나노봇 합성

나노봇은 이전에 설명한대로 준비되었습니다³³. 간단히 말해서 MSNP는 수정된 Stöber 방법을 사용하여 합성되었습니다.⁴¹, 트리에탄올아민(35 g), 초순수(20 ml) 및 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB; 570 mg)를 95 °C에서 30 분 동안 교반하면서 반응시켰다. 이어서 테트라에틸 오르토실리케이트(1.5mL)를 적가했습니다. 혼합물을 2°C에서 95시간 동안 반응시키고 원심분리로 생성된 MSNP를 수집하고 에탄올로 세척했습니다(2,500회, XNUMX°C).g, 5 분). CTAB 템플릿을 제거하기 위해 MSNP를 산성 메탄올(1.8mL HCl, 30mL 메탄올)에 24시간 동안 환류시켰습니다. 그런 다음 MSNP를 원심분리로 수집하고 에탄올(2,500)로 XNUMX회 세척했습니다.g, 5 min) MSNP(6 mg ml)에 APTES(MSNP mg당 1 μl)를 추가하여 아민 변형을 통합하기 전^{- 1}) 70°C의 70% 에탄올 용액에 넣고 1시간 동안 세게 저어줍니다. MSNP-NH₂ 원심분리를 통해 수집하고 에탄올로 1,150회, 물에서 XNUMX회 세척했습니다(XNUMX회, XNUMXg, 5 분). MSNP-NH₂ PBS에 1 mg ml 농도로 재현탁시켰습니다.^{- 1} 총 부피는 900 μl이고 실온에서 100 시간 동안 글루타르알데히드(2.5 μl)로 활성화되었습니다. 활성화된 MSNPs-NH₂ 원심분리(1,150)를 통해 수집하고 PBS로 XNUMX회 세척했습니다.g, 5 min), 우레아제 용액(3 mg ml)에 재현탁^{- 1}) 및 이종이작용성 PEG(1 kDa HS-MSNPs-NH mg당 5 μg PEG)₂) PBS에 넣고 실온에서 24시간 동안 반응시켰다. 생성된 나노봇을 수집하고 원심분리(1,150)를 통해 PBS에서 XNUMX회 세척했습니다.g, 5 분) 이전에 설명한대로 준비된 AuNP 분산액에 재현 탁하기 전에⁵¹, 10분 동안 반응시킨 후 원심분리(1,150회, XNUMX)로 철저히 세척한다.g, 5 분).

MSNP, MSNPs-NH의 유체 역학적 크기 분포 및 표면 전하₂, 나노봇 및 AuNP 장식 나노봇은 각각 Wyatt Mobius 동적 광산란 시스템 및 Malvern Zetasizer를 사용하여 결정되었습니다. 모든 경우에 농도는 20 μg ml였습니다.^{- 1} 실험당 5번의 실행을 사용하여 획득 시간은 XNUMX s입니다. 입자 유형별로 세 가지 측정이 수행되었습니다.

FITC MSNP 합성

FITC(2 mg), 에탄올(5 ml) 및 APTES(400 μl)의 혼합물을 제조하고 30분 동안 교반했습니다. 그런 다음 FITC-APTES 혼합물(1.25μl)과 함께 테트라에틸 오르토실리케이트(250μl)를 적가하는 것을 제외하고는 이전에 설명한 MSNP 합성 프로토콜을 따랐습니다. FITC 라벨이 붙은 나노봇을 얻기 위한 기능화 단계는 앞서 언급한 바와 같습니다.

AuNP의 합성

AuNP는 보고된 방법을 사용하여 합성되었습니다.³³. 간단히 말해서, 모든 재료는 새로 준비한 왕수를 사용하여 세척하고 물로 완전히 헹구고 공기 건조시켰습니다. 이어서, 1 mM AuCl₄ 환류 시스템에 통합된 둥근 바닥 플라스크에서 교반하면서 용액을 끓는점까지 가열했습니다. 여기에 구연산나트륨용액(10mM) 30.8ml를 가하고 20분 동안 끓이면 붉은색을 띤다. 이어서, 용액을 1시간 동안 교반하면서 실온으로 냉각시켰다. 생성된 AuNP를 암실에 보관하고 투과 전자 현미경을 사용하여 특성 분석을 수행했습니다.

효소 활성

나노봇의 효소활성, ¹⁸F-나노봇과 ¹³¹I-nanobots는 페놀 레드를 사용하여 측정되었습니다. 이를 위해 나노봇 2 μl(1 mg ml)^{- 1})을 96웰 플레이트에 첨가하고 200mM 페놀 레드에 용해된 다양한 요소 용액(0, 50, 100, 200mM) 1.1μl와 혼합했습니다. 560 nm에서의 흡광도는 37 °C에서 시간 경과에 따라 측정되었습니다.

광학현미경을 통한 나노봇의 운동역학

나노봇의 광학 비디오는 Leica Thunder 현미경과 Hamamatsu 고속 CCD 카메라 및 x1.25 대물렌즈를 사용하여 획득했습니다. 이를 위해 나노봇을 원심분리하고 50 μl의 PBS(최종 농도 20 mg ml)에 재현탁했습니다.^{- 1}). 그런 다음 페트리 접시에 PBS 또는 3mM 요소 용액(PBS 내) 300mL를 채우고 현미경으로 관찰했습니다. 나노봇을 사용한 5 μl 방울(20 mg ml)^{- 1})를 액체가 채워진 페트리 접시에 추가하고 비디오를 초당 25프레임으로 녹화했습니다. ROI의 비디오 픽셀 강도 분포는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 15초 간격으로 분석되었습니다.

[를 이용한 나노봇의 방사성 표지¹⁸F]F-PyTFP

[¹⁸F]F-PyTFP

[¹⁸F]F-PyTFP는 이전에 보고된 방법에 따라 Neptis xSeed 모듈(Optimized Radiochemical Application)에서 합성되었습니다.³³.

합성 ¹⁸F 라벨이 붙은 나노봇

나노봇에는 [¹⁸F]F-PyTFP, 이전에 확립된 절차를 약간 수정하여 기반으로 함³³. 간단히 말해서, 200 μl의 나노봇 용액(1 mg ml)^{- 1})을 원심분리하였다(10 min, 13,853g), 10 μl의 PBS(1 mM, pH 8)에 재현탁하고 4 μl의 [¹⁸F]F-PyTFP(아세토니트릴(약 37 MBq)), 실온에서 35 분 동안. 인큐베이션 후, 반응 혼합물을 물(200μl)로 희석하고 원심분리(5분, 13,853)로 정제했습니다.g). 생성된 펠렛을 물로 25회 헹구고 용량 교정기(CPCRC-99R, Capintec)에서 측정했습니다. 방사성화학 수율은 세척 후 나노봇에 존재하는 방사능 양과 초기 방사능 양 사이의 비율로 계산되었습니다. 정제 후 방사화학적 순도는 iTLC-SG 크로마토그래피 종이(Agilent Technologies)와 디클로로메탄과 메탄올(2:1)을 각각 고정상과 이동상으로 사용하여 무선박층 크로마토그래피(radio-TLC)로 측정한 결과 XNUMX% 이상이었습니다. TLC 플레이트는 TLC 리더(MiniGITA, Raytest)를 사용하여 분석되었습니다.

안정성 ¹⁸F-나노봇

의 안정성 ¹⁸F-표지된 나노봇은 다음 매체를 사용하여 결정되었습니다: (1) 300mM 요소, (2) 물, (3) 종양 보유 동물의 소변. ¹⁸F-표지된 나노봇(10μl)을 상응하는 용액(100μl)과 함께 실온에서 1시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 나노봇과 상등액을 원심분리로 분리하여 수집하고 용량 교정기(CPCRC-25R)에서 방사능을 측정했습니다.

나노봇의 방사성 표지 ¹³¹I

우레아제 나노봇의 방사성 요오드화는 나노봇을 주사 가능한 물질과 함께 배양하여 수행되었습니다.¹³¹I]NaI 용액(925 MBq ml^{- 1}; GE 헬스케어). 간단히 말해서 우레아제 나노봇 용액 400μl(1 mg ml)^{- 1})을 원심분리하였다(13,853g, 5 분), 100 μl의 PBS(10 mM, pH 7.4)에 재현탁하고 25 μl 또는 185 μl의 주사용 [¹³¹I]NaI(각각 약 42.55 또는 277.5 MBq), 원하는 최종 활동에 따라 30분 동안. 인큐베이션 후, 반응 혼합물을 원심분리(13,853)로 정제했습니다.g, 5 분). 생성된 침전물을 물(100μl)로 25회 세척했습니다. 상청액과 침전물의 방사능은 용량 교정기(CPCRC-XNUMXR)를 사용하여 결정되었으며, 두 분획 모두 radio-TLC로 분석되었습니다. ¹⁸F-나노봇.

동물모델 개발

마우스는 유럽 위원회 지침 2010/63/UE 및 내부 지침에 따라 유지 관리되고 처리되었습니다. 모든 실험 절차는 CIC biomaGUNE 윤리 위원회 및 지방 당국(Diputación Foral de Guipuzcoa, PRO-AE-SS-276)의 승인을 받았습니다. 이미지 분석(PET 및 MRI 모두)은 동물의 그룹 분포에 대해 눈이 멀었습니다.

방광암의 동소이식 쥐 모델은 C49BL/57JRj 암컷 쥐(6주령, Janvier)에게 MB8 세포(쥐 암종 방광 세포주)를 방광내 투여하여 생성되었습니다. 종양 축적을 결정하기 위한 실험(20개 그룹, 자세한 내용은 아래 참조)을 위해 정밀 분석을 사용하여 결정한 대로 다음 가정 하에 그룹당 20마리의 동물을 접종했습니다: 필요한 정밀도, 95%; 예상 SD, ±20%; 신뢰도, XNUMX%; 동물 손실, XNUMX%. 치료 효능 실험(XNUMX개 그룹, 자세한 내용은 아래 참조)의 경우 단측 스튜던트(Student)를 사용하여 계산한 대로 그룹당 XNUMX마리의 동물이 포함되었습니다. t- 검정, 다음 가정을 사용하여 두 개의 독립적인 평균 간의 차이: 귀무 가설, 치료는 종양 성장에 영향을 미치지 않습니다. α, 0.05; 1 - β, 0.95; SD, ±50%; 그룹 간 예상 차이 50%; 동물 손실, 20%. 실험은 운영상의 이유로 XNUMX개의 배치로 나누어 진행되었기 때문에 두 배치 모두에 하나의 대조군을 포함시켰다(표 2), 그런 다음 모든 동물을 모았습니다. 종양 형성을 위해 순수 O3 중 XNUMX% 이소플루란을 흡입하여 마우스를 마취시켰습니다.₂ 1.0% O에서 1.5-100% 이소플루란으로 유지됩니다.₂. 그런 다음 방광을 비우고 50μl의 폴리백신을 방광 내 주입하여 요로 상피에 화학적 병변을 유발했습니다.l- 라이신(Sigma-Aldrich)을 24게이지 카테터를 통해 15분 동안 삽입합니다. 그 후, 방광을 다시 비웠고 MB49 세포(10⁵ 고혈당 DMEM(100μl)의 세포)를 1시간 동안 주입한 후 카테터를 제거하고 복부 마사지를 통해 방광을 비웠습니다. 실험 전반에 걸쳐 건강 및 복지 모니터링을 위해 생쥐를 모니터링하고 체중을 측정했습니다. 체중 감소가 20%를 초과하거나 담당 수의사의 기준에 따라 임상 증상을 기반으로 하는 경우 인간 평가변수가 적용되었습니다.

종양 크기 추적

MRI 연구는 7mT m의 BGA-14S 그래디언트 인서트가 장착된 7 T Bruker BioSpec USR 70/30 스캐너(Bruker BioSpin)를 사용하여 종양 유도 후 12일과 440일에 수행되었습니다.^{- 1} 무선 주파수용 112/086 QSN 공진기(T12053V3)¹⁴ 전송 및 RF 수신을 위한 쥐 뇌 표면 코일(T11205V3)(둘 다 300MHz에서 작동). 동물은 이소플루란(4% O1.5에서 유도용 50%, 유지용 XNUMX%)으로 마취되었습니다.₂/50%N₂ 혼합물)을 넣고 MR 호환 크래들에 놓습니다. 체온을 유지하기 위해 소형 설치류 공기 히터 시스템과 인터페이스된 MR 호환 모니터링 장치(모델 1030 SA, Small Animal Instruments)를 사용하여 체온과 호흡률을 지속적으로 모니터링했습니다. 참조 이미지를 획득한 후 스핀 에코 기반 확산 강조 이미징 시퀀스를 사용하여 다음 매개변수를 사용하여 종양을 이미지화했습니다.T_E) = 22.3 ms, 반복 시간(T_R) = 2,500ms, n = 평균 2개, A0 이미지 XNUMX개(기본 이미지 b = 0초 mm^{- 2}) 및 그라데이션 지속 시간과 함께 (1, 0, 0) 방향의 확산 그라데이션을 사용하여 획득한 하나의 DW 이미지 δ = 4.5 ms 및 경사 분리 Δ = 10.6 ms, 제공 b = 650초 mm^{- 2}, 16 × 16 mm² 시야, 160 × 160 포인트의 이미지 매트릭스 크기, 20 mm 두께의 0.5개 연속 슬라이스(간격 없음, 인터리브 모드에서 획득) 및 픽셀당 192.9 Hz의 대역폭. 종양을 시각화하기 위해 이미지를 ImageJ 소프트웨어로 후처리하여 확산 구배로 얻은 이미지를 나눴습니다.b = 650초 mm^{- 2}) 없이 취득한 자산에 의해 (b = 0초 mm^{- 2}), 3D 가우스 필터 적용(σ_x = σ_y = σ_z = 0.7) 결과입니다. 종양의 부피를 결정하기 위해 종양을 수동으로 묘사했습니다.

생체내 생체분포

종양 유도 후 15일째에, 마우스를 무작위로 3개 그룹으로 나누어 그룹 간 균일한 평균 종양 부피 분포를 얻었습니다. PET-CT 스캔(MOLECUBES β 및 X-CUBE 스캐너)은 100μl의 정맥 내 투여 후 XNUMX시간 후에 획득되었습니다. ¹⁸F-BSA(그룹 1 및 2) 또는 ¹⁸3 μg ml 농도의 F-우레아제(그룹 4 및 200) 나노봇^{- 1}, 물(그룹 1 및 3) 또는 물 내 300mM 요소(그룹 2 및 4)를 매개체로 사용(표 1). 이미지 획득을 위해 동물을 마취(순수 산소 중 5% 이소플루란)로 유도하고 방광 배출을 위해 복부 부위를 마사지하기 전에 앙와위 자세로 두었습니다. 그 직후 해당하는 ¹⁸F-라벨이 붙은 나노봇(¹⁸F-BSA/¹⁸F-urease in water/urea)를 24게이지 카테터를 통해 방광에 주입하고 1시간 동안 배양한 후 카테터를 제거하고 방광을 비우고 마우스가 마취에서 회복되도록 두었습니다. ~에 t = 투여 후 3시간 후 동물을 다시 마취시키고 10분간 정적 전신 PET 영상을 획득한 후 CT 스캔을 실시하였다. 무작위, 산란 및 감쇠 보정이 포함된 3D 정렬된 하위 집합 기대 최대화 재구성 알고리즘을 사용하여 PET 이미지를 재구성했습니다. PMOD 이미지 처리 도구를 사용하여 동일한 마우스의 PET-CT 이미지를 공동 등록하고 분석했습니다. 3D 윤곽 도구를 사용하여 상부 방광 영역에 관심 볼륨을 생성하고 기관당 킬로베크렐 단위로 활동(감쇠 보정)을 측정하여 시간 대비 방사능 농도의 플롯을 얻었습니다. 교정 인자를 적용하여 결과를 수정한 다음 MRI에서 추출한 종양 부피를 기준으로 정규화했습니다.

생체 외 연구

조직병리학적 분석

모든 촬영이 완료된 후 선택된 방광(n 종양이 있고 건강한 동물의 그룹당  3개를 무균 조건에서 제거하고 즉시 4% 포름알데히드에 고정했습니다. 그런 다음 헤마톡실린-에오신 염색을 위해 2~3μm 섹션을 채취하기 전에 방광을 파라핀에 묻었습니다. 조직병리학적 검사를 위한 모든 조건에서 대표 이미지를 얻었습니다.

ICP-MS 분석

측정은 ASX-560 자동 샘플러(CETAC Tech)와 결합된 Thermo iCAP Q ICP-MS(Thermo Fisher Scientific)에서 수행되었습니다. 모든 영상 촬영이 완료된 후 동물을 죽이고 방광을 선택했습니다(n =그룹당  2개; 네 그룹) 1 ml의 HNO에서 수집 및 소화₃:HCl(4:1 혼합물). 장기가 완전히 용해될 때까지 분산액을 끓였습니다. 그런 다음 용액을 실온으로 냉각하고 ICP-MS를 사용하여 분석하여 각 샘플의 Au 농도를 결정하고 결과를 조직 그램당 주입된 용량의 백분율(%ID g)로 변환했습니다.^{- 1}).

면역조직화학 및 공초점 현미경 이미징

면역조직화학 분석을 위해 종양이 있는 동물은 물이나 300mM 요소에 FITC 라벨이 붙은 나노봇을 투여받았습니다.n =그룹당  4), 위에서 설명한 대로 PET-CT 연구의 경우. 또한, 나노봇이 없는 종양 보유 동물이 대조군 역할을 했습니다.n = 2). 모든 경우에 방광을 수집하고 냉동한 다음 10μm 섹션으로 자르고 10% 포름알데히드에 15분 동안 즉시 고정한 다음 10mM PBS로 세척한 다음 50mM NH에서 배양했습니다.₄PBS로 다시 헹구기 전에 5분 동안 PBS에 Cl을 첨가합니다. 투과화는 실온에서 1분 동안 메탄올:아세톤(1:5)을 사용하고 PBS 중 0.1% 트리톤을 5분 동안 수행했습니다. PBS 세척 후, 샘플을 PBS에 용해된 5% BSA-0.5% Tween 용액으로 실온에서 15분 동안 포화시키고 실온에서 1시간 동안 1% BSA에 용해된 마우스 항-FITC(100:5, Abcam)와 함께 배양했습니다. -0.5% 트윈. 절편을 10분 동안 5mM PBS로 30회 세척하고 647% BSA–1% Tween에서 1,000차 항체 Alex Fluor 5 당나귀 항-마우스 IgG(Molecular Probes, Life Technologies, 0.5:3)와 함께 실온에서 5분 동안 배양했습니다. PBS에서 다시 PBS(4,6 × 2 min)로 세척하고 5-diamidino-10-phenylindole(DAPI; Molecular Probes, Life Technologies)이 포함된 ProLong 안티페이드 키트를 장착했습니다. 이미지는 모든 섹션에 대해 동일한 설정으로 Leica STELLARIS 4 공초점 현미경(UPV/EHU Scientific Park)을 사용하여 획득했습니다: 타일 이미징 및 스티칭을 사용한 ×5 배율(일반적으로 405 × 440 시야각). 레이저 라인 및 감지 창은 DAPI의 경우 503 nm 및 489~494 nm, FITC 백색 레이저의 경우 602 nm 및 653~660 nm, Alexa836 백색 레이저의 경우 647 nm 및 XNUMX~XNUMX nm입니다.

광학 클리어링

4% 파라포름알데히드와 PBS로 관류한 후 방광 샘플을 제거하고 4°C에서 밤새 4% 파라포름알데히드에 추가로 고정한 다음 5% 저융점 아가로스가 포함된 0.8mL 주사기에 삽입하여 원통형 블록을 형성하고 쉽게 가능하게 했습니다. 석영 큐벳에 장착. 전체 블록은 메탄올:H를 사용하여 점진적으로 탈수되었습니다.₂O, 4 °C(30 시간 동안 70%:1%, 50 시간 동안 50%:1%, 70 시간 동안 30%:1%, 100 시간 동안 0%:1%, 밤새 100% 메탄올, 그리고 다시 4 h) 그리고 마지막으로 이미징을 위한 굴절률 매칭 솔루션인 벤질 알코올-벤질 벤조에이트(BABB)에 담급니다. 상업용 적색 입자와 녹색 FITC 나노봇의 시험관 내 비교를 위해 BABB 제거에 내성이 있는 직경 1 μm의 DiagNano(Creative Diagnostics) 적색 형광 실리카 나노입자를 사용했습니다.

자가형광 및 편광 sLS 이미징

광시트 이미징은 IRB Barcelona에서 개발된 투명 전체 장기 이미징용 맞춤형 시스템인 MacroSPIM에서 수행되었습니다.^44,45. 간단히 말해서, 샘플은 아가로스 블록에 삽입되어 샘플과 함께 투명화되고 석영 큐벳 내부에 이미지가 생성됩니다. 자가형광 이미징은 488mm 무색 이중 원통형 렌즈(ACY561-638-A, Thorlabs)를 통해 조명을 전달하는 50, 254 또는 050nm의 레이저를 사용했습니다. 줄무늬 인공물을 줄이기 위해 광 시트는 G10 4mm 무색 이중 렌즈(QI Optic Photonics)가 장착된 322288322f 망원경을 따라 공진 스캐너 SC-100(EOPC)으로 회전됩니다. 조직 자가형광은 밴드 또는 롱 패스 형광 필터를 통해 수집되고 ORCA Flash v2 카메라(Hamamatsu Photonics)로 기록됩니다. 이미징은 ×9.6 줌, ×8 렌즈 및 ×2 튜브 렌즈를 사용하여 ×0.6에서 수행되었습니다. 광 시트는 시야 전체에 걸쳐 편평해졌으며 5~6 μm의 축 해상도를 생성했습니다. 3D 이미징은 2.5 μm 단위로 수행되었습니다. 전체 방광 영상은 2 × 3 또는 3 × 4로 수행되었습니다. XY 타일(장기 크기에 따라 다름)

sLS 이미징은 형광 필터를 제거하거나 레이저를 투과하는 필터를 사용하여 달성되었습니다. 라이트 시트 피버팅은 레이저 스펙클 노이즈를 줄여 앞서 설명한 것처럼 레이저 일관성의 시간적 평균화를 가져왔습니다.⁵². 조명의 선형 광시트 편광 방향은 피봇 스캐너 앞에서 반파장 플레이트(AHWP05M-600, Thorlabs)를 회전시켜 제어되었습니다. 검출된 신호는 검출 시 필터 휠 이전에 회전 선형 편광기(LPVISC100, Thorlabs)를 사용하여 편광에서 선택되었으며, 형광 검출에서 >50% 강도 손실이 발생했습니다. 일반적으로 sLS 신호 분포는 편광판의 방향에 따라 변경되지만 조직 자가형광 신호는 편광판의 회전에 영향을 받지 않습니다. sLS는 BABB에서 2.4 ± 0.3 μm의 공간 분해능을 제공하며 이는 형광 광시트 이미징의 분해능과 비슷합니다(가우시안 함수를 XY 단일 입자의 이미지 반응, 보충 그림. 8시~분) 공기 중 이론적 해상도(최대 매크로 줌 ×1.53에서 개구수(NA) = 0.2인 8 μm)에 가깝습니다.

이미지 처리 및 3D 분석

라이트 시트 데이터 세트의 이미지 처리, 분할 및 분석은 ImageJ/Fiji를 사용하여 수행되었으며 Fig. 3 과 4 Imaris Viewer 9.9(https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer) 및 보충 비디오 3 Imaris 9(https://imaris.oxinst.com/) (Bitplane, Oxford Instruments). 모자이크 익스플로러J(MosaicExplorerJ)로 타일링된 라이트 시트 데이터세트를 스티칭했습니다.⁵³. 방광 조직 3D 세분화는 가상 모드에서 대용량의 반자동 3D 주석을 위해 사용자 정의 ImageJ/Fiji 매크로를 사용하여 수행되었습니다. 간단히 말해서 첫 번째 스크립트인 'Macro1'은 3D 이미지 스택을 로드하고 여러 평면에서 ROI에 대한 사용자 주석을 활성화하고 ROI를 자동으로 보간하여 3D 마스크를 생성하고 내보냅니다. 주석을 합리적인 최소 수준으로 유지하면서 우수한 분할 연속성을 촉진하기 위해 ROI는 15개 평면(37.5μm마다)마다 그려졌습니다. 두 번째 스크립트인 'Macro2'는 3D 마스크 사이 또는 3D 마스크와 원본 데이터 사이에서 전체 스택을 메모리에 로드하지 않고 평면별로 수학적 또는 부울 연산을 수행하여 결과를 새 스택으로 저장합니다. 모든 마스크는 자가형광 이미지에 주석을 달아 생성되었습니다.

종양과 건강한 조직 표면층 모두(그림 1) 3) 마스크의 방광강에 피지의 지팡이와 올가미 도구를 사용하여 묘사되었습니다. 이 첫 번째 반복을 BC1이라고 부르면 이후 Macro1을 실행하면 이 3D 윤곽선이 정의된 픽셀 양만큼 자동으로 확장되어 팽창이 증가하면서 새로운 마스크 반복인 BC2, BC3 등이 생성됩니다. 종양과 건강한 조직을 모두 포함하는 첫 번째 층인 마스크 L1은 BC1 등에서 마스크 BC2을 빼고 L2와 L3을 동심 층으로 만들어 얻습니다. 공동에 가장 가까운 종양 부피는 지팡이와 올가미 도구를 사용하여 종양에 주석을 달아 마스크 T1을 생성한 반면, 건강한 요로상피 3D 층은 마스크 U1에서 별도로 감지되었습니다. L1에서 U1을 빼면 종양의 표면층이 생성됩니다. L2 − U1, L3 − U1. 반대로, 요로상피의 첫 번째 층은 L1에서 T1을 빼서 얻습니다. 그림의 모든 레이어 3 33 μm 두께를 갖는 것으로 정의되었습니다.

동일한 매크로 및 절차 세트(ImageJ 지팡이 도구, 500μm의 디지털 침식 등)를 사용하여 방광 조직의 내부 부분을 묘사하고 분할한 다음 방광의 내부 조직 부피를 추정했습니다(그림 XNUMX). 4, 자세한 내용은 위를 참조하세요). 피지에서는 산란된 신호와 마스크를 결합하여 산란된 신호 강도의 히스토그램을 만들었습니다.

RNT를 사용하여 ¹³¹I-나노봇

종양 이식 후 8일에서 15일 사이에 동물을 1개 그룹(그룹 6-XNUMX)으로 나누어 그룹 전체에서 비슷한 평균 종양 부피를 달성하려고 했습니다(표 2). 실험을 위해 동물을 마취(순수 O5에 XNUMX% 이소플루란)하여 유도했습니다.₂) 복부를 마사지하여 방광을 비우기 전에 바로 누운 자세로 누워 있습니다. 그 직후 100 μg ml 농도의 적절한 치료제 400μl를 투여합니다.^{- 1} (표 2)을 24게이지 카테터를 사용하여 방광에 주입했습니다. 카테터를 제거하기 전에 치료약과 운반체(물 또는 요소)가 방광에 1시간 동안 남아 있었습니다. 복부 마사지를 통해 방광을 다시 비웠고 마우스는 케이지 내 마취에서 회복되었으며 방사능 오염을 제거하기 위해 치료 후 24시간 동안 동물 케이지 톱밥을 교체했습니다.

MRI로 결정되는 치료 효능

각 마우스에 대해 1가지 MRI 연구를 수행했습니다: (7) 종양 접종 후 14일과 2일 사이에 그룹 간에 동물을 무작위화하고 초기(치료 전) 종양 부피를 측정하고; (16) 종양 접종 후(치료 후) 21일과 7일 사이에 치료 효능을 평가합니다. MRI는 가용성에 따라 11.7 T Bruker BioSpec 및 7 T Bruker BioSpec 스캐너(둘 다 ParaVision XNUMX 소프트웨어 포함)를 사용하여 수행되었습니다. 외부 장은 해부학적 영상 촬영에 중요하지 않기 때문에 이는 결과에 영향을 미치지 않았습니다.¹⁴. 위에서 설명한 것과 동일한 이미징 매개 변수 및 처리를 사용하여 이미징 실험을 수행했습니다(종양 크기 추적). 11.7 T 스캐너의 경우 설정은 수신용 마우스 심장 표면 코일과 전송용 체적 코일로 구성되었습니다. 각 조각의 종양 부피는 종양 영역을 포함하는 관심 볼륨을 수동으로 추출하여 결정했습니다.

통계 분석

PET 영상 연구에서 주입 용량의 백분율(% ID)과 종양 부피당 주입 용량(% ID cm)^-3)는 일원 분산 분석을 사용하여 비교되었습니다. 그룹 간의 차이는 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 결정되었습니다. RNT 섹션의 NTV는 t- 짝이 없는 값의 테스트. 데이터 분포는 정상적인 것으로 가정했지만, 이는 공식적으로 테스트되지 않았습니다. GraphPad Prism v.8을 사용하여 통계 분석을 수행했습니다.

보고 요약

연구 설계에 대한 추가 정보는 Nature 포트폴리오 보고 요약 이 기사에 링크되어 있습니다.

• SEO 기반 콘텐츠 및 PR 배포. 오늘 증폭하십시오.
• PlatoData.Network 수직 생성 Ai. 자신에게 권한을 부여하십시오. 여기에서 액세스하십시오.
• PlatoAiStream. 웹3 인텔리전스. 지식 증폭. 여기에서 액세스하십시오.
• 플라톤ESG. 탄소, 클린테크, 에너지, 환경, 태양광, 폐기물 관리. 여기에서 액세스하십시오.
• PlatoHealth. 생명 공학 및 임상 시험 인텔리전스. 여기에서 액세스하십시오.
• 출처: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01577-y