Neurobasal 1:0.5을 사용하여 신경 유도를 수행했습니다. , 화합물 C(1μM, 둘 다 Merck) 및 Chir99021(3μM, R&D Systems). 배양 1일 후, Retinoic Acid(500μM, Merck) 및 Smoothened Agonist(2nM, R&D Systems)를 첨가했습니다. 추가 99021일 후, 화합물 C 및 Chir18이 제거되었습니다. 시험관 내(DIV)0.07일에 세포를 폴리에틸렌이민(PEI, 10%, Merck) 및 Geltrex™(ThermoFisher) 또는 PDL(Sigma-Aldrich)/ Laminin(R&D Systems)/ Fibronectin(Corning)에 다시 플레이팅했습니다. BDNF(10ng/mL), GDNF(0.5ng/mL), Laminin(10μg/mL, 모두 ThermoFisher) 및 DAPT(2μM, R&D Systems)가 추가로 보충된 배지. 4일 후, 배지는 아래 설명된 대로 미세아교세포 배지로 바뀌었고 MN은 미세아교세포와 공동 배양되거나 단일 배양으로 유지되었습니다. XNUMX~XNUMX일마다 배지 절반을 교체했습니다.

iPSC 유래 미세아교세포 전구체의 분화

iPSC는 이전에 설명한 대로 대식세포/소교세포 전구체로 분화되었습니다.^15,40. 간략하게, 배아체(EB) 형성은 BMP800(1ng/mL), VEGF(4ng/mL, 둘 다 Peprotech) 및 SCF(50 ng/mL, Miltenyi Biotec). 매일 50/20 배지 교체로 175~15일 후, EB를 T3 플라스크로 옮기고 Interleukin-25(100ng/mL, R&D Systems), MCS-F(1ng/mL)가 보충된 X-VIVO2(Lonza)에서 분화했습니다. ), GlutaMAX(1X, 둘 다 ThermoFisher) 및 40-머캅토에탄올(XNUMXX). 매주 신선한 배지를 추가했습니다. 약 XNUMX개월 후, 상층액을 수집하여 전구체를 수확하고, 세포 스트레이너(XNUMX μM, Falcon/Greiner)를 통과한 후, 아래 설명된 대로 단일배양 또는 공동배양에서 미세아교세포로 분화했습니다.

iPSC 유래 미세아교세포의 분화

Microglia 전구체는 이전에 특성화한 microglia 배지를 사용하여 PEI(0.07%) 및 Geltrex™ 또는 PDL/Laminin/Fibronectin에 도금되었습니다.¹⁷ Advanced DMEM-F12(ThermoFisher), GlutaMAX(1X), N2(1X), 항생제-항진균제(1X), 2-머캅토에탄올(1X), Interleukin-34(100ng/mL, Peprotech/BioLegend), BDNF( 10ng/mL), GDNF(10ng/mL) 및 라미닌(0.5μg/mL). Microglia는 약 14일 동안 분화되었으며 2~4일마다 배지의 절반을 교체하고 RNA/단백질 추출을 위해 수집하거나 분석에 사용했습니다.

iPSC 유래 운동 뉴런과 미세아교세포의 공동 배양

HC-2b 라인을 사용하기 전에 설명한대로 공동 배양이 생성되었습니다 (보충 표 1) MN을 생성하기 위해¹⁷. 간략하게, 분화하는 MN(DIV21)의 최종 재도금 후 1일 후에 미세아교세포 전구체가 수확되었습니다. MN을 PBS로 헹구고, 미세아교세포 배지에 재현탁된 미세아교세포 전구체를 MN과 1:14 비율로 각 웰에 첨가했습니다. 공동 배양은 최소 2일 동안 유지되었으며 4~0.4일마다 배지의 절반을 교체했습니다. 선택된 실험에서는 조직 배양 삽입물(83.3932.040 μm 기공 크기, XNUMX, Sarstedt)에 미세아교세포를 도금하여 두 세포 유형의 직접적인 접촉을 방지했습니다.

LPS 및 MMP9 억제제 치료를 통한 소교세포 프라이밍

소교세포 단일배양의 경우, 모든 배지를 흡인하고, 소교세포 배지의 LPS(100ng/mL, L4391, Merck)를 48시간 동안 첨가했습니다. 대조군 웰에는 신선한 미세아교세포 배지만 받았습니다. 선택된 조건에서 반복적인 LPS 처리는 0일, 2일, 4일에 수행되었습니다. 공동 배양의 경우 LPS 처리는 DIV25에서 시작하여 10일 동안 수행되었습니다. 배지의 절반을 흡인하고 미세아교세포 배지(최종 농도: 100ng/mL)에서 LPS로 교체했으며, DIV29 및 33에서 LPS 함유 미세아교세포 배지로 추가 절반 배지를 변경했습니다. 추가 실험에서 LPS 처리는 DIV25 및 20일 동안 수행되었으며 격일로 미디어의 절반이 변경되었습니다. BDNF 및 GDNF는 이러한 실험을 위해 배양 배지에서 제거되었습니다. MMP9를 억제하기 위해 배양물을 비히클 대조군과 동일한 농도(100%)의 LPS(9ng/mL) 및 MMP9 억제제 I(MMP3i, 444278μM, 0.3, Merck) 또는 DMSO로 동시에 처리했습니다.

TNF/IL1B를 이용한 소교세포 프라이밍

모든 배지는 소교세포 단일배양물에서 흡인되었고, 소교세포 배지의 TNF(50ng/mL) 및 IL1B(20ng/mL, 둘 다 Peprotech)를 48시간 동안 첨가했습니다. 대조군 웰에는 신선한 미세아교세포 배지만 받았습니다.

rhMMP9 및 MMP9 억제제를 사용한 MN 치료

MN은 비히클 대조군으로서 동일한 농도(9%)의 재조합 활성 인간 MMP9(rhMMP30, 024ng/mL, PF5-9UG, Merck) 및 MMP3i(444278μM, 0.3, Merck) 또는 DMSO로 처리되었습니다. DIV21 및 DIV25에 대해 치료를 수행하였고, MN 생존력은 DIV29에 대한 MTS 분석에 의해 결정되었습니다.

식균작용 및 정량화의 실시간 영상화

자극되지 않은 LPS 프라이밍(100시간 동안 48ng/mL) 소교세포 단일 배양물을 Live Cell Imaging Solution(1:10,000, ThermoFisher)에서 Hoechst로 10분 동안 염색했습니다. 생세포 이미징 솔루션(35364μg/mL)에 포함된 pHrodo™ Red Zymosan Bioparticles™(P50, ThermoFisher)를 각 웰에 추가하고 150x 10x가 장착된 EVOS™ XL 코어 세포 이미징 시스템(ThermoFisher)을 사용하여 10분 후에 이미지를 획득했습니다. 목적. 선택된 조건에서, 세포를 식세포작용/분해 억제제인 Cytochalasin D(2618μM, C1, Merck), Bafilomycin A1(1334μM, 1, R&D Systems) 또는 DMSO(차량)로 XNUMX시간 전처리하여 추가로 처리했습니다. 피지의 분석 매크로를 사용하여 자동으로 정량화를 수행했으며, 내부화된 식균작용 입자의 면적을 Hoechst 양성 미세아교세포의 수로 나누어 세포당 식균작용 입자의 면적을 얻었습니다.

패치-클램프 전기생리학

전체 세포 패치-클램프 전기 생리학은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다.¹⁷. 건강한 대조군 또는 C42orf46-ALS 환자 유래 미세아교세포와 공동 배양한 DIV 9-72의 건강한 대조군 MN은 167mM NaCl, 2.4mM KCl, 1mM MgCl을 함유한 세포외 용액에서 유지되었습니다.₂, 10 mM 포도당, 10 mM HEPES 및 2 mM CaCl₂ pH 7.4 및 300mOsm으로 조정되었습니다. 팁 저항이 7~12MΩ인 전극은 붕규산 유리(내경 0.86mm, 외경 1.5mm)로 제작되었습니다. 140mM K-글루코네이트, 6mM NaCl, 1mM EGTA, 10mM HEPES, 4mM MgATP, 0.5mM Na를 함유하는 전극에 세포내 용액을 첨가했습니다.₃pH 7.3 및 290mOsm으로 조정된 GTP. 데이터 수집은 Multiclamp 700B 증폭기, digidata 1550 A 및 클램프Ex 6 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 직렬저항(R_s)는 <30 MΩ으로 유지되었습니다. 전압 게이트 채널 전류는 뉴런이 -250mV 펄스로 140ms 동안 사전 펄스되고 10mV 단계 전압이 -70mV에서 +70mV까지 적용되는 전압 클램프에서 측정되었습니다. 유도 활동 전위(AP)는 전류 클램프에 기록되었고, 뉴런은 -70mV로 유지되었으며, 15pA의 10개 전류 단계가 -10pA에서 130pA까지 적용되었습니다. 전압 개폐 채널 전류 및 유도된 활동 전위(유변 염기, 최대 AP, 레오 염기에 대한 AP)의 특성을 클램프핏 10.3(pCLAMP 소프트웨어 제품군, Molecular Devices)을 사용하여 정량화했습니다. 최대 AP는 가장 긴 열차와 함께 스윕되는 AP 수를 결정하여 정량화되었습니다. AP 지속 시간과 진폭은 각 뉴런에서 기록된 첫 번째 활동 전위를 사용하여 Matlab R2022a(MathWorks)에서 정량화되었습니다.

MEA 녹음

전체적으로 Maestro 시스템(Axion Biosystems)을 사용하여 2웰 다중 전극 어레이(MEA) 플레이트(M15-tMEA-48B, Axion BioSystems)에서 공동 배양을 위해 768-48분 동안 신경 활동을 기록했습니다. 검출 임계값으로 SD > 2.5.2를 사용하여 AXIS 소프트웨어 v5.5(Axion BioSystems)를 사용하여 분석을 수행했습니다. 웰당 평균 점화 속도는 웰당 모든 활성(>1 스파이크/분) 전극을 평균하여 계산되었습니다.

RNA 분리 및 RT-qPCR

RNAeasy Mini Plus 키트(Qiagen)를 사용하여 RNA를 추출하고 고용량 cDNA 역전사 키트(ThermoFisher)를 사용하여 동일한 양의 RNA(100ng)를 cDNA로 역전사했습니다. 정량적 실시간 PCR은 LightCycler® 480 PCR 시스템(Roche)과 보충 표에 나열된 프라이머(ThermoFisher)를 사용하여 Fast SYBR™ Green Master Mix(ThermoFisher)로 수행되었습니다. 3. 모든 키트는 제조업체의 지침에 따라 사용되었습니다. 상대 배수 유전자 발현의 정량화는 2를 사용하여 수행되었습니다.^–ΔΔCt 정규화하는 방법 TBP 참조 유전자(TBP Ct 범위 0.5) 및 각 실험에 대한 대조 미세아교세포의 평균 유전자 발현.

RNA 시퀀싱

9개의 건강한 대조군과 72개의 C8.5orfXNUMX-ALS 환자 유래 iPSC 계통이 계통당 XNUMX개의 독립적인 분화를 통해 미세아교세포로 분화되었습니다. 위에서 설명한대로 RNA를 추출했습니다. 모든 RNA 샘플은 최소 XNUMX의 RIN 값을 표시했습니다. 그런 다음 샘플 준비 및 생물정보학적 분석을 이전에 설명한 대로 수행했습니다.¹⁷. 간단히 말해서, 라이브러리 준비 전에 샘플을 100ng로 정규화했습니다. 제조업체의 지침에 따라 NEBNext Ultra II mRNA 키트(NEB)를 사용하여 폴리아데닐화된 전사체 농축 및 가닥 특이적 라이브러리 준비를 완료했습니다. NovaSeq150 플랫폼(Illumina, NovaSeq 6000 S6000/S2 시약 키트, v4, 1.5사이클)을 사용하여 페어드 엔드 시퀀싱(읽기 길이: 300개 염기쌍)을 수행하여 샘플당 최소 30M 읽기의 원시 읽기 수를 생성했습니다. . 페어드 엔드 판독은 인간 GRCh38.p13 참조 게놈에 매핑되었습니다(https://www.gencodegenes.org) HISAT2 v2.2.1 사용⁴¹. 카운트 테이블은 FeatureCounts v2.0.1을 사용하여 얻었습니다.⁴². DESeq2 v1.28.1을 사용하여 카운트 정규화 및 차등 발현 분석을 수행했습니다.⁴³ RStudio 1.4.1103에서는 모델의 생물학적 성별을 포함하고 다중 테스트 수정을 위한 Benjamini-Hochberg 방법을 사용합니다. 조건당 세 가지 다른 분화는 생물학적 성별과 분화 복제가 모델에 포함된 경우 달리 명시하지 않는 한 하나의 데이터 포인트로 축소되었습니다. 주성분 분석을 사용하여 카운트 테이블의 분산 안정화 변환 후 탐색적 데이터 분석을 수행했습니다. 통나무₂ 배수 변화(로그₂ fc) 수축은 '정상' 접근법을 사용하여 수행되었습니다. 유전자 | 통나무₂ FC| > 0.5 및 조정됨 p-값 < 0.05는 차별적으로 발현된 유전자(DEG)로 정의되었습니다. 데이터는 ClusterProfiler v3.16.1을 사용하여 Gene Ontology 데이터베이스의 주석으로 해석되었습니다.⁴⁴. 로그로 순위가 매겨진 전체 전사체에 대해 모든 DEG 및 유전자 세트 농축 분석(GSEA)에 대해 과잉 표현 분석(ORA)을 수행하여 경로 농축을 분석했습니다.₂fc, ORA 및 GSEA용 ClusterProfiler의 표준 설정 사용(조정됨) p- Benjamini-Hochberg 방법을 사용한 값 < 0.05).

면역 형광

커버슬립에서 배양된 세포를 실온(RT)에서 2분 동안 PBS 중 2% 파라포름알데히드(PFA)로 미리 고정한 다음 RT에서 추가로 4분 동안 PBS 중 15% PFA로 고정했습니다. PBS 중 5% 당나귀 혈청 및 0.2% Triton X-100을 사용하여 RT에서 1시간 동안 투과화 및 차단한 후, 커버슬립을 보충 표에 나열된 XNUMX차 항체와 함께 배양했습니다. 2, 1°C ON에서 PBS 중 0.1% 당나귀 혈청과 100% Triton X-4으로 희석되었습니다. PBS-0.1% Triton X-100으로 각각 5분간 488회 세척한 후, 커버슬립을 상응하는 형광 568차 항체 Alexa Fluor® 647/1/1000 당나귀 항-마우스/토끼/염소/기니피그(모두 0.1:100, ThermoFisher)와 함께 배양했습니다. 또는 Abcam). 그런 다음 Coverslip을 PBS-5% Triton X-1으로 각각 10분간 두 번 세척하고 PBS 중 DAPI(5μg/mL, Sigma-Aldrich)와 함께 0.1분간 배양했습니다. PBS-100% Triton X-710을 사용한 추가 880분 세척 단계 후 ProLong™ Diamond, Gold 또는 Glass Antifade Mountant(ThermoFisher)를 사용하여 커버슬립을 현미경 슬라이드에 장착했습니다. 공초점 현미경 검사는 LSM 1000, LSM XNUMX(둘 다 Zeiss) 또는 Fluoview FVXNUMX(Olympus) 현미경을 사용하여 수행되었습니다.

소교세포 파급효과 분석

무작위로 선택된 시야의 1~60개의 z-스택 이미지(z-간격: 1μm)를 각 커버슬립에 대해 3x 배율로 촬영했으며 피지에서 최대 강도 투영이 생성되었습니다. 단일 배양 및 공동 배양에서 IBAXNUMX 양성 미세아교세포의 분기를 분석하기 위해 다른 곳에서 설명한 대로 XNUMXDMorph를 사용하여 세포 부피, 파급 지수, 평균 분기 길이 및 분기점 수를 자동으로 결정했습니다.¹⁹.

미세아교세포에서 TDP-43 잘못된 위치화의 정량화

무작위로 선택된 시야의 60~43개의 z-스택 이미지가 각 커버슬립에 대해 1x 배율로 촬영되었으며 피지에서 최대 강도 투영이 생성되었습니다. 핵과 세포질에서 TDP-43의 평균 강도 값은 DAPI와 IBAXNUMX 신호를 사용하여 각각 핵과 세포질 경계를 식별하는 맹검 방식으로 결정되었습니다. 그런 다음 세포질 대 핵 TDP-XNUMX의 비율을 계산했습니다.

미세아교세포 단일배양에서 미세아교세포 마커 발현의 정량화

무작위로 선택된 시야의 40개의 z-스택 이미지는 각 커버슬립에 대해 1x 배율로 촬영되었으며 피지에서 최대 강도 투영이 생성되었습니다. DAPI 양성 핵과 IBAXNUMX의 수⁺/DAPI⁺ 및 TMEM119⁺/DAPI⁺ 셀은 매크로를 사용하여 각 라인에 대한 뷰 필드별로 자동으로 정량화되었습니다.

공동 배양에서 미세아교세포와 운동 뉴런 수 및 비율의 정량화

무작위로 선택된 시야의 10~40개의 z-스택 이미지를 각 커버슬립에 대해 1x 또는 1x 배율로 촬영했으며 피지에서 최대 강도 투영이 생성되었습니다. 소교세포의 경우 매크로를 사용하여 IBA1 채널에 자동 임계값을 적용하여 마스크를 만들고 '분석'을 사용하여 IBA1 마스크 내의 DAPI 양성 핵 수를 계산하여 각 뷰 필드에 대해 소교세포 수를 결정했습니다. 입자의 기능. MN의 경우 TUJXNUMX 채널에 자동 임계값을 적용하여 마스크를 만들고, '입자 분석' 기능을 사용하여 TUJXNUMX 마스크 내의 DAPI 양성 핵 수를 계산하여 각 뷰 필드에 대해 뉴런 수를 결정했습니다. 소교세포:MN 비율을 계산하기 위해 소교세포 수를 MN 수로 나누었습니다. 장기간 LPS 노출 후 MN 생존을 평가하기 위해 절대 MN 수를 대조 계통의 평균으로 정규화하여 장기 배양 후 분화 간 배치 효과를 고려하여 상대 MN 생존을 결정했습니다.

공동 배양에서 세포사멸 마커 발현의 정량화

무작위로 선택된 시야의 40개 z-스택 이미지는 각 커버슬립에 대해 1x 배율로 촬영되었습니다. 최대 강도 예측이 생성되었습니다. 매크로를 사용하여 TUJ3 채널에 자동 임계값을 적용하여 마스크를 생성하고 '분석'을 사용하여 TUJ3 마스크 내의 CC1 신호 영역을 정량화하여 뉴런 내 CCXNUMX 세포사멸 마커의 발현을 각 시야에 대해 결정했습니다. 입자의 기능. 차별화 간의 배치 효과를 설명하기 위해 절대 측정값을 제어 라인의 평균으로 정규화하여 표현의 배수 변화를 생성했습니다.

공동 배양에서 신경돌기 성장의 정량화

신경돌기를 나타내지만 신경세포체를 피하는 무작위로 선택된 뷰 필드의 60~1개 z-스택을 각 커버슬립에 대해 1x 배율로 얻었습니다. 최대 강도 예측은 피지에서 생성되었습니다. 매크로를 사용하여 TUJXNUMX 염색에 자동 임계값을 적용하고 피지의 '입자 분석' 기능을 사용하여 시야당 TUJXNUMX 양성 신경돌기의 면적을 측정하여 각 시야에 대한 신경돌기 성장을 결정했습니다.

신경 시냅토파이신 발현 분석

무작위로 선택된 시야의 60~XNUMX개의 z-스택 이미지를 각 커버슬립에 대해 XNUMXx 배율로 촬영했습니다. 최대 강도 예측은 피지에서 생성되었습니다. 매크로를 사용하여 시냅토파이신 염색에 자동 임계값을 적용하여 점형 구조를 분석했으며, 피지의 '입자 분석' 기능을 사용하여 각 뷰 필드에 대해 시냅토파이신 입자의 수와 면적을 결정했습니다.

RNA스코프

제조사의 지시에 따라 RNAscope Multiplex Fluorescent v2 Assay(323100, ACD)를 사용하여 RNA 초점을 검출했습니다. 간단히 말하면, 4% PFA로 고정된 iPSC 미세아교세포를 50%, 70% 및 100% 에탄올로 각각 1분 동안 순차적으로 탈수시키고 -20°C에서 보관했습니다. 100%, 70% 및 50% 에탄올로 재수화시킨 후, 세포를 PBS, 과산화수소 및 프로테아제 III(희석 비율 0.1:20) 중 1% Tween-15과 함께 각각 10분 동안 배양하고, 그 사이에 PBS 세척을 했습니다. (G₄C₂)_n 그리고 (C₄G₂)_n 확장(ACD, 884351-C2 및 884361-C2)을 별도의 커버슬립에 추가하고 2시간 동안 배양한 후 표준 프로토콜에 따라 증폭 및 개발 단계를 수행했습니다. 순차적 ICC는 IBA1(1:200, 019-19741, Wako Fujifilm)에 대한 2차 항체와 함께 실온에서 XNUMX시간 동안 인큐베이션한 다음 위에서 설명한 면역형광 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

소교세포에서 RNA 초점 형성의 정량화

무작위로 선택된 시야의 40개 z-스택 이미지는 각 커버슬립에 대해 63x 또는 XNUMXx 배율로 촬영되었으며 피지에서 최대 강도 투영이 생성되었습니다. 초점 양성 세포의 수와 초점 양성 핵당 초점의 수는 수동 계산으로 결정되었습니다.

MTS 생존력 분석

선택된 실험에서, 제조업체의 지침에 따라 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS, G3580, Promega)를 사용하여 MN 생존력을 결정했습니다. 플레이트 판독은 분석 시약과 함께 90-120분 동안 배양한 후에 수행되었습니다.

사이토카인/케모카인 및 신경필라멘트 방출 측정

배양 상층액을 수집하고 1200 xg 및 4°C에서 10분간 회전시켰습니다. 풀링된 샘플은 제조업체의 지침에 따라 Proteome Profiler Human XL Cytokine Array(ARY022B) 또는 Protease/Protease Inhibitor Array(ARY025, R&D Systems 모두)를 사용하여 분석되었습니다. 신호는 ChemiDoc에서 시각화되었습니다.^TM MP 이미징 시스템(Bio-Rad)을 사용하고 ImageStudioLite v5.2.5(LI-COR)를 사용하여 분석했습니다. 또한 Human DPP4(DC260B), MMP9(DMP900), CXCL10 Quantikine ELISA(DIP100) 및 Active MMP9 Fluorokine E Kit(F9M00, 모든 R&D Systems)를 제조업체의 지침에 따라 사용했습니다. 인간 신경필라멘트 경쇄(NfL) 방출은 제조사의 지침에 따라 Meso Scale Discovery(MSD) 분석(K1517XR-2)을 사용하여 측정되었습니다.

단백질 추출

세포를 PBS로 헹구고 100-200 μL의 차가운 RIPA 완충액 (ThermoFisher)을 완전하게 보충했습니다.^TM 프로테아제 억제제 칵테일 및 PhosSTOP^TM 포스파타제 억제제(모두 Merck)를 각 웰에 첨가했습니다. 모터 구동 막자를 사용하여 10개의 1s-임펄스를 샘플당 적용하여 용해물을 균질화했습니다. 얼음 위에서 30분 동안 배양한 후 샘플을 12,000rpm에서 4회 원심분리했습니다.^oC에서 15분 동안 방치하고 상청액을 -80°C에 보관하였다. Pierce를 사용하여 단백질 농도의 정량화를 수행했습니다.^TM 제조업체의 지침에 따른 Bicinchoninic Acid Protein Assay 키트(ThermoFisher). 그런 다음 증류수에 희석하여 정의된 농도(0.3–1.0 μg/μL)로 단백질 샘플을 준비했습니다. NuPAGE^TM 로딩 버퍼 및 NuPAGE^TM 샘플 환원제(둘 다 ThermoFisher). 그 후 95°C에서 5분 동안 배양하여 샘플을 변성시키고 환원시켰습니다.

웨스턴 블롯

5~20μg의 각 샘플과 Spectra Multicolour Broad Range Protein Ladder 또는 PageRuler™ Prestained Protein Ladder(모두 ThermoFisher)를 사전 제작된 NuPAGE에 로드했습니다.^TM Bis-Tris 4~12% 그래디언트 젤(ThermoFisher). 샘플은 NuPAGE를 사용하여 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리되었습니다.^TM 50-130V의 MES 실행 완충액(ThermoFisher). 그런 다음 iBlot 20 Dry blotting 시스템(모두 ThermoFisher)을 사용하여 단백질을 25-7V에서 2분간 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼습니다. TBS/5% Tween-0.1(TBS-T, ThermoFisher) 중 20% 우유 또는 BSA로 실온에서 XNUMX시간 동안 차단한 후, 막을 보충 표에 나열된 XNUMX차 항체와 함께 배양했습니다. 4 밤새 3°C에서 TBS-T의 4% 우유 또는 BSA로 희석되었습니다. 막을 TBS-T로 7분 동안 1회 세척한 다음 상응하는 양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 결합 1차 항체와 실온에서 5000시간 동안 배양했습니다. 다음과 같은 HRP 결합 931차 항체(모두 934:1)가 사용되었습니다: 양 항-마우스 HRP(NA28664V), 당나귀 항-토끼 HRP(NA7V, 둘 다 GE Healthcare), 당나귀 항-염소 HRP(PAXNUMX-XNUMX, ThermoFisher) . 막을 다시 TBS-T로 XNUMX분 동안 XNUMX회 세척한 후 강화된 화학발광 용액(Millipore)과 함께 XNUMX분 동안 인큐베이션했습니다. 케미닥^TM 신호를 시각화하기 위해 MP 이미징 시스템이 사용되었습니다. Fiji v1.53q를 사용하여 밴드 강도를 정량화했습니다.⁴⁵ 하우스키핑 유전자 β-액틴 또는 GAPDH와 각 실험에 대한 대조군의 평균 발현으로 정규화되었습니다. 현상 후 멤브레인을 TBS-T로 5분간 10회 세척한 후 Restore로 XNUMX분간 배양했습니다.^TM PLUS 스트리핑 버퍼(ThermoFisher). TBS-T로 5회 추가로 XNUMX분간 세척한 후, 막을 차단하고 위에서 설명한 대로 새로운 XNUMX차 항체와 함께 배양했습니다.

Poly(GA)/(GP) 발현 분석

세포를 2x 완전 미니, EDTA 유리 프로테아제 억제제 칵테일(Merck) 및 2% SDS(ThermoFisher)가 보충된 RIPA 완충액(Sigma-Aldrich)에서 용해시키고 초음파 처리로 균질화했습니다. 17,000 ×에서 원심분리 후 g 16°C에서 20분 동안 상등액의 단백질 함량을 보충 방법에 설명된 대로 결정했습니다. 이전에 설명한 대로 샘플을 동일한 농도(0.6–1.0 mg/mL)로 조정하고 96웰 SECTOR 플레이트(MSD)를 사용하여 단일체에서 MSD 면역분석을 수행하여 폴리(GA)/(GP) 발현을 정량화했습니다.²⁰. 간단히 말해서, 플레이트는 표지되지 않은 항-폴리(GP) 또는 항-폴리(GA) 항체로 코팅되었습니다. 차단 후, 샘플은 폴리(GP) 면역분석의 경우 웰당 45μg의 단백질로, 폴리(GA)의 경우 27μg의 단백질로 로드되었습니다. 비오티닐화된 항-폴리(GP) 및 항-폴리(GA) 항체를 검출기로 사용하고 이어서 설포-태그된 스트렙타비딘(Meso Scale Discovery, R32AD)을 사용했습니다. MSD Sector Imager 92을 사용하여 MSD 판독 완충액(Meso Scale Discovery, R2400TC)으로 플레이트를 판독했습니다. 신호는 분석 플레이트의 전기화학적 자극 시 방출된 빛의 강도에 해당합니다. 분석에 앞서, 펩타이드가 포함되지 않은 교정기의 평균 판독값을 각 판독값에서 뺍니다. 음의 신호는 '0'으로 설정되었습니다.

통계 및 재현성

표본 크기를 미리 결정하는 데 통계적 방법은 사용되지 않았습니다. 조사자는 실험 설계에 의해 허용되는 경우 분석 중에 할당에 대해 눈이 멀었습니다. GraphPad Prism 9를 사용하여 통계 분석을 수행했습니다. 분석에서 제외된 데이터는 없습니다. 여러 라인과 차별화된 데이터를 모아서 전체 효과를 비교했습니다. C9orf72 HRE 대 대조군. 두 그룹의 비교는 그림 범례에 표시된 대로 적절한 사후 테스트를 통해 단방향 또는 양방향 ANOVA에 의한 양측 비대응 t-검정과 다중 그룹 비교로 수행되었습니다. 독립적인 실험과 선의 수는 각 그림 범례에 표시되어 있습니다. 데이터는 단일 데이터 포인트로 표시되며 ± SEM을 의미합니다. 다음과 같은 경우에 차이가 중요한 것으로 간주되었습니다. P < 0.05 (*P <0.05; **P <0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; ns: 중요하지 않음). 상자 도표에는 중앙값(중심선), 상한 및 하한 사분위수(상자 한계), 1.5x 사분위수 범위(수염) 및 이상치(점)가 표시됩니다. GraphPad Prism 9 또는 RStudio 1.4.1103을 사용하여 데이터를 표시했습니다. 그림의 최종 조립은 Adobe Illustrator 25.4.1을 사용하여 수행되었습니다.

보고 요약

연구 설계에 대한 추가 정보는 Nature 포트폴리오 보고 요약 이 기사에 링크되어 있습니다.

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출처: https://www.nature.com/articles/s41467-023-41603-0

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