윤리학

모든 동물 실험 절차는 CNU IACUC-H-2021-51 프로토콜에 따라 전남대학교 동물 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 동물연구시설의 유지관리 및 실험절차는 농림축산식품부에서 제정한 동물복지법의 지침에 따라 엄격하게 수행되었습니다.

플라스미드 구성

원핵 발현 시스템(pFlaB)으로부터 FlaB의 구성 및 생산은 이전에 기술되었습니다.16]. 간략하게, 비브리오 vulnificus 플라겔린 B(플랩) 유전자를 pTYB12 벡터에 클로닝하였다. 그 후, 생성된 발현 플라스미드를 형질전환시켰다. E. 대장균 ER2566(New England Biolabs, Beverly, MA)을 전기천공법에 의해. 암피실린 항생제가 함유된 LB 플레이트에 박테리아를 뿌렸습니다. 그런 다음 박테리아를 배양하고 유도제 0.5mM IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드)를 배양액의 0.6~0.8 OD600에 첨가하고 20°C에서 18~20시간 동안 배양했습니다. 다음으로, 박테리아를 펠렛화하고 용해 완충액(20mM Tris-Cl [pH 7.5], 500mM NaCl, 1mM EDTA [pH 8.0], 0.1% Triton X-100, 0.1% Tween 20, 20M)에 재현탁했습니다. 페닐메틸설포닐 플루오라이드) 및 얼음 침대 위에서 초음파 처리(Vibra Cell VCX500; Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT)되었습니다. 35,000 × 원심분리 후 g 30분 동안 상층액을 키틴 수지 비드와 혼합하고 부피가 끝날 때까지 4°C에서 천천히 떨어뜨려 비특이적 단백질을 제거하고 세척 완충액(20 mM Tris-Cl [pH 7.5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA)으로 세척했습니다. [pH 8.0]). 마지막으로 용출 완충액(20 mM Tris-Cl [pH 7.5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA [pH 8.0], 50 mM 1,4-dithiothreitol)을 이용하여 단백질을 용출하고 SDS-를 통해 pFlaB의 순도를 확인하였다. 페이지. 진핵생물 발현 FlaB(eFlaB)의 경우 코돈 최적화 플랩 유전자 서열은 한국의 Bioneer Inc.에서 합성되었습니다. 그만큼 플랩 정방향 프라이머인 5'-CCC를 이용한 PCR 반응으로 유전자를 증폭시켰습니다.AAGCTTGCCGTCAACGTGAACACCAA-3' 함유 힌드Ⅲ (AAGCTT) 부위 및 역방향 프라이머, 5'-ATAGTTTAGCGGCCGCGCCCAGCAGGGAGAGGGCGC-3' 함유 노아이 (GCGGCCGC) 사이트. 증폭된 플랩 및 진핵생물 발현 벡터 pSectag2B(Invitrogen, V900-20)를 제한효소로 분해하였다. 힌드Ⅲ 과 노아이 밤새 37°C에서. 그런 다음 우리는 플랩 T2 DNA 리가제(enzynomics, M4S)를 사용하여 pSectag001B 벡터를 실온에서 2시간 동안 처리했습니다. 결찰된 플라스미드를 형질전환시켰다. 대장균 TOP10 수용 세포를 암피실린이 함유된 LB 한천 플레이트에 펼칩니다(보충 표 1). 서열은 마크로젠 온라인 서열분석 시스템(Macrogen online sequencing system)에 의해 확인되었습니다.http://dna.macrogen.com/kor/).

DNA 형질감염, 단백질 정제 및 특성 규명

포유류 세포주 Expi293^TM Thermofisher Scientific에서 구입했습니다. 제조업체 프로토콜(Thermofisher, A14635)에 따라 ExpiFectamine을 사용하여 DNA 형질감염을 수행했습니다. 간단히 말해서 Expi293은^TM 세포를 37°C, 8% CO에서 배양했습니다.₂및 형질감염 전 125회 이상의 계대까지 인큐베이터(eppendorf, S41I230011)의 진탕 속도는 1rpm입니다. 형질감염 당일(3일), 10×XNUMX⁶ 만료293^TM 세포/ml를 접종하고 다음을 함유하는 정제된 pSectag2B 플라스미드로 형질감염시켰습니다. 플랩 유전자. 2일차에는 인핸서 I과 인핸서 II를 첨가하여 4일차까지 배양하였다. 4일차에는 배양배지를 수확병에 옮겨 35,000×에서 원심분리하였다. g 4°C에서 20분 동안. 상청액을 수집하고 10x 용해 완충액(500mM NaH)과 혼합했습니다.₂PO₄, 1.5 M NaCl 및 100 mM 이미다졸, pH = 8)을 9:1의 비율로 사용합니다. 혼합물을 3℃에서 30230ml의 단백질 혼합물에 대해 30ml의 Ni-NTA 아가로스 비드(Qiagen, 4)를 함유하는 평형화된 Niken 컬럼에 첨가했습니다. 비특이적 단백질을 제거하기 위해 컬럼을 세척 완충액 I(50mM NaH)로 세척했습니다.₂PO₄, 300mM NaCl 및 10mM 이미다졸, pH=8) 및 세척 완충액 II(50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl 및 20mM 이미다졸, pH = 8). 단백질을 용출 완충액(50mM NaH)으로 용출시켰습니다.₂PO₄, 300mM NaCl 및 250mM 이미다졸, pH = 8) 실온에서 15분 동안. 원심분리 필터 튜브(Merck, UFC801024)를 사용하여 완충액을 인산염 완충 식염수(PBS)로 변경했습니다. 재조합 eFlaB 단백질 순도는 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 완전 프로인트 보조제(Sigma, CAS9007-81-2) 및 HRP-접합된 마우스에서 생성된 항-FlaB 항체를 사용한 후속 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인되었습니다. 항-마우스 다클론 0260차 항체(Dako, PXNUMX).

TLR5 의존성 NF-κB 리포터 분석

광범위한 단백질 농도에서 eFlaB의 NF-κB 자극 활성을 측정합니다(그림 XNUMX 및 XNUMX). 1c 과 2c), 우리는 HEK-Blue를 사용했습니다^TM HEK-Blue가 포함된 hTLR5 세포(InvivoGen, hκb-htlr-5)^TM 제조사의 프로토콜에 따른 검출(InvivoGen, hb-det2) 분석 시스템. EC를 계산했습니다.₅₀ 각 단백질 농도에 대해 620배의 ODXNUMX nm 값을 사용합니다. 탈당화된 eFlaB 변이체의 생물학적 활성을 확인하기 위해(보충 그림 XNUMX) 3b), 우리는 HEK293T 세포를 사용하여 시험관 내 NF-κB 루시퍼라제 리포터 분석을 수행했습니다. HEK293T 세포를 DMEM 배지(Gibco^TM, 11995-065) 10% FBS, 100 단위/ml의 항생제를 포함함(Gibco^TM, 15140122), 37°C, 5% CO₂. NF-κB 리포터 분석에는 최소 3회 계대의 세포가 사용되었습니다. 세포는 2 × 10⁵/well을 24웰 플레이트(SPL Life Sciences, Korea, 30024)에 24시간 동안 넣고 리포터 플라스미드 pNFκB-Luc(100ng/웰), p3x Flag-hTLR5(100ng/웰) 및 50ng/로 형질감염시켰습니다. 하룻밤 동안 5μl/웰의 Effectene(Qiagen, Germany, 301427)을 사용하여 pCMV-β-Gal을 잘 처리합니다. 형질감염된 세포를 pFlaB, eFlaB 또는 돌연변이 eFlaB로 화학량론적 농도로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배지를 배양물에서 제거하고 세포 용해 완충액(Promega, Madison, WI USA, E153A)으로 세포를 처리했습니다. 세포 용해물로부터 루시퍼라제 활성을 루미노미터(Berthold, Lumat-Plus LB96V)로 측정했습니다.

효소 처리에 의한 eFlaB의 탈당화

eFlaB는 제조업체 프로토콜에 따라 비변성 형태를 사용하여 펩티드 N-글리코시다제 F(PNGase F) 효소(Promega, Madison, WI USA, V483A)에 의해 탈당화되었습니다. 간략하게, PNGase F(10 U/μl)를 eFlaB(15 μg)에 첨가하고 37°C에서 2시간 동안 배양했습니다.

N-당화 위치 예측

우리는 NetNGlyc-1.0을 사용하여 FlaB의 N-글리코실화 위치를 예측했습니다(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0), N-글리코실화 공통 서열 Asn-Xaa-Ser/Thr을 결정하는 생물정보학 도구입니다.

부위 지정 돌연변이 유발

부위 지정 돌연변이 유발 eflaB 제조사 프로토콜(Enzynomics, Inc., 대한민국 대전, EZ004M)에 따라 수행되었습니다. 간단히 말해서, pSectag2B 플라스미드는 eflaB 유전자는 특정 프라이머를 사용한 PCR 반응의 주형으로 사용되었습니다 (보충 표 2) "AAC" 또는 "AAT"(아스파라긴, N)에서 "GCC" 또는 "GCT"(알라닌, A)로 돌연변이되도록 설계되었습니다. 돌연변이 eflaB 마크로젠 온라인 시퀀싱 시스템(Macrogen Online Sequencing System)으로 서열을 확인했습니다.http://dna.macrogen.com/kor/).

공동면역침전(Co-IP)

간단히 말해서, 우리는 HEK293T 세포를 p3XFlag-hTLR5 플라스미드로 24시간 동안 형질감염시켰습니다. 프로테아제 억제제가 포함된 RIPA 완충액을 사용하여 세포를 용해시킨 후 초음파 처리한 다음 원심분리하여 상청액을 수집했습니다. 단백질, pFlaB, eFlaB, eFlaB^N83/101/139A및 eFlaB^{N83/101/139/273/330A}, 상층액과 혼합하고 밤새 4°C에서 회전했습니다(복합체 I). 동시에, 우리는 Protein A/G plus-agarose(Santa Cruz Biotechnology, sc-2003)를 항 Flag 태그 항체(Abcam, ab1162; 1:40 희석)와 혼합하고 밤새 4°C에서 회전시켰습니다( 콤플렉스 II). 그런 다음 복합체 II를 IP 완충액(1% TritonX-100, 25mM Tris pH 7.5, 10% Glycerol, 150mM NaCl, 1mM DTT, 1mM EDTA 및 프로테아제 억제제)으로 5회 세척했습니다. 다음으로 복합체 I과 II를 혼합하고 4°C에서 6시간 동안 회전시켰습니다. 마지막으로, 비특이적 결합 단백질을 제거하기 위해 복합체를 IP 완충액으로 50회 세척했습니다. 세척 후 1x SDS 로딩 버퍼 10 μl를 넣고 1분간 끓였습니다. SDS-PAGE 및 추가 웨스턴 블롯을 분석했습니다. 우리는 pFlaB 및 eFlaB 변종을 각각 검출하기 위한 Western blot 분석을 위해 마우스 항-FlaB(2,000:46 희석) 및 항-Myc-HRP(Novex®, 0709-1; 2,000:XNUMX 희석)라는 두 가지 다른 항체를 사용했습니다. eFlaB 변이체는 Myc-tag와 함께 발현되었기 때문에 eFlaB의 글리코실화로 인해 항-FlaB가 낮게 검출되었으며 이는 항-Myc에 의해 잘 검출되었습니다(그림 XNUMX). 2d).

N-당화 단백질 분석을 위한 Concanavalin A 컬럼

ConA Glyco단백질 분리 키트(Thermo Scientific, USA, 89804)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 글리코실화된 eFlaB만이 콘카나발린 A(ConA)에 결합하는지 여부를 확인했습니다. 간단히 말해서, ConA 렉틴 수지 슬러리를 스핀 컬럼에 피펫팅하고 1 ×에서 1,000분간 원심분리했습니다. g 바인딩/세척 버퍼로 레진을 세 번 헹구십시오. 단백질을 결합/세척 완충액 200μg에 500μl로 희석하고 컬럼의 레진과 혼합한 후 실온에서 10분 동안 회전시켰습니다. 그런 다음 컬럼을 1×에서 1000분 동안 원심분리했습니다. g 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 컬럼 내의 레진을 결합/세척 완충액으로 여러 번 세척하고 용출 완충액 100μl를 첨가한 후 상온에서 5분간 컬럼을 회전시켰다. 컬럼을 다시 1×에서 1000분 동안 원심분리했습니다. g 용출된 단백질을 수집합니다. 결합되지 않은 단백질과 용출된(ConA 결합된) 단백질을 SDS-PAGE로 분석했습니다.

비강 내 예방접종

50주령 암컷 BALB/c 마우스(한국 경기도 성남시 오리엔트)를 우리 시설에서 XNUMX주일 동안 숙주적응시킨 후 실험을 진행하였다. 쥐에게 Zoletil® XNUMX(Virbac Corporation, Carros, France)과 Rompun의 혼합물을 피하 투여했습니다.^TM (엘랑코동물건강코리아(주)). 마우스를 마취한 후 PBS, 분할 H1N1 항원(sH1N1)(녹십자, 화순, 한국), sH1N1+pFlaB, sH1N1+eFlaB, sH1N1+eFlaB를 비강 내 투여했습니다.^N83A, sH1N1+eFlaB^N83/101A, sH1N1+eFlaB^N83/101/139A, sH1N1+eFlaB^{N83/101/139/273A}및 sH1N1+eFlaB^{N83/101/139/273/330A}. 백신 항원을 PBS에서 sH20N1 1μg/마우스 및 pFlaB 또는 eFlaB 0.2μg/마우스의 용량에 해당하는 4μl/마우스의 최종 부피로 희석했습니다. 마우스를 2주 간격으로 2회 면역화시켰고, 최종 면역화 XNUMX주 후 분석을 위해 혈청을 취하였다.

효소 결합 면역 측정법 (ELISA)

sH1N1, pFlaB 및 eFlaB 특이적인 항체 반응은 안와후 출혈에 의한 최종 면역화 3690주 후 수집된 마우스 혈청을 사용하여 ELISA로 측정되었습니다. ELISA 플레이트(Corning Laboratories, 1)를 PBS 중 sH1N4(1μg/ml), pFlaB 또는 eFlaB(4μg/ml)로 1°C에서 밤새 코팅하고 완충액[17385 mM EDTA(JUNSEI, 0401S0.5) 및 PBS-T에 2153% BSA(Sigma, A50-40G)]를 실온(RT)에서 2시간 동안 첨가합니다. 혈청을 차단 완충액에 연속적으로 희석하고 5μl/웰로 첨가하고 실온에서 1036시간 동안 배양했습니다. 플레이트를 05회 세척하고 HRP-접합 항-마우스 IgG 1차 항체(Southern Biotech, 2,000-1; 5:3,3 희석)를 실온에서 5,5시간 동안 첨가했습니다. 555214회 세척 후 1'XNUMX'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질(BD OptEIA, XNUMX)을 첨가하여 신호를 발생시키고 XNUMX NH를 첨가하여 반응을 정지시켰다.₂SO₄. 흡광도는 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA)를 사용하여 450 nm에서 측정되었습니다. 항체 역가는 블랭크 웰보다 2배 더 높은 흡광도 값을 생성하는 혈청 희석의 역수 Log2 값으로 계산되었습니다.

보고 요약

연구 설계에 대한 추가 정보는 자연 연구보고 요약 이 기사에 링크되어 있습니다.

• SEO 기반 콘텐츠 및 PR 배포. 오늘 증폭하십시오.
• PlatoData.Network 수직 생성 Ai. 자신에게 권한을 부여하십시오. 여기에서 액세스하십시오.
• PlatoAiStream. 웹3 인텔리전스. 지식 증폭. 여기에서 액세스하십시오.
• 플라톤ESG. 탄소, 클린테크, 에너지, 환경, 태양광, 폐기물 관리. 여기에서 액세스하십시오.
• PlatoHealth. 생명 공학 및 임상 시험 인텔리전스. 여기에서 액세스하십시오.
• 출처: https://www.nature.com/articles/s41541-023-00738-3