세포 배양

마우스 ESC 라인(Rex1GFP-d2 및 E14IVc¹³⁷)를 피더가 없는 조건[0.2% 젤라틴(Sigma, cat. G1890)으로 코팅된 플라스틱]에서 배양하고 Accutase(GE Healthcare, cat. L3-4)로 분리한 후 1:10의 분할 비율로 11-007일마다 다시 이식했습니다. ) 또는 0.25% 트립신(Life Technologies). 세포를 무혈청 N2B27 기반 배지[DMEM/F12 및 Neurobasal 1:1 비율, 0.1mM β-메르캅토에탄올, 2mM L-글루타민, 1:200 N2 및 1:100 B27(모든 시약은 Life Technologies의 제품)]에서 배양했습니다. )] 또는 혈청 함유 KSR 배지[5154% KSR(Life Technologies), 10% FBS(Sigma, cat. F2), 7524mM β-메르캅토에탄올(Sigma, cat. M100)이 보충된 GMEM(Sigma, cat. G7522) , 1× MEM 비필수 아미노산(Invitrogen, cat. 1140-036), 2mM L-글루타민, 1mM 피루브산나트륨(둘 다 Invitrogen 제품)], 2개의 소분자 억제제(0325901i) PD(PD1, PD99021, 3μM), Axon(cat. 1386 및 1408)의 CH(CHIR100, XNUMXμM) 및 LIF(Qkine - Cambridge UK에서 구입한 XNUMX단위/mL).

Cedars-Sinai Biomanufacturing Center(Los Angeles, California)에서 구입한 Human iPSC CS09iHD-109n5(여기서는 iPSC_Q109라고 함) 및 CS14iCTR-21n3(여기서는 iPSC_Q21이라고 함)을 사전 코팅된 0.5% Matrigel(CORNING, cat. 356231)에서 유지했습니다. ) 집에서 만든 E8 배지의 플레이트(Chen et al., 2011에 따름)¹³⁸) 또는 mTeSR(StemCell Technologies, cat. 05850)에서 37°C, 5% O², 5 % CO². 인간 iPSC를 0.5 mM EDTA(Gibco, cat. AM99260G)로 덩어리로 분리하고 1-6일마다 3:4 희석으로 10 μM ROCK 억제제(Y27632-dihydrochloride Axon Medchem, cat. 1683)로 24시간 동안 재플레이팅했습니다. 매체는 매일 변경되었습니다. 모든 세포주는 마이코플라즈마 음성이었다.

iPSC_Q21 및 iPSC_Q109의 유전자형 분석

iPSC_Q21 및 iPSC_Q109의 게놈 DNA는 제조업체의 지침에 따라 DNeasy Blood and Tissue 키트(Qiagen, cat. 69504)를 사용하여 분리하고 Nanodrop ND-1000으로 정량화했습니다. 보충 표에 나열된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행했습니다. 1 Mangiarini et al.²⁹, HTT 엑손 1에서 polyQ tract를 증폭하도록 설계되었습니다. 25μL 반응의 경우 200ng의 게놈 DNA, 0.25μL의 Taq Phusion High fidelity(ThermoFisher, cat. F-530L), 2.5μL의 Buffer GC 5x + MgCl을 사용했습니다.² (7.5mM), 2μL의 dNTP(10mM) 및 1.25μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO, 100%). 3°C에서 94분 후, 35°C에서 94분, 1°C에서 63초, 45°C에서 72분, 1°C에서 70분의 최종 연신을 7주기 수행했습니다. 겔 전기영동은 2.5%의 아가로스 겔에서 수행되었으며 Purple Loading Dye 20x(NEB, cat. B6S)와 함께 7024μL의 PCR 산물을 로딩했습니다. β-액틴은 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. 결과는 VWR Imager CHEMI Premium에서 디지털 방식으로 획득했습니다.

HTT 표현 ESC 라인의 생성

Q15 및 Q128 세포는 각각 128개 또는 15개의 CAG 반복을 갖는 인간 헌팅틴 유전자의 N-말단을 포함하는 벡터의 DNA 형질감염에 의해 생성되었습니다(Elena Cattaneo 교수 제공). 제한 효소 PvuI로 플라스미드 DNA의 밤새 선형화를 수행하였다. DNA 형질감염을 위해 Lipofectamine 2000(Life Technologies, cat. 11668-019)을 사용하고 역방향 형질감염을 수행했습니다. 6-웰 플레이트의 한 웰에 대해 6 μl의 형질감염 시약, 2 μg의 플라스미드 DNA 및 300,000 mL의 배지에 2개의 세포를 사용했습니다. 밤새 배양한 후 배지를 교체했습니다. 항생제 선택(Puromycin 1 μg/mL)은 형질감염 24시간 후에 시작되었습니다.

관심 유전자를 안정적으로 발현하는 마우스 ESC 생성

HTT-발현 세포를 VectorBuilder(VectorBuilder Inc, Chicago, IL, USA), PB 트랜스포사제 발현 벡터 pBase(1μg). 우리는 Lipofectamine 1을 사용했고 HD 라인 생성에 대해 설명된 대로 역 형질주입을 수행했습니다. 항생제 선택(Hygromycin B, 2μg/mL; Invitrogen, cat. 5)은 형질감염 34시간 후에 시작되었습니다.

NPC 차별화

iPSC_Q21 및 iPSC_Q109는 Li et al., 2011에 따라 NPC로 분화되었습니다.⁹² 규약. 80% 컨플루언시에서 iPSC를 Accutase(Gibco, cat. A1110-501)를 사용하여 단일 세포에서 분리하고 45,000개 세포/cm² 8 μM ROCK 억제제가 포함된 E10 배지에서. 1일 후, E8 배지를 Advanced DMEM/F2(Gibco, cat. 27-12): Neurobasal(Gibco, cat. 12634-010)(21103:049 비율), BSA 1mg/mL로 구성된 N1B50 유도 배지로 대체했습니다. (Gibco, 카탈로그 15260-037), Glutamax 1%(Gibco, 카탈로그 35050-038), 페니실린/스트렙토마이신 1%(Gibco, 카탈로그 15140122), N2 Supplement 1:200(Gibco, 카탈로그 17502-048) , B27 Supplement 1:100(Gibco, cat. 17504-044), 소분자 인간 LIF 10ng/mL(Qkine, cat. Qk036), SB431542 2μM(Axon Medchem, cat. 1661), CHIR99021 3μM( Axon Medchem, cat. 1386), 화합물 E 0.1μM(Sigma-Aldrich, cat. 209986-17-4). N2B27 유도 배지는 7일 동안 매일 교체되었습니다. 7일에 NPC를 Advanced DMEM/F1(Gibco, cat. 6-2): Neurobasal(Gibco, cat. 27-12)(12634:010 비율)로 구성된 N21103B049 유지 배지에서 1:1 희석으로 분할했습니다. , BSA 50mg/mL(Gibco, 카탈로그 15260-037), Glutamax 1%(Gibco, 카탈로그 35050-038), 페니실린/스트렙토마이신 1%(Gibco, 카탈로그 15140122), N2 보충제 1:200(Gibco, cat. 17502-048), B27 Supplement 1:100(Gibco, cat. 17504-044), 저분자 인간 LIF 10ng/ml(Qkine, cat. Qk036), SB431542 2μM(Axon Medchem, cat. 1661) 보충 ), CHIR99021 3μM(Axon Medchem, cat. 1386), EGF 20ng/mL(R&D, cat. 236-EG) 및 FGF2 20ng/mL(Qkine, cat. Qk002, 재조합 제브라피쉬 FGF2)로 보충됨. NPC는 6계대 동안 유지되었습니다. h-iPSC 및 NPC 형태 데이터는 현미경 Zeiss Axio Vert A1 FL-LED로 디지털 방식으로 수집되었습니다.

관심 유전자를 일시적으로 발현하는 NPC 생성

DNA 형질감염을 위해 250,000개의 NPC를 Accutase(Gibco, cat. A1110-501)를 사용하여 단일 세포로 분리하고 FuGENE HD Transfection(Promega, cat. E1)을 사용하여 역 형질감염 프로토콜에 따라 PB 구조(2311μg)로 형질감염했습니다. . 12-웰 플레이트의 한 웰에 대해 3.9 μL의 형질감염 시약, 1 μg의 플라스미드 DNA 및 250,000 μM Y1 [ROCKi, Rho-associated kinase(ROCK) 억제제, Axon Medchem 고양이. 2]. 밤새 배양한 후 배지를 교체했습니다. 형질감염 후 27시간 후, 세포를 Rotenone 10 μM으로 27632시간 동안 처리한 후 도 1683에 나타낸 바와 같이 분석하였다. 8f.

증식 분석

마우스 ESC는 Puromycin 2 μg/mL의 존재 하에 KSR + 6iL 배지에서 15,000회 계대를 위해 조절되었습니다. ESC의 증식은 24웰 플레이트에 7,500개의 세포를 플레이팅하여 평가했습니다(XNUMX개 세포/cm²) Puromycin 2 μg/mL이 있는 KSR + 6iL 배지에서. 세포를 0.25% 트립신(Life Technologies)으로 해리시키고 24일 동안 4시간마다 계수하였다.

iPSC의 증식은 미리 코팅된 40,000% Matrigel(CORNING, cat. 0.5) 356231-웰 플레이트(12 cells/cm²) 8 μM ROCK 억제제(Y10-dihydrochloride, Axon Medchem, cat. 27632)가 포함된 E1683 배지에서 24시간 동안. 매체는 매일 변경되었습니다. 세포를 Accutase(GE Healthcare, cat. L11-007)로 분리하고 24일 동안 4시간마다 계수했습니다.

NPC의 증식은 사전 코팅된 100,000% Matrigel(CORNING, cat. 0.5) 356231-웰 플레이트(12개 세포/cm²) 2 μM ROCK 억제제(Y27-dihydrochloride Axon Medchem, cat. 10)가 포함된 N27632B1683 유지 배지에서 24시간 동안. 세포를 Accutase(GE Healthcare, cat. L11-007)로 분리하고 24일 동안 4시간마다 계수했습니다.

스트레스 요인 처리 및 크리스탈 바이올렛(CV) 염색

그림의 실험을 위해. 2b, 5,000개의 마우스 ESC를 24-웰 플레이트(2,500개 세포/cm²) KSR + 2iL 배지에서 억제제(및 퓨로마이신 6㎍/ml)의 존재 하에 48시간 동안 CV 염색[CV 용액: 0.05% w/v 크리스탈 바이올렛(Sigma) , 1% 포름알데히드 용액 37%(Sigma), 1% 메탄올, 10% PBS] 및 평균 강도의 정량화를 Fiji 소프트웨어(v2.0.0)로 수행하였다.

PB-돌연변이 유발 후 스트레스 요인 처리를 위해 세포를 밀도 2,500개 세포/cm로 플레이팅했습니다.² Puromycin 6 μg/mL에서 MG5(Sigma-Aldrich, cat. C132) 또는 Tamoxifen(Sigma-Aldrich, cat. T2211)의 존재 하에 2859일 동안 선택되었습니다.

그림의 실험을 위해 4g, 5,000개의 세포를 24-웰 플레이트에 퓨로마이신 2 μg/mL을 포함하는 KSR + 3iL 배지에 플레이팅하였다. 스트레서(MG132 12.5nM 또는 타목시펜 13.4μM)를 12시간 후에 첨가하였다. 살아남은 세포의 채점은 위에서 설명한대로 수행되었습니다.

보충 그림의 실험을 위해. 4d, 2,500개의 세포를 KSR + 48iL 배지에서 2-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 스트레스 요인[Rotenone(Sigma-Aldrich, cat. R8875), Cumene(Sigma-Aldrich, cat. 247502), 5-Azacytidine(Sigma-Aldrich, cat. A1287), MG132(Sigma-Aldrich, cat. C2211), Bafilomycin( Sigma-Aldrich, 카탈로그 B1793), 스타우로스포린(Sigma-Aldrich, 카탈로그 S6942), 타목시펜(Sigma-Aldrich, 카탈로그 T2859)]을 표시된 농도로 12시간 후에 첨가했습니다. 48시간 후, 생존 세포를 CV 용액으로 염색하고, 생존 세포의 스코어링을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.

ESC에서 PB 시스템의 전기천공

전기천공법에 의한 PB-매개 돌연변이유발을 게놈-와이드 스크리닝을 위해 수행하였다. PB 벡터는 TTAA 사이트에 무작위로 삽입된 후 게놈에 안정적으로 통합됩니다. 사용된 PB pGG134 벡터(도 XNUMX에 도시됨). 2a) 기능 획득 화면에 최적화되었습니다.⁵⁴: MSCV 인핸서/프로모터에 이어 엑손 1의 스플라이스 공여자 부위로 구성됩니다. Foxf2 주변 유전자의 과잉 활성화를 허용하는 유전자. PB 5'-ITR은 또한 방향성 프로모터 활성이 약합니다. 즉, 이 구조는 유전자를 어느 쪽 방향으로든 활성화할 수 있습니다. 벡터는 DsRed 및 하이그로마이신 내성 유전자가 뒤따르는 구성적 프로모터를 포함하는 두 번째 카세트를 포함하며, 이는 안정한 벡터 통합으로 세포를 식별하는 데 사용되었습니다.

PB 벡터 대 트랜스포사제 pBase의 비율을 조정하여 적은 수의 통합 이벤트를 달성하기 위해 조건을 최적화했습니다. 스크리닝 절차를 위해, 최적화된 양의 0.5 μg pGG134 및 20 μg pBase를 사용하여 돌연변이 유발을 수행하였다.

단일 전기천공의 경우, 10⁷ 세포 및 20.5㎍ DNA를 혼합하고 전기천공 큐벳(Biorad Gene Pulser Cuvette, cat. 165-2088)에 넣었다. 큐벳을 Biorad GenePulser(카탈로그 165-2076)의 전기천공 홀더에 넣어 세포를 전기천공했습니다. 사용된 설정: 250V, 500μF, 시간 상수는 5.6과 7.5 사이여야 합니다. 전기천공 처리된 세포를 큐벳에서 부드럽게 회수하여 도금했습니다. 항생제 선택은 전기천공 후 24시간 후에 시작되었습니다.

게놈 DNA 추출 및 Slinkerette-PCR

세포를 수확하고 용해 완충액[56mM Tris-HCl, pH 10; 7.5mM EDTA; 10mM NaCl; 10% w/v Sarcosyl, 프로테이나제 K(Sigma, cat. P0.5)로 최종 농도가 2308 mg/mL로 보충됨]. DNA 침전물을 얻기 위해 다음날 NaCl과 에탄올의 혼합물 1mL(차가운 무수 에탄올 2mL와 혼합된 30M NaCl 5μL)를 첨가했습니다. 세포 추출물을 20°C에서 45분 동안 원심분리하여 용해성 분획을 제거했습니다. 침전된 gDNA를 4% 에탄올 2mL를 적하하여 세 번 헹구고 마지막으로 70°C milliQ 물에 재현탁했습니다.

PB 통합 매핑을 위한 Slinkerette-PCR 절차는 Potter와 Luo에서 채택되었습니다. ¹³⁹ 다음 단계로 구성되었습니다: a) 2 μg의 게놈 DNA를 10 μL 부피의 10,000 U BstYI(30 U/mL, NEB)로 분해했습니다. 반응을 60°C에서 밤새 인큐베이션하고, 다음날 효소를 80°C에서 20분 동안 불활성화시켰다. Splinkerette-PCR용 어댑터는 150pmol의 AdapterA 및 B 프라이머를 어닐링하여 생성되었습니다(보충 표 1) 최종 부피 100μL(10x NEB 버퍼 2). 올리고는 65°C에서 5분 동안 변성된 다음 냉각되었습니다. b) 라이게이션은 6x 라이게이션 믹스(Takara), 소화된 gDNA 2 μL 및 Splinkerette-PCR용 어닐링된 어댑터 2.5 μL를 포함하는 총 부피 0.5 μl에서 수행되었습니다. 라이게이션 반응은 효소 불활성화를 위해 16°C에서 밤새, 다음날 65°C에서 10분 동안 인큐베이션되었다. 제조업체의 지침에 따라 Qiaquick PCR 정제 키트를 사용하여 단계 C 전에 정제 단계가 포함되었습니다. PCR 증폭을 위해 GC가 풍부한 템플릿 또는 5차 구조가 있는 템플릿에 권장되는 5x Phusion GC 버퍼에 Phusion HF DNA Pol(NEB)을 사용했습니다. PCR 믹스에는 10x GC 버퍼, 15mM dNTP, DMSO 및 Phusion Pol이 포함되었습니다. c) 50차 PCR을 각 프라이머(Adaptor-PCR5 및 PB3' 또는 PB0.5'에 대해 1μM)의 결찰된 DNA(또는 PB5' 및 PB3' 트랜스포존/숙주 접합에 대한 각 반응에 대한 결찰 생성물의 1%) 6.5μL로 증폭했습니다. -ITR PCR25), 1μL PCR 믹스, 최종 부피 95μL. Slinkerette-PCR2 프로그램: 95°C에서 20분간; 65초 동안 30℃, 68초 동안 2℃, 30분 동안 95℃의 30주기; 그 후 60초 동안 30°C, 68초 동안 2°C, 68분 동안 10°C의 5주기; 그런 다음 1 °C에서 500분 동안; d) 1차 PCR을 위해 PCR0.5 제품의 2:5 희석액 3μL, 각 프라이머(Adapter-PCR2 및 PB6.5' 또는 PB25'-ITR PCR2)에 대해 95μM, 2μL PCR 믹스, 최종 부피 95μL를 사용했습니다. . Slinkerette-PCR20 프로그램: 65°C에서 30분간; 68초 동안 2℃, 5초 동안 95℃, 30분 동안 60℃의 30주기; 그 다음 68초 동안 2℃, 25초 동안 95℃, 30분 동안 58℃의 30주기; 그 다음 68초 동안 2℃, 68초 동안 10℃, 2분 동안 5℃의 3 사이클; 그런 다음 2 °C에서 XNUMX분 동안; e) PCRXNUMX 산물을 Antarctic Phosphatase 및 Exonuclease I(둘 다 NEB 제품)로 처리하고 PBXNUMX'- 또는 PBXNUMX'-ITR PCRXNUMX 프라이머를 사용하여 시퀀싱했습니다. 프라이머 및 어댑터 시퀀스는 보충 표에 나열되어 있습니다. 1.

게놈 통합 부위의 차세대 시퀀싱 분석

Gentra Puregene Cell Kit를 사용하여 전체 돌연변이 집단의 게놈 DNA를 추출했습니다. 라이브러리 준비 및 시퀀싱은 이전에 설명한대로 수행되었습니다.¹⁴⁰. 맞춤형 생물정보학 파이프라인을 통해 각 판독값을 게놈 위치에 매핑하고 각 통합 사이트를 20kb 거리 내의 유전자에 연결할 수 있습니다. 그런 다음 데이터를 Cytoscape 소프트웨어(v3.8.2)를 통해 HD 상호 작용 유전자 네트워크로 구성했습니다.¹⁴¹.

요오드화프로피듐(PI) 염색

PI 염색은 제조업체의 지침(Ebioscience, cat. 88-8007-72)에 따라 살아있는 단일 마우스 ESC에서 수행되었습니다. PBS로 세척 후, 10⁵ 살아있는 세포를 200 μL의 1x 결합 완충액에 재현탁하고 5 μL의 PI 염색 용액(cat. 00-6990)을 첨가했습니다. 유세포 분석은 BD FACSCanto를 사용하여 수행되었습니다.^TM 어두운 곳에서 1-2 °C에서 샘플을 보관하면서 8시간 이내에 II 세포측정기. 데이터는 BD FACSDiva로 분석되었습니다.^TM (v. 9.0) 및 FlowJo(10.8.1) 소프트웨어. 대표적인 게이팅 전략은 보충 그림에서 사용할 수 있습니다. 10a.

ROS 측정 분석

ROS 생산은 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(H₂DCFDA; 생명 기술, 고양이. D399), 다음 단계 수행: a) ROS 지시약을 새로 재구성하여 농축 원액(10mM)을 만들고; b) 3-5×10⁵ 세포를 수확하고, c) 500 μL의 PBS로 300회 세척하고, d) 0.5 μM 염료의 최종 작업 농도를 제공하기 위해 프로브를 함유하는 37 μL PBS에 재현탁하고; e) 세포를 암실에서 10분 동안 XNUMX°C에서 배양하였다; f) 염색 용액을 제거한 후, 샘플을 g) PBS에서 XNUMX회 세척하였다. BD FACSCanto를 사용하여 유동 세포 계측법으로 샘플을 수집했습니다.^TM II cytometer 또는 BIO-RAD S3e Cell Sorter 및 BD FACSDiva로 분석 수행^TM (v. 9.0), 프로소트^TM (v. 1.6) 및 FlowJo(10.8.1) 소프트웨어. 대표적인 게이팅 전략은 보충 그림에서 사용할 수 있습니다. 10b-c.

아넥신 V 염색

관심 있는 유전자로 일시적으로 형질감염되고 Rotenone 30 μM으로 24시간 동안 처리된 살아있는 NPC는 제조업체의 지침(Ebioscience, cat. 88-8007-72)에 따라 Annexin V로 염색되었습니다. 세포를 PBS에서 한 번 세척한 다음 1x 결합 완충액(cat. 00-0055)에서 한 번 세척했습니다. 5×10⁵ 세포를 200 μL의 1x 결합 완충액에 재현탁하고 5 μL의 형광색소 결합 Annexin V(cat. 17-8007)와 함께 실온에서 10분 동안 배양했습니다. 그런 다음 세포를 500 μL의 1x 결합 완충액으로 세척했습니다. 마지막으로, 세포를 200 μL의 1x 결합 완충액에 재현탁했습니다. BIO-RAD S3e 세포 분류기를 사용하여 1시간 이내에 유세포 분석을 수행하고 시료를 2-8°C의 어두운 곳에서 보관했습니다. 데이터는 ProSort로 분석되었습니다.^TM (v. 1.6) 및 FlowJo(10.8.1) 소프트웨어. 대표적인 게이팅 전략은 보충 그림에서 사용할 수 있습니다. 10c.

웨스턴 블 랏팅

세포를 차가운 PBS에서 세척하고 용해 완충액(50mM Hepes pH 7.8, 200mM NaCl, 5mM EDTA, 1% NP40, 5% 글리세롤)에서 수확하고, 1mM DTT, 프로테아제 억제제(Roche, cat. 39802300)를 새로 보충했습니다. ) 및 포스파타제 억제제(Sigma-Aldrich, cat. P5726). 샘플을 초음파 처리기(Diagenode Bioruptor)에서 초음파에 노출시키고 15,871rcf에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 준비했습니다. 단백질 농도는 Bradford 정량화에 의해 결정되었습니다. 그림의 실험을 위해. 1b, 2g, 4d 및 보충 그림 1d, 총 단백질(10μg)을 4-12% Nupage MOPS 아크릴아미드 겔(Life Technologies, cat. BG04125BOX/BG00105BOX)에서 분획하고 이동 용액(00010mM Tris -HCl, 50mM 글리신, 40% 메탄올, 20% SDS). 이어서 막을 실온에서 0.04시간 동안 TBST(5g NaCl, 170g Tris-HCl, 6405% Tween8/리터, pH 2.4) 중의 0.1% 무지방 분유(BioRad; 20-7.5-MSDS)로 포화시켰다. 항-HTT(클론 1HU-4C1) 또는 항-GAPDH(클론 4C8) 6차 항체(보충 표 2). 그런 다음 멤브레인을 TBST의 1% 우유에 희석된 퍼옥시다아제와 접합된 34078차 항체와 함께 배양했습니다. Pico SuperSignal West 화학발광 시약(Thermo Scientific, cat. 4000)을 사용하여 멤브레인을 배양하고 이미지를 ImageQuant LAS XNUMX(GE Healthcare)에서 디지털 방식으로 획득했습니다. 자르지 않은 젤과 수치 값은 소스 데이터 파일에 제공됩니다.

경추 탈구에 의해 마우스를 희생시키고 조직을 20mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% Nonidet P-40, 1mM EDTA, 20mM NaF, 2mM Na를 함유하는 용해 완충액에서 균질화하였다.₃VO₄ 및 1:1000 프로테아제 억제제 혼합물(Sigma-Aldrich) 및 초음파처리. 보충 그림의 실험을 위해. 1b, WT 마우스, R50/6 마우스, Q2 세포 및 Q15 세포의 총 단백질 용해물 128μg을 핸드캐스트 5-11% 아크릴아미드 스태킹-젤에 로드하고 다음 항체와 함께 배양했습니다: 항-HTT(클론 EM48) 및 항 -GAPDH(보충 표 2). 보충 그림의 실험을 위해. 8a, d, e 및 g, 40 μg의 총 단백질 용해물을 다음 항체로 면역블롯팅했습니다. 2). 멤브레인은 위에서 설명한대로 처리되었습니다. 이미지는 Image Lab 소프트웨어, BioRad(v. 6.1)를 사용하여 VWR Imager CHEMI Premium 또는 ChemiDoc XRS+(모델 번호: Universal Hood II)에서 디지털 방식으로 획득했습니다. 정량화는 로딩 제어(GAPDH, ACTIN 또는 TUBULIN)에서 백그라운드 차감 및 정규화와 함께 Fiji 2.9.0을 사용하여 수행되었습니다. 자르지 않은 젤은 소스 데이터 파일에 제공됩니다.

면역 형광

마우스 ESC에서 MTF1 검출을 위한 면역형광은 피브로넥틴(Merck, cat. FC010)-코팅된 유리 커버슬립에 플레이팅된 세포에서 수행되었습니다. 세포를 실온에서 4분 동안 PBS 중 8775% 포름알데히드(Sigma-Aldrich, cat. F10)로 고정하고, PBS로 세척하고, 실온에서 PBS + 10% Triton X-0.1(PBST)에서 100분 동안 투과하고 차단했습니다. 실온에서 3분 동안 PBST + 16050% 말 혈청(HS; Gibco, cat. 122-45)에서. 세포를 4차 항체와 함께 XNUMX°C에서 밤새 배양했습니다(XNUMX차 및 XNUMX차 항체에 대한 자세한 내용은 보충 표 참조). 2) PBST + HS의 3%. PBST로 세척한 후 세포를 45차 항체(Alexa, Life Technologies)와 함께 실온에서 4분 동안 배양했습니다. 핵은 DAPI(6',2-diamidino-6057-phenylindole; Sigma-Aldrich, cat. F5)로 염색되었습니다. 이미지는 Leica SP2.9.0 공초점 현미경으로 획득했습니다. 이미지 분석은 Fiji 4.1.3을 사용하여 수행되었습니다. CellProfiler 소프트웨어(v10)를 사용하여 핵 및 세포질 강도의 정량화를 수행했습니다. 간략하게, 핵은 DAPI 염색에 의해 검출되었다. 세포질은 방사상으로 핵을 1픽셀씩 확장하여 임의로 정의했습니다. MTF1 신호의 세포 통합 강도(핵 + 세포질)에 대한 MTFXNUMX 신호의 통합 핵 강도의 비율을 계산하고 플롯팅했습니다.

인간 iPSC 및 NPC에 대한 면역형광 분석은 웰의 1% Matrigel 코팅 유리 커버슬립에서 수행되었습니다. 세포를 실온에서 4분 동안 PBS 중 8775% 포름알데히드(Sigma-Aldrich, cat. F10)로 고정하고, PBS로 세척하고, 실온에서 PBST로 1시간 동안 투과시키고, PBST + 5% HS(Gibco, 카탈로그 16050-122) 실온에서 5시간 동안. 세포를 4차 항체와 함께 XNUMX°C에서 밤새 배양했습니다(XNUMX차 및 XNUMX차 항체에 대한 자세한 내용은 보충 표 참조). 2) PBST + HS의 3%. PBS로 세척한 후 세포를 45차 항체(Alexa, Life Technologies)와 함께 실온에서 4분 동안 배양했습니다. 핵은 DAPI(6',2-diamidino-6057-phenylindole; Sigma-Aldrich, cat. F900)로 염색되었습니다. 이미지는 Zeiss LSM2 Airyscan 2.9.0 공초점 현미경으로 획득했습니다. 이미지 분석은 Fiji XNUMX을 사용하여 수행되었습니다.

RNA 분리, 역전사 및 정량적 PCR

세포 용해물의 경우 Total RNA Purification Kit(Norgen Biotek, cat. 37500)를 사용하여 RNA를 분리하고 M-MLV 역전사효소(Invitrogen, cat. 500-28025), RNaseOUT(013 단위/μL), 랜덤 프라이머(40nM), dNTP(200mM), 첫 번째 가닥 버퍼 10x, DTT(5M). 제브라피쉬 유충의 경우 페놀-클로로포름 추출을 이용하여 총 RNA를 분리했습니다. 표준 트리졸-클로로포름-에탄올 추출 절차에 대한 제조업체의 지침에 따라 TRIzol Reagent(Life Technologies, cat. 0.1)를 사용하여 10마리 동물 풀에서 총 RNA를 분리했습니다. RNA 침전 단계의 수율을 높이기 위해 프로토콜에서 제안한 대로 RNase가 없는 글리코겐을 사용했습니다. Superscript III Reverse Transcriptase(Invitrogen, cat. 15596026) 및 oligo(dT)2 프라이머(18080044 μg/mL)의 혼합물을 사용하여 총 RNA 18 μg을 cDNA로 역전사시켰습니다. dNTP 믹스(500mM); DTT(10M); 0.1x 첫 번째 가닥 버퍼; RNaseOUT(5단위/μL).

실시간 PCR에는 SYBR Green Master mix(Bioline, cat. BIO-94020)를 사용하였다. 프라이머는 보충 표에 자세히 설명되어 있습니다. 3. 기술 복제는 모든 정량적 PCR에 대해 수행되었습니다. 마우스 ESC의 경우 인간 iPSC 및 NPC, Gapdh 및 GAPDH를 내인성 대조군으로 사용하여 발현을 정상화했습니다. 제브라피쉬의 Ct 평균 갭드, eef1a1l1, 튜바1b 과 b2m 이러한 유전자의 발현 수준을 살펴보는 변동성으로 인해 정상화를 위한 내인성 하우스키핑 컨트롤로 사용되었습니다. qPCR 데이터는 QuantStudio™ 6&7 Flex 소프트웨어 1.0 및 1.3 버전으로 수집되었습니다.

RNA 시퀀싱: 라이브러리 준비

총 RNA는 Qubit 4.0 형광 분석법(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 정량화되었습니다. NEGEDIA Digital mRNA-seq 연구 등급 시퀀싱 서비스(Negedia srl)를 사용하여 총 RNA 125ng에서 라이브러리를 준비했습니다.¹⁴⁰ 여기에는 싱글 엔드, 6000주기 전략(Illumina Inc.)을 사용하는 NovaSeq 100 시퀀싱 시스템에서 라이브러리 준비, 품질 평가 및 시퀀싱이 포함되었습니다.

생물 정보학 워크플로우

원시 데이터는 Next Generation Diagnostics srl 소유의 NEGEDIA Digital mRNA-seq 파이프라인에 의해 분석되었으며, 여기에는 품질 필터링 및 트리밍, 참조 게놈에 대한 정렬 및 유전자에 의한 계수에 의한 세척 단계가 포함됩니다.^142,143. 5개 샘플 중 최소 3개 샘플에서 총 카운트 수가 30 미만인 유전자를 제거하여 유전자를 분류했습니다. 이 필터를 적용한 후 추가 분석을 위해 고려된 11,851개의 발현된 유전자를 확인했습니다.

차등 발현 분석은 DESeq4.1.0 R 패키지를 이용하는 Bioconductor(v. 3.14)를 사용하여 R 환경(v. 2)에서 수행되었습니다. (v. 1.34.0)¹⁴⁴ 및 edgeR(v. 3.36.0)¹⁴⁵. DESeq2는 크기 요인의 추정, 각 유전자에 대한 분산의 추정을 수행하고 양측 Wald 통계를 사용하여 음의 이항 일반화 선형 모델에 적합합니다. Q128과 Q15 사이의 DEG의 생물학적 중요성(그림. 1g), Q128_Mtf1과 Q128 사이의 DEG(보조 그림 5b) 및 에 의해 구조된 유전자의 MTF1 (무화과. 5c)은 Enrichr 소프트웨어(v. 3.0)를 사용하고 생물학적 과정(BP)(2021) 및 분자 기능(MF)(2021)의 범주를 포함하는 Gene Ontology(GO) 용어 강화 분석에 의해 탐색되었습니다.

세포 집단 증식의 강화를 수행하기 위해(GO:0008283 및¹⁴⁶) 및 세포사멸(R-HSA-109581 및 WP1351) 유전자 시그너처를 과발현하는 Q128 및 Q15 세포주에서 MTF1, GSEA(Gene Set Enrichment Analysis) 소프트웨어(v 4.3.2)를 사용했습니다.¹⁴⁷. 미리 순위가 매겨진 유전자 세트 목록은 로그를 기반으로 생성되었습니다.₂ Q128_Mtf1 대 Q128 및 Q15_Mtf1 대 Q15 사이의 미분 발현 분석에 의해 얻어진 접힘-변화(FC) 값.

Regulatory Genomics Toolbox 제품군의 Motif Analysis 도구를 사용하여 Motif 농축 분석을 수행했습니다(https://reg-gen.readthedocs.io). Mtf1 MRE는 Jaspar 데이터베이스(9번째 버전, http://jaspar.genereg.net/)¹⁴⁸. "rgt-motifanalysis matching" 명령을 사용하여 모든 관심 유전자의 프로모터 영역에서 결합 부위를 검색했습니다. 그런 다음 "rgt-motifanalysis 농축"을 사용하여 관심 있는 유전자 세트에서 결합 부위의 비율이 우연히 예상한 것보다 높은지 평가하기 위해 Fisher의 정확한 테스트를 수행했습니다.

RNA 시퀀싱 데이터 및 Mtf1 MRE의 대표적인 생물학적 복제물 중 하나는 Integrated Genomics Viewer(IGV v. 2.16.0)에서 트랙으로 시각화되었으며 그림 XNUMX에 표시되어 있습니다. 5h.

화산 플롯과 산점도는 로그로 생성되었습니다.₂ FC 및 -log₁₀ p-ggpubr R 패키지(v. 0.4.0.5)의 ggscatter 기능을 활용하는 값입니다. 히트맵은 pheatmap R 패키지(v. 1.0.12)의 pheatmap 기능과 함께 CPM 값을 사용하여 만들어졌습니다.

Mtf1 orthologues의 정렬

XNUMXD덴탈의 MTF1 Clustal Omega 소프트웨어(v1.2.4, https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)¹⁴⁹. 서열 간 동일성은 Sequence Manipulation Suite 프로그램(https://www.bioinformatics.org/sms2/ident_sim.html).

금속 분석

48시간 컨디셔닝 처리 후, 10⁷ Q15 및 Q128 세포를 수집하고, Eppendorf 튜브에서 원심분리하고, 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 -80°C에서 보관했습니다. 분석 직전에 세포를 해동하고 농축된 HNO에 재현탁₃ (68%), 각 샘플에 1mL 추가. 완전히 용해한 후 초순수 2mL를 첨가하고 고효율 고압 마이크로웨이브 반응기(Ultrawave, Milestone, Bergamo, Italy)를 사용하여 마이크로웨이브 가열을 통해 샘플을 완전히 광물화했습니다. 컨디셔닝 처리 전후에 동일한 절차를 배양 배지에 적용했습니다. 금속 정량 분석을 위한 검량선은 인증된 다중 원소 및 단일 원소 표준(Agilent)을 사용하여 서로 다른 농도(0.005-0.010-0.025-0.050-0.100-0.200ppm)의 0.20가지 표준 용액을 준비하여 얻었습니다. 그런 다음 모든 샘플을 5110μm 주사기 필터를 통해 여과했습니다. 아르곤 플라즈마에서 얻은 샘플의 원자화 및 이온화와 함께 금속 분석은 Inductively Coupled Plasma – Optical Emission Spectrometry(ICP-OES, mod XNUMX, Agilent)로 수행되었습니다.

Zebrafish HD 모델 생성

HD 제브라피쉬는 인간의 첫 번째 엑손을 암호화하는 mRNA의 단일 세포 단계 배아에서 미세 주입에 의해 생성되었습니다. HTT 74Q 또는 16Q를 포함하여 프레임 내에서 eGFP 코딩 시퀀스에 융합되었습니다. Q74eGFP 및 Q16eGFP는 시험관 내 전사를 허용하기 위해 pCS2+ 플라스미드로 클로닝되었습니다. pCS2_Mtf1 및 pCS2_mCherry 플라스미드도 생성하여 MTF1 과 엠체리 HD 제브라피시 배아의 주사에 사용되는 mRNA.

RNA 시험관 내 전사의 경우, 2.5μg의 pCS2_Q74eGFP, pCS2_Q16eGFP, pCS2_Mtf1 및 pCS2_mCherry를 37°C에서 HF-Not I(New England Biolabs, cat. R3189S)로 밤새 분해하여 선형화했습니다. 그런 다음 분해 부피를 DNA Clean & Concentrator 키트(Zymo Research, cat. D4003)로 농축하고 SP6 RNA 중합효소에 의한 캡핑된 전사 반응(mMESSAGE mMACHINETM SP1340 Transcription Kit, Thermo Fisher Scientific, cat. AM6)에 사용했습니다. 2238°C에서 15분 동안 DNase 처리(Thermo Fisher Scientific, cat. AM37)로 DNA 주형을 제거한 후 RNA를 Phenol-Chloroform 추출로 정제했습니다('RNA 분리, 역전사 및 정량적 PCR' 단락 참조). RNA는 Nanodrop ND-1000으로 정량화한 다음 필요에 따라 10% Danieau 버퍼[8mM NaCl, 0.7mM KCl, 0.4mM MgSO₄, 0.6mM Ca(NO₃)₂, 2.5mM HEPES, pH 7.6], 10% Phenol Red(Merck, cat. 1072410025) 및 RNase가 없는 물.

가장 낮은 수준의 사망으로 가장 높은 기형 발생률을 유발하는 주사 용량을 선택하기 위해 우리는 74에서 150 pg/embryo 범위의 Q1000eGFP mRNA의 증가 용량을 주입하고 표현형적으로 24 hpf 배아를 기록했습니다. 일단 250pg/embryo의 용량이 설정되면 광학 현미경 하에서 배아에 시험관 내에서 전사된 mRNA를 주입했습니다. 미세주입된 배아를 어류로 옮기고 28°C에서 배양했습니다. 수정되지 않은 난자는 미세 주입 후 4시간 후에 인식되고 폐기되었습니다. 24 hpf 올챙이는 광학 현미경으로 전용 바늘을 사용하여 융모막을 제거했습니다.

전체 마운트 염색

주입된 배아를 트리카인으로 마취하고 1.5% 메틸셀룰로스 또는 2% 저융점 아가로스에 고정하고 Leica M165FC 형광 현미경을 사용하여 분석했습니다. 공초점 제브라피쉬 이미지는 Nikon C2 H600L 공초점 현미경으로 획득했습니다.

Acridine Orange hemi(염화아연) 염 in vivo 염색(Merck, cat. A6014)의 경우, 24 hpf 배아를 탈색소화하고 6웰 플레이트로 옮기고 웰당 약 2mL의 Acridine Orange(20μg/mL)에서 배양했습니다. 15 °C에서 28분 동안 어류에서. 그런 다음 아크리딘 용액을 제거하고 배아를 어류 1mL로 XNUMX회 세척했습니다. 형광 현미경으로 유리 슬라이드에서 관찰하기 전에 올챙이는 Tricaine으로 마취되었습니다.

TUNEL 분석을 위해 ApopTag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit(Merck, cat. S7110) 및 콜라게나아제(Merck, cat. C9891)를 사용했습니다. 7개의 배아 - 조건당 미세 주입 후 30시간을 Eppendorf에 넣고 Tricaine으로 마취하고 4°C에서 밤새 4% 파라포름알데히드(PFA)에 고정했습니다. 그 다음, PFA를 제거하고 샘플을 PBS로 흔들면서 세척하였다(3회, 각 10분). 배아는 10%에서 100% 범위의 일련의 메탄올 용액을 통해 탈수되었고 밤새 -20 °C에서 동결되었습니다. 그런 다음 배아를 일련의 70-50-30% 메탄올 용액으로 재수화하고 Tween-20이 포함된 PBS로 10분 동안 흔들면서 세척했습니다. 그 후, 진탕하면서 8분 동안 콜라게나제를 적용하고 Tween-20 세척 단계(각 3분씩 5회)로 PBS로 과잉을 세척하였다. 샘플을 흔들면서 평형 완충액에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음 작업 강도 TdT에서 2°C에서 37시간 동안 인큐베이션했습니다. 작업 강도 중지/세척 완충액에서 샘플을 두 번 세척하여 반응을 중지했습니다. 다음으로, 흔들면서 Tween-1이 포함된 PBS로 20시간의 차단 단계가 있었고, 그 후 배아를 어두운 곳에서 4°C에서 Working Strength 항-digoxigenin 접합체 용액에서 밤새 배양했습니다. 다음날 아침, 항체 용액을 제거하고 샘플을 PBS로 세척(4회, 각 10분)하고 공초점 현미경으로 분석하였다. Zebrafish 유충 전방 구조는 전체 깊이에 걸쳐 각각 70μm의 3.475개 스택에서 스캔되었습니다. 우리는 전체 면적(난황 영역 제외)에 대한 형광 양성 영역의 분율을 정량화했습니다. 정량화 분석을 위해 모든 이미지를 동일한 노출 매개변수로 획득하고 Fiji 소프트웨어(v2.9.0)를 사용하여 처리했습니다. 통계 분석은 Past(v.4.03)와 Prism(v.9.5.0)을 사용하여 수행되었습니다.

AAV-PHP.eB 벡터 주입, 마우스 표현형 및 조직 수집

AAV-PHP.eB 바이러스 입자는 이전에 설명한 대로 Broccoli의 실험실에서 생산 및 적정되었습니다.⁷⁵. 이 바이러스 벡터는 Ef-1ɑ 프로모터의 제어하에 후보 유전자를 발현하도록 변형되었습니다. MTF1 또는 eGFP를 컨트롤로 사용합니다. 혈관 주입은 가열된 홈에 꼬리를 위치시키는 구속 장치에서 수행되었습니다. 꼬리를 알코올로 닦은 다음 정맥 주사했습니다. WT 및 R6/2 마우스를 그룹으로 무작위 배정하고 4.2주령에 꼬리 정맥에 주사했습니다. 주입 후, 모든 마우스의 체중을 일주일에 두 번 측정했습니다. 일주일에 두 번 유전자형과 치료에 대해 맹검으로 표현형 분석을 수행했습니다. 균형과 운동 조정은 Rotarod 테스트와 Horizontal Ladder Task로 평가되었습니다. 총 DNA는 Qiagen DNeasy 혈액 및 조직 키트(QIAGEN, cat. 9504)를 사용하여 동물 조직(피질 및 선조체)에서 분리되었습니다.

축산

모든 Zebrafish 실험은 파도바 대학교 생물학과의 Fish Facility에서 수행되었습니다. Zebrafish 유충은 표준 절차에 따라 60°C, 중성 pH에서 생선 물(Instant Ocean 15mg, cat. SS10-28, 증류수 XNUMX리터당)이 담긴 페트리 접시에서 최대 XNUMX일 동안 보관했습니다.http://ZFIN.org).

마우스 콜로니는 IRCCS Neuromed에서 확립되었습니다. R6/2 계통의 트랜스제닉 암컷 마우스[균주명: B6CBA-tgN(HDexon1) 62Gpb/1J]의 번식 쌍 ∼160 ± 10 CAG 반복 확장은 Jackson Laboratories에서 구입했습니다. 마우스는 표준 조건(22 ± 1 °C, 상대 습도 60%, 12시간 명/암 일정, 3-4마리/케이지, 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있음)에 수용되었습니다. 콜로니 유지를 위해 수컷 R6/2 마우스(5-6주령)를 암컷 B6CBA WT 마우스(5-6주령)와 교배시켰고; 결과 WT 및 R6/2 마우스는 이 연구에서 수행된 모든 실험에 사용되었습니다. 연령, 성별, 치료 및 측정을 나타내는 이 연구에 사용된 마우스의 전체 목록은 보충 표에 보고되어 있습니다. 4. 모든 실험 절차는 IRCCS Neuromed Animal Care Review Board 윤리 위원회와 Istituto Superiore di Sanità(ISS 허가 번호: 548/2022-PR)의 승인을 받았으며 동물 실험에 대한 2010/63/EU 지침에 따라 수행되었습니다.

운동 행동 테스트

모든 행동 테스트는 밝음/어두움 주기의 밝은 단계에서 수행되었습니다. 지시된 시점에서 처리 전후에 마우스를 시험하였다. 훈련 및 테스트 전에 마우스는 테스트 룸 및 장비에 익숙해지는 기간을 거쳤습니다. 모든 마우스는 운동 행동 측정을 수행하기 전에 각 기기 및 작업에 대해 연속 0.1일 동안 훈련을 받았습니다. 마우스를 로타로드 장치에서 고정 속도(1rcf)로 1분 동안 테스트했습니다. 각 마우스는 각각 1분씩 XNUMX번의 연속적인 시도에서 테스트되었으며 시도 사이에 XNUMX분의 휴식을 취했습니다. XNUMX번의 시도 각각에서 로타로드에 소요된 시간을 평균하여 각 마우스에 대한 전체 시간을 제공했습니다. 수평 사다리 작업에서 마우스는 가로대 사이의 가변적이고 불규칙한 간격으로 수평 사다리를 따라 자발적으로 걸었습니다. 각 테스트 세션에서 확립된 발걸음 점수 시스템을 사용하여 마우스 성능을 평가했습니다.¹⁵⁰, 사다리 가로대에 앞다리와 뒷다리 배치의 질적 및 양적 평가를 허용합니다. 모든 운동 테스트는 전체 분석 과정에서 마우스 유전자형과 실험 그룹에 대해 눈이 먼 동일한 실험자에 의해 수행되었습니다.

걸쇠 분석

걸쇠 점수는 30초에 걸쳐 결정됩니다. 특히, 생쥐를 50cm 높이에서 꼬리로 매달았고 팔다리를 움켜쥐는 반응은 팔다리를 몸통 쪽으로 2초 이상 움츠린 것으로 정의했습니다. 다음 점수가 사용되었습니다: 0(클래핑 없음), 0.5(한 쪽 사지 철회), 1(두 가지 사지 철회), 1.5(세 가지 사지 철회), 2(사지 모두 철회).

디하이드로에티듐(DHE)

WT 및 R6/2 마우스를 경추 탈구로 희생시켰다. 후각 구근과 척수를 제거하여 뇌를 제거하고 다듬었습니다. 나머지 뇌는 처리되어 파라핀 왁스에 포매되었고, RM 10 마이크로톰(Leica Microsystems)에서 2245 μm 관상 절편이 절단되었고 증류수를 포함하는 40 °C 수조에 부유되었습니다. 절편을 면역조직화학에 적합한 유리 슬라이드로 옮기고 실온에서 밤새 건조시켰다. 샘플을 자일렌에서 30분 동안 탈파라핀 처리하고, 100분 동안 10% 알코올로 옮긴 다음 각각 95분 동안 각각 70%, 50% 및 10% 알코올을 통해 한 번, PBS로 두 번 세척했습니다. 제자리 과산화물 생성 생성은 DHE(Sigma-Aldrich, cat. D7008)를 사용한 형광에 의해 검출되었습니다. 샘플을 2°C에서 37분 동안 차광된 가습 챔버에서 DHE(30 μM)와 함께 배양했습니다. 슬라이드를 PBS로 4.40회 세척하고 현미경으로 관찰하였다. 각 염색을 위해 실험군당 2.9.0마리의 마우스를 사용하고 각 동물에 대한 XNUMX개의 관상 절편을 Nikon ECLIPSE Ni 현미경으로 획득하고 NIS-Elements Image Software(v. XNUMX, Nikon) 및 Fiji 소프트웨어 XNUMX으로 분석했습니다.

mHTT 응집체 면역 염색

WT 및 R6/2 마우스를 경추 탈구로 희생시켰다. 후각 구근과 척수를 제거하여 뇌를 제거하고 다듬었습니다. 나머지 뇌는 처리되어 파라핀 왁스에 포매되었고, RM 10 마이크로톰(Leica Microsystems)에서 2245 μm 관상 절편이 절단되었고 증류수를 포함하는 40 °C 수조에 부유되었습니다. 절편을 면역조직화학에 적합한 유리 슬라이드로 옮기고 실온에서 밤새 건조시켰다. 샘플을 자일렌에서 30분 동안 탈파라핀 처리하고, 100분 동안 10% 알코올로 옮긴 다음 각각 95분 동안 각각 70%, 50% 및 10% 알코올을 통해 한 번, PBS로 두 번 세척했습니다. 항원 에피토프의 차폐를 제거하기 위해 구연산 완충액 방법(10-6.0°C에서 95분 동안 구연산 완충액 100mM, pH 15과 함께 인큐베이션한 다음 슬라이드를 15분 동안 식히십시오)을 사용하여 항원 검색을 수행했습니다. 슬라이드를 PBS로 0.1회 세척하고 TBS-Triton 10%에서 10분 동안 투과화한 다음 차단 완충액(PBS 내 말 혈청 1%)과 함께 실온에서 가습 챔버에서 4시간 동안 배양했습니다. 차단 완충액을 제거하고 슬라이드를 마우스 항-HTT 항체(클론 EM48, 자세한 내용은 보충 표 참조)를 사용하여 밤새 XNUMX°C의 가습 챔버에서 배양했습니다. 2). PBS로 1회 세척한 후, 세포를 빛으로부터 보호된 실온의 가습 챔버에서 4시간 동안 6차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 핵은 DAPI(2',6057-diamidino-4.40-phenylindole; Sigma-Aldrich, cat. F2.9.0)로 염색되었습니다. 실험 그룹당 XNUMX마리의 마우스를 사용하였고 각 동물에 대한 XNUMX개의 관상 절편을 Nikon ECLIPSE Ni 현미경으로 획득하고 NIS-Elements Image Software(v. XNUMX, Nikon) 및 Fiji 소프트웨어 XNUMX으로 분석했습니다.

통계 및 재현성

샘플 크기를 미리 결정하기 위해 통계적 방법을 사용하지 않았지만 샘플 크기는 연구 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 유사합니다. 분석에서 제외된 데이터는 없습니다. 데이터 분포는 정상적인 것으로 가정했지만 공식적으로 테스트되지는 않았습니다. P-반복 측정을 포함하는 실험에 대한 값(그림. 1c, 그림. 4f, 그림. 7b (왼쪽), 7c (왼쪽) 및 7g, 그림. 8일,에프보충 그림. 1e보충 그림. 4a,c보충 그림. 8c보충 그림. 9c)는 Bonferroni의 보정과 함께 양방향 반복 측정 ANOVA로 계산되었습니다. 세포주 실험을 위해 각 세포 집단의 일부를 다른 생물학적 복제물에 무작위로 할당했습니다. 면역염색 및 유세포 분석 데이터의 분석을 위해 무작위 필드 또는 무작위 세포 분획을 분석했습니다. 다른 종류의 실험은 무작위화되지 않았습니다. 데이터 수집 및 분석은 실험 조건에 대해 맹목적으로 수행되지 않았지만 데이터 분석은 동일한 매개 변수 및 소프트웨어로 수행되었습니다. 마우스 운동 행동의 분석은 맹인에서 수행되었습니다. 달리 명시되지 않는 한 데이터 표현 및 통계 분석은 R 소프트웨어(v. 4.0.0 및 v. 4.1.0) 및 PAST(v4.03)를 사용하여 수행되었습니다. 모든 막대, 오차 막대 및 박스 플롯은 그림 범례에 정의됩니다. 생물학적 복제 및 독립 실험의 수(둘 다 >2)는 그림 범례에 표시됩니다. 사용된 통계 테스트는 그림 범례에 표시되어 있습니다. 모든 qPCR 실험은 세 가지 기술적 복제로 수행되었습니다. 주요 실험 결과는 2명의 독립적인 운영자가 얻었습니다.

보고 요약

연구 설계에 대한 추가 정보는 Nature 포트폴리오 보고 요약 이 기사에 링크되어 있습니다.

• SEO 기반 콘텐츠 및 PR 배포. 오늘 증폭하십시오.
• PlatoData.Network 수직 생성 Ai. 자신에게 권한을 부여하십시오. 여기에서 액세스하십시오.
• PlatoAiStream. 웹3 인텔리전스. 지식 증폭. 여기에서 액세스하십시오.
• 플라톤ESG. 자동차 / EV, 탄소, 클린테크, 에너지, 환경, 태양광, 폐기물 관리. 여기에서 액세스하십시오.
• BlockOffsets. 환경 오프셋 소유권 현대화. 여기에서 액세스하십시오.
• 출처: https://www.nature.com/articles/s41467-023-39552-9