동물 윤리 승인

C57BL/6 마우스는 푸단대학교 동물센터(Fudan University Animal Center)에서 구입했습니다.

모든 동물은 상대 습도가 조절되고 주변 온도 24~26°C로 유지되는 통풍이 잘 되는 방의 스테인레스 스틸 케이지에 배치되었습니다. 실험 전반에 걸쳐 실험 중인 동물에게는 식이 펠렛과 수돗물이 제공되었습니다. 실험 기간이 끝나면 모든 동물을 20 mg/kg의 케타민과 3 mg/kg의 자일라진으로 가벼운 마취하에 안락사시켰습니다. 모든 동물 실험은 푸단대학교 과학조사위원회(2019-JS-011)의 승인을 받아 수행되었습니다. 이 연구는 ARRIVE 지침(https://arriveguidelines.org). 모든 방법은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.

블레오마이신 유발 폐섬유증 모델

암컷 또는 수컷 8주령 C57BL/6 마우스(중국 상하이)를 이소플루란으로 마취시키고 50일째에 기관내 단일 용량의 블레오마이신 황산염(3 μL, 0 U/kg)을 투여하여 폐 섬유증을 유도했습니다. 블레오마이신 나이브 마우스(대조군)에는 기관내 용량의 식염수(50 μL)를 투여했습니다. 14일차에 치료군은 MSC(200μL; 용량, 5 x 10⁶ MSC). 대조군에는 동일한 양의 인산염 완충 식염수(PBS)를 제공했습니다. 세포 계측, 조직학 및/또는 정량적 PCR(qPCR) 분석을 위해 14일 및/또는 21일 또는 28일에 마우스를 평가했습니다.

MSC 및 폐 섬유아세포의 분리 및 배양

MSC와 폐 섬유아세포는 C57BL/6 마우스로부터 얻어졌습니다. 이들 세포의 분리 및 배양을 위한 모든 절차는 푸단대학교 과학조사위원회의 승인을 받아 수행되었습니다.

수컷 생쥐를 케타민 20 mg/kg과 자일라진 3 mg/kg으로 가벼운 마취하에 안락사시켰습니다. 부고환에서 외과적 조작을 통해 지방조직을 채취하고, 지방에서 혈관을 분리한 후 1 mm 크기로 절단하였다.³ 차가운 접시에. 그런 다음 조직을 1 mg/mL 콜라게나제 I(Biosharp, China)을 사용하여 37°C에서 0.5시간 동안 소화하여 단일 세포 현탁액을 얻었습니다. 현탁액을 2000rpm에서 5분간 원심분리하고, 세포를 100mm 접시에 플레이팅하였다. 배양 배지는 10% FBS, 100mM 비필수 아미노산 및 100mM 피루브산나트륨, 20mM 피루브산나트륨, β-머캅토에탄올 L-글루타민, 20μg/mL EGF, 100IU를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지로 구성되었습니다. /mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신(모두 캘리포니아주 칼스배드 소재 Gibco 제품). 그 후 MSC를 37°C, 5% CO에서 배양했습니다.₂ 약 5일 동안. 세포가 70-80% 합류에 도달하면 0.05% 트립신(Gibco)을 사용하여 수확하고 동일한 배지에서 계대배양했습니다. 모든 실험은 XNUMX세대 MSC를 사용하여 수행되었습니다.

생쥐의 폐 조직을 1mm 크기로 절단했습니다.³ 멸균 환경에서 조각을 만든 다음 H-글루타민, 20μg/mL EGF, 100IU/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신(모두 캘리포니아주 칼스배드 Gibco 제품)에 넣었습니다. 그 후, 폐 조직을 37°C, 5% CO에서 배양했습니다.₂ 약 7일 동안. 세포가 80% 컨플루언스에 도달하면 0.05% 트립신(Gibco)을 사용하여 수확하고 동일한 배지에서 계대배양했습니다. 모든 실험은 XNUMX세대 폐 섬유아세포를 사용하여 수행되었습니다.

유세포분석 분석

MSC의 신원을 확인하기 위해 ISCT(International Society for Cellular Therapy)가 정한 지침에 따라 유세포 분석을 수행했습니다. MSC는 표면 마커 CD29, CD44, CD73 및 CD90을 발현할 수 있지만 CD34, CD45, CD11b는 발현되지 않는다고 정의했습니다.^24,25,26. 세 번째 계대에서 MSC를 트립신화하고 PBS로 두 번 세척한 다음 1 x 10⁵ 세포를 CD29-FITC, CD44-FITC, CD90-FITC, CD45-FITC 및 CD11b-FITC(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)를 포함한 인간 단일클론 항체로 별도로 염색했습니다. 세포를 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 이소형 대조군과 함께 암실에서 4℃에서 20분 동안 항체와 함께 배양하였다. 세척 후 세포를 500 μL의 FACS 완충액에 현탁시키고 Flow Cytometer(Accuri C6, BD Biosciences)로 분석했습니다.

MSC 세포 분화 식별

MSC의 다중 계통 분화 가능성을 확인하기 위해 중간엽 줄기 세포 기능 식별 키트(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)를 사용하여 지방 생성, 골 형성 및 연골 형성 분화 실험을 수행했습니다. 세 계통에 대한 유도 과정은 제조업체의 지침에 따라 수행되었으며, 분화 배지는 10일마다 교체되었습니다. 8일 후, 오일 레드 염색, Alizarin Red-S 염색 및 alcian XNUMXGX 블루 염색(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 사용하여 지방 생성, 골 형성 및 연골 형성 분화를 각각 분석했습니다.

세포 형광 라벨링

세포 시각화를 위해 MSC를 PKH26 Red Fluorescent Cell Connection Kit (Tanon; Tanon Science & Technology, Shanghai, China)로 표지하여 세포막을 염색하고 DAPI를 사용하여 핵을 염색했습니다. 총 2×10⁷ MSC 세포는 키트와 함께 제공된 지침에 따라 염색되었습니다. 세포 이미지는 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 캡처했습니다.

RNA 추출 및 qRT-PCR 분석

이전에 설명한대로 조직 또는 배양 세포에서 총 RNA를 추출했습니다.²⁷. 키트 지침(Ambion, Foster City, CA)에 따라 trizol로 총 RNA를 추출했습니다. 그런 다음 All-In-One RT MasterMix(ABM)를 사용하여 cDNA를 합성했습니다. 역전사효소 PCR에 사용되는 정방향 및 역방향 프라이머 서열(표 1)은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스에서 얻은 각 유전자의 mRNA 정보를 기반으로 Primer 5.0 소프트웨어(PREMIER Biosoft International, Palo Alto, CA)를 사용하여 설계되었습니다. 설계된 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 Light Cycler 2 II (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)에서 EvaGreen 480 x qPCR MasterMix (ABM)를 사용하여 실시간 PCR을 수행했습니다.

웨스턴 블랏 분석

Western blot 분석은 다음과 같이 수행되었습니다.²⁸. 전체 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석을 위해 다음과 같은 1차 항체를 사용했습니다: TGF-β1(5000:1; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), α-SMA(5000:1; Abcam,) 및 Col I (5000:2; Abcam). Smad1(1,000:2 희석, Protein-Tech, 중국), phospho-Smad1(1,000:3 희석, Protein-Tech, 중국), Smad1 항체(1,000:3 희석, Protein-Tech, 중국), phospho-Smad1(1,000 :62 희석, Protein-Tech, 중국), p1(1,000:1 희석, ProteinTech, 중국), α-tubulin(1,000:1 희석, Affinity, 중국). 단백질을 SDS-PAGE를 사용하여 분리하고 막으로 옮긴 후 양 고추 냉이 퍼옥시다제 결합 항-IgG(5000:1; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)와 함께 배양했습니다. 강화된 화학발광 키트(Tanon, Tanon Science & Technology, Shanghai, China)를 사용하여 단백질 밴드를 시각화했습니다. 정확한 정량화를 보장하기 위해 결과는 GAPDH(2000:XNUMX; Abcam)로 정규화되었습니다.

폐 섬유증 세포의 시험관 내 이동

폐 섬유증 세포의 이동 및 침습적 특성을 분석하기 위해 이전에 발표된 방법을 기반으로 상처 치유 및 트랜스웰 이동 분석을 수행했습니다.²⁷. 폐 섬유증 세포의 이동 능력을 평가하기 위해, 24-웰 트랜스웰 플레이트(PET 막 8 μm 기공 크기, Corning Incorporated Costar, Corning, NY)를 사용하여 세포 이동 실험을 수행했습니다. 폐섬유화세포(2×10⁵) 200 μL 무혈청 배지에 현탁하여 트랜스웰 챔버의 상부 웰에 개별적으로 시딩했습니다. 각 그룹은 대조군으로 한쪽 바닥에 600 μL 0.5% 혈청배지를 채웠고, 실험그룹은 바닥에 4×10⁵ MSC는 동일한 매체에 정지되어 있습니다. 24시간 배양 후 면봉으로 막 윗면의 비이동성 세포를 제거하고, 아랫면의 세포를 메탄올로 고정한 후 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 20분간 염색하였다. 염색된 세포를 형광도립현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하고 계수하였다. 10장의 사진을 XNUMX배 대물렌즈에 촬영하여 막 구멍을 통해 이동하는 염색된 세포의 수를 계산했습니다.

조직학

마우스를 안락사시키고 오른쪽 폐를 파라핀에 묻은 다음 H&E 또는 Masson의 삼색 염색을 위해 절개했습니다.²⁹. 왼쪽 폐는 액체 질소에 급속 냉동되어 RNA 및 단백질 분리에 사용되거나 콜라겐 정량화 또는 세포 계측 분석에 신선하게 사용되었습니다. 10 μm 두께의 폐 절편에서 무작위로 선택된 영역(15-5 필드)을 Nikon Eclipse 80i 현미경(Nikon)을 사용하여 × 100 및 × 200 배율로 검사했습니다. 조직학적 정량화를 위해 Ashcroft 점수를 맹검 방식으로 사용했습니다.³⁰. Ashcroft 점수의 범위는 0에서 8까지이며 점수가 높을수록 섬유증이 더 심함을 나타냅니다. 0~1점은 섬유증 없음, 2~3점은 최소 섬유증, 4~5점은 중등도 섬유증, 6~8점은 심각한 섬유증을 나타냅니다.

Sircol 콜라겐 분석

제조업체의 프로토콜(Bicolor, Life Science Assays)에 따라 Sircol 콜라겐 분석을 사용하여 콜라겐 정량을 수행했습니다.³¹. 간략하게, 왼쪽 폐를 4% v/v 펩신을 함유한 5 mL의 0.5 M 아세트산 중에서 0.6℃에서 밤새 균질화했습니다. 1 μL의 투명 상청액에 총 100 mL의 염료 시약을 첨가하고 샘플을 30분 동안 와류시켰다. 잔류 펠릿을 산-염 세척 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 콜라겐을 제거하고 pH를 알칼리화 완충액으로 표준화했습니다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 550nm의 파장에서 측정되었습니다. 콜라겐 함량은 왼쪽 폐 균질액의 mg/mL로 표시되는 표준 곡선과 비교하여 결정되었습니다.

통계 분석

모든 실험 데이터는 평균±표준편차(SD)로 표현되었습니다. 통계 분석은 실험 그룹 간 Prism 9 소프트웨어(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)를 통해 Student's independent t-test를 사용하여 수행되었습니다. 유의 수준은 *로 설정되었습니다.P <0.05; **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P <0.0001.

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• 출처: https://www.nature.com/articles/s41598-023-40531-9