윤리 강령

모든 동물 연구는 Canadian Council on Animal Care Guidelines의 권장 사항에 따라 수행되었습니다. 원고에서 이 데이터의 보고는 ARRIVE 지침의 권장 사항을 따릅니다. University of Calgary Health Sciences Animal Care Committee는 이 연구에 사용된 모든 동물 프로토콜과 수술 절차를 승인했습니다(Ethics ID# AC16-0043).

iPSC 생성

C57BL/6 배아(12.5일)를 수확하고, Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 헹구고, 침연했습니다. 0.25% 트립신으로 처리한 후, 생성된 세포 현탁액을 여과하여 파편을 제거하고 고포도당 DMEM(Gibco), 10% FBS(Gibco), 1X MEM No-Essential Amino Acids(Gibco), 50 단위/ml 페니실린에 도말했습니다. -스트렙토마이신(깁코). 생성된 마우스 배아 섬유아세포(MEF)는 iPSC를 생산하기 위한 세포 리프로그래밍을 위해 Applied Biological Materials Inc.(Richmond, BC)로 배송되었습니다. MEF는 렌티바이러스 SFFV-OCT4, -SOX2 및 -KLF4로 형질도입되었습니다. 9주일 후, ESC 유사 콜로니를 피더가 있는 신선한 웰로 옮겼다. 피더 세포에서 6회 통과한 후 마우스 iPSC를 UCalgary로 배송했습니다. GFP를 게놈에 통합하기 위해 CRISPR/Cas26를 사용하여 HITI(homology-independenttargeted integration) 기술을 사용하여 마우스 안전 하버 ROSA136 유전자좌에 10kb 이식유전자를 삽입했습니다[916]. 각각의 뉴클레오펙션 반응을 위해, 10 ng/μl의 CRISPR DNA 719 μl 및 9 ng/μl GFP 구성물의 28.98 μl와 혼합된 414 ng/μl Cas1001 DNA 구성물의 DNA 023 μl를 iPSC에 사용했습니다. 모든 DNA 구조는 물에 용해되었습니다. 각각의 뉴클레오펙션 반응을 위해, 제조사의 지시에 따라 프로그램 A-1에서 뉴클레오펙션 키트(마우스 뉴클레오펙터 키트, Lonza, Cat. No. VPH-0.25)와 함께 5만 개의 iPSC를 갖는 구조물을 사용하였다. Nucleofected iPSC는 37일 동안 ESC 배지로 젤라틴 및 MEF 코팅 플레이트에서 성장했습니다. 그런 다음 SSEA1 마커를 사용한 FACS를 수행했습니다. iPSC는 1°C에서 21702분 동안 15% 트립신으로 효소적으로 소화되었습니다. 단일 세포를 차가운 DPBS로 1회 세척하고 96 μg/ml 농도의 접합된 SSEA26-PE(Santa cruz: sc-1.10 PE)로 XNUMX분 동안 염색했습니다. GFP 및 SSEAXNUMX iPSC에 대한 이중 양성은 젤라틴 코팅된 XNUMX-웰 플레이트, 하나의 셀/웰로 분류되었습니다. 클론을 시퀀싱하여 ROSAXNUMX 유전자좌에서 이식유전자의 올바른 위치 및 방향을 결정했습니다. 세포가 기능적 iPSC로 남아 있는지 확인하기 위해 기형종 분석을 수행했습니다. 여기서 XNUMX⁶ 세포를 SCID-beige 마우스의 등 부위에 피하 이식하였다. 샘플을 고정, 처리 및 파라핀에 삽입했습니다. 10μM 두께로 절단하여 Safranin O로 염색하였다.

iPSC 문화

뮤린 iPSC는 T25 플라스크(Fisher)에서 유사 분열적으로 불활성화된 마우스 배아 섬유아세포(MEF)에서 일상적으로 배양되었습니다. 배양 배지는 1% 비필수 아미노산, 1% Anti-Anti, 15% 태아 소 혈청(FBS) 및 0.1mM β-메르캅토에탄올(모두 Invitrogen)이 보충된 고포도당 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, Lonza)으로 구성되었습니다. . iPSC 만능성을 유지하기 위해 배양 배지에 1000 U/ml 백혈병 억제 인자(LIF)를 보충했습니다. 세포는 80일에서 5일마다 약 XNUMX% 합류에 도달할 때 일상적으로 계대되었고 XNUMX% COXNUMX가 있는 가습 인큐베이터에서 유지되었습니다.₂ 37 °C에서. 세포를 콜라겐 스캐폴드에 추가하기 전에 한 계대 배양하여 과도한 MEF를 제거하기 위해 젤라틴(0.1%, Fisher) 코팅된 플라스크에서 배양했습니다.

비계 준비

콜라겐-I 스캐폴드는 이전에 발표된 방법에 따라 준비되었습니다.^7,14,18. 소 원섬유 콜라겐 I(3 mg/ml, PureCol, Advanced Biomatrix)를 3D 겔로 중합했습니다. 간략하게, 80% v/v 3 mg/ml I형 콜라겐 용액을 1백만 세포/ml iPSC 현탁액 및 20× 농축 Dulbecco's 변형된 5% v/v 베타-글리세롤 포스페이트(βGP, Sigma Aldrich)와 혼합했습니다. 독수리 배지(DMEM)¹⁸. 이어서, 15% FBS(Invitrogen), 1% 비필수 아미노산, 1% Anti-Anti 및 0.1mM β-메르캅토에탄올(모두 Invitrogen)을 첨가하였다.¹⁸. 콜라겐-I/iPSC 구조물을 웰당 96μl의 부피로 100-웰 플레이트에 분배했습니다. 중합된 스캐폴드를 37°C 및 5% CO의 인큐베이터에 넣었습니다.₂ 동물 모델에 생체 내 이식 전 5일 동안 미리 분화합니다. 콜라겐 단독 발판 제어의 경우 위의 프로토콜도 수행되었지만 iPSC는 추가되지 않았습니다. 프로세스의 일반적인 개요는 보충 그림에 나와 있습니다. S1.

실시간 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)

iPSC가 있는 콜라겐-I 스캐폴드는 시딩 후 0, 1, 3, 5, 8, 11, 13, 15, 18 및 21일 시점에 수집되었습니다. Trizol(Invitrogen)을 첨가하고 니들링된 26 ½ 게이지를 사용하여 Trizol의 콜라겐/세포 매트릭스를 용해했습니다. 제조업체의 권장 프로토콜을 사용하여 RNA를 분리했습니다. 고용량 cDNA 역전사 키트(ThermoFisher)를 사용하여 cDNA를 준비했습니다. 프로브를 다시 사용하여 ABI QuantStudio 6에서 RT-PCR을 수행했습니다. Sp7 (Mm04209856_m1) 및 비글랩 (mm03413826_mH), Ibsp (Mm00492555_m1), 삭스9 (Mm00448840_m1), Col2a1 (Mm01309565_m1), Oct4 (Mm03053917_g1), 나노그 (Mm02019550_s1) 18S(Mm03928990_g1)를 하우스키핑 컨트롤로 사용합니다.

유동 세포 계측법에 의한 생존력 평가

세포를 콜라게나아제 I 처리로 단일 세포 현탁액으로 분리하고 분석을 위해 Attune NXT 및 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 유세포 분석을 실시했습니다. 샘플당 최소 XNUMX개의 이벤트가 등록되었으며, 세포 파편 및 응집체를 피하기 위해 적절한 스캐터 게이트를 사용하여 전체 세포 분석을 수행했습니다. 제조 지침에 따라 Annexin-PI 키트(ThermoFisher)를 사용하여 세포를 염색했습니다.

동물 모델

MPC 계통 추적 마우스(힉1^cre-ERT2:로사^td토마토) C57BL/6 배경의 T. Michael Underhill 박사(브리티시 컬럼비아 대학교)가 제공했습니다. 8-12주령의 수컷과 암컷 모두 이 연구에 사용되었습니다. 손상되지 않은 난소 절제술(OVX) 마우스의 뼈 손상에 대한 실험 설계는 보충 그림 XNUMX에 묘사되어 있습니다. S2.

이 마우스 모델에서 내인성 MPC는 타목시펜 유도 후 tdTomato로 영구적으로 표지되었습니다. 마우스를 마취시키고 타목시펜의 활성 이성질체를 복강내 주사하였다((Z)-4-하이드록시타목시펜(Hydroxytamoxifen, Sigma)을 멸균 해바라기유에 용해시켰다. 마우스에 100일에 걸쳐 하루에 한 번 100 μl 타목시펜 용액(4 mg/kg)을 주사한 후, 재조합을 허용하기 위해 1주 대기 기간이 뒤따랐습니다.

마지막 타목시펜 주사 XNUMX주일 후, 버홀(임계 크기가 아닌) 손상을 수행하였다. Burr-hole 부상은 이전에 Taiani 등이 설명한 절차에 따라 수행되었습니다..^12,13,19, 이전에 Uusitalo et al에 의해 발표된 방법에서 수정되었습니다..²⁰ 마우스를 수의학용 이소플루란으로 마취시키고 부프레노르핀 0.1 ml를 수술 전에 피하 투여하였다. 고속 마이크로 드릴(Fine Science Tools)을 사용하여 근위 경골 골단부의 골수강(반대편을 손상시키지 않고)에 직경 0.7mm의 구멍을 뚫었습니다.¹⁹.

항상성 골절 모델에서 마우스를 처리되지 않은 대조군, 빈 콜라겐 I 구조 및 콜라겐 I + iPSC의 세 그룹으로 나누었습니다. 천공 손상 직후, 처리되지 않은 대조군 마우스의 피부를 스테이플러로 고정하여 절개 부위를 봉합했습니다. 빈 콜라겐 I 및 콜라겐 I + iPSC 처리 마우스의 경우, 세포가 있거나 없는(마우스당 100 iPSCs) 젤 100,000 μl를 천공 구멍 결함에 이식했습니다. 그런 다음 절개 부위를 스테이플로 닫고 마우스를 새장으로 되돌려 수술 직후 체중 부하를 허용했습니다.

항상성 골절 치유 모델의 실험 설계와 유사한 Hic1^cre-ERT2:로사^td토마토 4일 동안 하루에 한 번 복강내 타목시펜 주사를 맞았습니다. 마지막 타목시펜 주입 0.1주일 후, 마우스는 OVX 수술을 받았습니다. 간략하게, 마우스를 마취시키고 수술 전에 XNUMXml의 부프레노르핀을 투여하였다. 양쪽 난소를 찾아 절제했습니다. OVX 수술 XNUMX주일 후 버홀 수술을 시행하였다. OVX 마우스를 XNUMX개의 그룹으로 나누었다: OVX 미처리 대조군, OVX 빈 콜라겐 I 구조, 및 OVX 및 콜라겐 I + iPSC.

조직학 및 면역형광

경골을 탈회, 가공 및 파라핀 왁스에 포매하고 10μm에서 단면화했습니다. Safranin-O/fast-green 염색 및 면역형광법을 수행하였다. 사용된 특정 마커는 TdTomato, GFP, Anti-Mo/Rt Ki-67 eFluor 660 Clone SolA15(Invitrogen, Ki67), Bone sialoprotein(BSP) Clone WVID1(9C5)(Developmental Studies Hybridoma Bank)입니다. 슬라이드는 DAPI(Biotium)가 포함된 EverBrite™ Hardset Mounting Media로 처리되었고 Zeiss Axioscan 현미경을 사용하여 이미지화되었습니다.

조직 세포 계측법

정량 분석을 위해 관심 영역을 디지털 그레이스케일 이미지로 획득했습니다. 주어진 표현형의 세포를 식별하고 TissueQuest 소프트웨어(TissueGnostics)를 사용하여 정량화했으며, 컷오프 값은 음성 대조군(염색되지 않은 대조군 및 XNUMX차 단독 대조군)에 상대적으로 결정되었습니다. 단일/이중 양성 세포의 게이팅 및 정량화는 이러한 임계값을 사용하여 수행되었습니다.

X선 현미경(Xradia)

C57BL/6 마우스(정상 및 OVX)에서 X선 ​​현미경(XRM) 이미징을 사용하여 손상 영역 내의 뼈 구조 및 캘러스 형성을 평가했습니다. 경골(연조직 및 근육 포함)을 수확하고 10시간 동안 24% 중성 완충 포르말린(NBF)에 고정했습니다. 24시간 후, 뼈에서 모든 연조직과 근육을 제거했습니다. XRM 이미징까지 샘플을 70% 알코올에 넣었습니다. XRM용 샘플을 준비하기 위해 알코올에서 경골을 제거하고 직립 홀더에 폼을 사용하여 고정했습니다. 이미징 동안 수화를 보장하기 위해 PBS를 사용했습니다. 50개의 CHA(calcium hydroxyapatite) 뼈 보정 팬텀(밀도 1000, 1200 및 XNUMX mg/cm³)을 얇은 발포체 층 위에 놓고 평평하게 놓고 테이프를 사용하여 홀더에 고정했습니다. 저에너지(40kVp 전압, 3W 전력) XRM 스캔은 4배 대물렌즈를 사용하여 수행되었습니다. 각 돌기의 노출 시간은 3초이고 회전당 2001개의 돌기가 수집되었습니다. 이미지는 4.9μm의 등방성 복셀 크기로 재구성되었습니다. XRM 스캔에서 얻은 원시 데이터는 Amira 소프트웨어 및 맞춤형 SimpleITK 스크립트(v0.10.0, http://www.simpleitk.org/)²¹. 버 구멍 결함을 포함하는 모든 조각은 피질골이 끝나는 영역과 결함 부위에서 연장되는 새로 형성된 모든 뼈 캘러스를 포함하여 분할되었습니다(보조 그림 XNUMX). S3). ITK-SNAP(v3.8.0, http://www.itksnap.org/)²². 평균 선형 감쇠는 각 ROI에서 계산되었으며 XRM 이미지를 보정하기 위해 선형 보정 방정식이 적합했습니다. 모든 교정에 대해 R² > 99%. 밀도 임계값 800mg/cm³ 완전히 광물화된 조직을 분할하는 데 사용되었습니다. 굳은살 뼈 용적 골절(BV/TV)은 굳은살 분할에서 완전히 광물화된 복셀의 수를 굳은살 분할에서 총 복셀 수로 나눈 값으로 계산되었습니다. 캘러스 골밀도(BMD)는 캘러스 세분화 내부의 평균 밀도로 계산되었습니다. 캘러스 렌더링은 ParaView(5.7.0) 소프트웨어를 사용하여 생성되었습니다. 세 가지 필터가 적용되었습니다. (1) 임계값 - 최소 0.5, (2) 표면 추출, (3) 평활화 - 400회 반복.

통계 분석

모든 데이터는 GraphPad Prism 9를 사용하여 분석했습니다. 두 개 이상의 실험 그룹을 포함하는 모든 데이터 세트는 Fisher의 LSD 사후 테스트와 함께 95% 신뢰 구간(α = 0.05)의 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 분석했습니다. . 95개의 그룹만 포함하는 데이터 세트는 0.05% 신뢰 구간(α = XNUMX)의 양측 unpaired 파라메트릭 t-테스트를 ​​사용하여 분석되었습니다.

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• 출처: https://www.nature.com/articles/s41598-023-36609-z