材料

2-エチル-1-ヘキサノール (98%、シグマ); 1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド HCl (Carbosynth); 1,6-ジアミノヘキサン (98%、シグマ); PEG-ビス-(N-スクシンイミジルスクシネート) (M_w = 2,000、シグマ); DyLight 405 NHS エステル (ThermoFisher); FITC NHS エステル (ThermoFisher); BSA (熱ショック画分、pH 7.0、≥98%; シグマ); からのストレプトアビジン ストレプトミセス・アビディニ （シグマ）; タマビジン 2-HOT、組換え体 (和光ケミカルズ); Dynabeads M-270 アミン (Invitrogen); Dynabeads MyOne カルボン酸 (Invitrogen); 1M塩化マグネシウム₂ (インビトロジェン); 1 M Tris pH 8.0 RNase フリー (Invitrogen); 5 M NaCl (Invitrogen); EvaGreen (ビオチウム); KAPA HiFi HotStart PCR キット (Roche); ミセルラ DNA エマルジョンおよび精製キット (EURx); イビディ蒸発防止オイル（イビディ）; 30% (19:1 モノマー:ビス) アクリルアミド溶液 (Bio-Rad); およびSYBR Gold（ThermoFisher）は受け取ったまま使用されました。 使用した他のすべての化学薬品はシグマから購入しました。 特に断りのない限り、酵素は New England Biolabs から購入しました。

BSA-NHの合成₂–PNIPAm ナノコンジュゲート

カチオン化BSA (BSA-NH₂）は、以前に報告された方法に従って合成されました³⁶. 典型的には、ジアミノヘキサンの溶液 (1.5 ml Milli-Q 水に 12.9 g、10 mmol) を 6.5 M HCl を使用して pH 5 に調整し、BSA (200 mg、3 ml Milli-Q 水に 10 μmol) の攪拌溶液に滴下して加えました。水）。 １００ｍｇの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミドＨＣｌを直ちに添加し、次いで５時間後にさらに５０ｍｇを添加することによりカップリング反応を開始した。 必要に応じて、pH 値を 100 に再調整し、溶液をさらに 1 時間攪拌し、遠心分離して沈殿物を除去しました。 上清をミリＱ水に対して一晩透析し（メディセル透析チューブ；分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）１２～１４ｋＤａ）、凍結乾燥した。

エンドキャップされたメルカプトチアゾリン活性化PNIPAm (M_n = 13,284 グラム·モル^-1、4mlのMilli-Q水に5mg）は、以前に報告された方法に従って合成されました¹ BSA-NH の撹拌溶液に添加₂ (pH 10 の 5 ml PBS バッファー中 8.0 mg)。 活性化されたPNIPAmの分子量と多分散性は、ゲル透過クロマトグラフィーを使用して決定されました（補足図. 20）。 溶液を１０時間撹拌し、次いで遠心フィルター（ミリポア、アミコンウルトラ；ＭＷＣＯ、５０ｋＤＡ）を使用して精製し、凍結乾燥した。 凍結乾燥後、得られたBSA-NH₂–PNIPAmコンジュゲートは、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化–質量分析およびゼータ電位差測定によって特徴付けられました（補足図. 20).

FITC および DyLight-405 標識 BSA-NH₂-PNIPAm コンジュゲートは、標識 BSA を出発物質として使用したことを除いて、同じ方法を使用して調製しました。

蛍光色素によるBSAの標識

ＢＳＡは、以下のようにＦＩＴＣで標識した：２００ｍｇのＢＳＡを１０ｍｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）に溶解した。 次いで、２．３６ｍｇのＦＩＴＣを５９０μｌのＤＭＳＯに溶解し、攪拌したＢＳＡ溶液に添加した。 得られた溶液を200時間撹拌し、Milli-Q水に対して一晩透析(Medicell透析チューブ; MWCO、10～50kDa)することにより精製し、凍結乾燥した。 ＢＳＡは、以下のようにＤｙＬｉｇｈｔ ４０５で標識した：３０ｍｇのＢＳＡを６ｍｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）に溶解した。 次いで、１ｍｇのＤｙＬｉｇｈｔ ４０５ ＮＨＳエステルを１００μｌのＤＭＦに溶解し、攪拌したＢＳＡ溶液に添加した。 溶液を２時間撹拌し、ミリＱ水に対して一晩透析（メディセル透析チューブ；ＭＷＣＯ、１２～１４ｋＤａ）することにより精製し、凍結乾燥した。 紫外可視分光測光法を使用して、タンパク質あたりの色素の平均数を決定しました。 DyLight 9 標識については、BSA 分子あたり平均 2.36 の色素を測定しました。 FITC 標識では、BSA 分子あたり 590 の色素を測定しました。

タマビジン 2-HOT 含有プロティノソームの準備

タマビジン 2-HOT および磁性粒子 (Dynabeads M-270 アミン) を含むプロテオソームは、前と同様に調製されました。³⁷ ストレプトアビジン含有プロテイノソームの説明。 実験に使用したプロテオソーム（図. 1c–e) には磁性粒子が含まれていませんでした。 BSA–PNIPAm ナノコンジュゲート (6 mg ml^-1 合計、1 mg ml^-1 そのうち蛍光標識されたもの）を4 µMタマビジン2-HOTおよび4 mg ml と混合しました^-1 7.5 µl の水相に含まれるダイナビーズ。 0.6 mg の PEG-bis(N-スクシンイミジルスクシネート) (M_w = 2,000) を 7.5 μl の 50 mM 炭酸ナトリウム緩衝液 (pH 9) に溶解し、混合物に加え、短時間ボルテックスしました。 次に、300 μl の 2-エチル-1-ヘキサノールを添加し、続いてボルテックスしてピッカリング エマルジョンを得ました。 得られた混合物を室温で2時間放置して、ナノコンジュゲートを架橋した。 上部の油層をピペッティングで除去して油相を除去し、300 μl の 70% エタノールを加えて沈殿物を再懸濁しました。 次に、分散液を 12% および 14% エタノールに対してそれぞれ 70 時間、最後に一晩、Milli-Q 水に対して連続的に透析 (Medicell 透析チューブ; MWCO、50-2 kDa) して、水中のプロテオソームを得ました。 その後、プロティノソームを後で使用するために4°Cで保存しました。

DNAオリゴヌクレオチド合成

Twist Bioscience の DNA エンコード ファイルを除き、すべての DNA オリゴヌクレオチドは Integrated DNA Technologies から購入しました。 高速液体クロマトグラフィーで精製された修飾オリゴヌクレオチドを購入し、脱塩された非修飾オリゴヌクレオチドを購入した。 ストック溶液（100および10μM）は、ヌクレアーゼフリーのTEバッファー（10 mM Tris、0.1 mM EDTA、pH 7.5; Integrated DNA Technologies）を使用して作成し、-30°Cで保存しました。 ファイルの DNA エンコーディングは Twist Bioscience に注文しました。 これらのファイルは、20 ng の DNA プール、1 µM のフォワードおよびリバース プライマー、KAPA HiFi HotStart ポリメラーゼを含む 0.5 µl の反応液で個別に PCR 増幅されました。 増幅プロトコルは次のとおりです。95°Cで3分間変性、98°Cで20秒間変性、65°Cで15秒間アニーリング、72°Cで15秒間伸長。 8 番目の変性、アニーリング、および伸長のステップを 10 ～ 72 回繰り返した後、最終伸長を 30 °C で 4 秒間行った後、10 °C まで冷却しました。 得られたアンプリコンは、Qiagen PCR 抽出キットを使用して、製造元の指示に従って精製されました。 この方法で得られたファイルは、XNUMX ng で等比率で混合され、室温でシアトルからアイントホーフェンに出荷されました。 次に、Integrated DNA Technologies から注文した ssDNA オリゴヌクレオチドと同様に、これらのテンプレートを使用しました。

フルオロフォアのビオチンを使用した dsDNA の準備

100 nt よりも短い鎖からなる二本鎖複合体は、熱アニーリングによって形成されました。 ビオチン化ストランドを非ビオチン化ストランドと 12 および 10 μM で混合し、サーモサイクラーで 95 °C に 3 分間加熱しました。 その後、サンプルを-0.5°C min の速度で室温まで冷却しました^-1.

ここでは、100 bp を超える dsDNA 鎖を、蛍光修飾および/またはビオチン修飾を行い、一本鎖ウルトラマー テンプレートまたは dsDNA ファイルおよび PCR を使用して修飾されたプライマーから調製しました。 通常、反応は、100 μl (5 nM) 希釈テンプレート、プライマー (各 1 μM)、および KAPA HiFi HotStart ポリメラーゼを使用して 0.5 μl スケールで実行されました。 増幅プロトコルは次のとおりです。95°Cで3分間変性、98°Cで20秒間変性、65°Cで15秒間アニーリング、72°Cで15秒間伸長。 16 番目の変性、アニーリング、および伸長のステップを 72 回繰り返し、続いて 30 °C で 4 秒間の最終伸長を行った後、XNUMX °C まで冷却しました。 得られたアンプリコンは、Qiagen PCR 抽出キットを使用して、製造元の指示に従って精製されました。

プロティノソームにおける DNA の局在化

ビオチン標識 DNA は、10.0 mM MgCl を含む 8.0 mM Tris (pH 11.5) で最初にローカライズされました。₂ 通常、0.1 μl のプロティノソーム含有溶液を 20 μl の 10 × バッファー溶液と 5 μl の DNA に添加して、局在化させました。 混合物を一晩４℃に保った。 翌日、4 mM Tris (pH 5)、4 M NaCl、500 mM MgCl からなる洗浄バッファー 10.0 μl₂ 0.1% vol/vol Tween 20 を加え、4 °C で一晩放置し、翌日除去しました。 二次洗浄ステップは、一晩ステップを使用しなかったことを除いて、最初のステップと同様に実行されました。 代わりに、混合物を磁気分離ラック（DynaMag、Invitrogen）に3分間置くことにより、溶液からプロテオソームを分離し、その後ピペットで上清を除去しました。

ローカリゼーションの初期安定性テスト

ローカライズされた DNA を含むプロティノソームは、少なくとも 95 分間、MiniPCR サーモサイクラーを使用して 10 μl の溶液で 5 °C に加熱されました。 室温まで冷却した後、2 μl の液滴をガラス製の顕微鏡用カバースリップに置き、共焦点顕微鏡写真を撮影しました。

温度依存蛍光顕微鏡

蛍光データは、固体レーザー (DyLight 8 の場合は 405 nm、Alexa 405 の場合は 552 nm、Cy546 の場合は 638 nm) と光子計数モードのハイブリッド検出器を備えた共焦点レーザー走査型顕微鏡 (Leica SP5) を使用して取得しました。 タイムラプス測定は、×10 / 0.40の開口数（視野、1.55×1.55 mm²; スライス厚、7 μm) 512 × 512 ピクセルの解像度で。 高温共焦点レーザー走査顕微鏡データは、SmS-r基板を備えたVAHEATマイクロ加熱システム（Interherence）を使用して取得されました。 50 µl の DNA をロードしたプロティノソーム溶液をサンプルセルにピペットで移し、蒸発を防ぐために 150 µl の ibidi 蒸発防止オイルで覆いました。 室温拡散実験は以前に行われました³⁷ 説明マイクロ流体トラッピング アレイ。 データ処理は、以前に説明したものと同様のカスタム Python コードを使用して行われました³⁷.

統計

統計値を報告するすべての結果は、独立した 3.6.5 通から得られました。 分析は、Python の SciPy (Python 1.1.0、SciPy バージョン XNUMX) ライブラリを使用して実行されました。 ウェルチの両面 t-test は、XNUMX つの母集団を比較するために使用されました。 XNUMX つ以上のサンプル間の統計的有意性は、一元配置分散分析を使用して決定した後、Tukey の多重比較検定を使用した事後分析を行いました。 の値のみ p < 0.05 は統計的に有意であると見なされました。

SDA

プロテインソームに局在する DNA の SDA は、別の研究から適応したプロトコルを使用して実行されました。⁴⁶. 反応混合物は、1 × NEB バッファー 2、0.5 μM プライマー、各 250.0 μM dNTP、0.125 U μl で構成されていました。^-1 Klenow Fragment (Exo-)、0.250 U µl^-1 Nt.BspQI、0.2 mg ml^-1 BSA、4 μM T4 遺伝子 32 タンパク質、および 1 × EvaGreen。 反応量は 25 μl で、そのうち 2 μl はバッファー (10.0 mM MgCl を含む 11.5 mM Tris₂ および 0.1% vol/vol Tween 20)。 反応を37℃に保ち、CFX96 TouchリアルタイムPCR検出システム（Bio-Rad）を使用して記録しました。 蒸発を防ぐために、プレートは透明なステッカーで密封されていました。 生成速度は、線形関数を蛍光強度とサイクル数に適合させることにより、Python を使用して決定されました。

qPCR

qPCRは、CFX96 TouchリアルタイムPCR検出システム（Bio-Rad）を使用して実行されました。 総反応量は 25 µl で、KAPA HiFi HotStart、0.5 µM プライマー、1 × EvaGreen、および 2 µl のテンプレート溶液 (DNA またはプロティノソーム) で構成されていました。 最初の変性は 3 °C で 95 分間に設定し、次に 40 °C で 98 秒間の変性サイクルを 20 回、65 °C で 15 秒間のアニーリング、72 °C で 15 秒間の伸長を行い、最後に72 ° C に冷却する前に、30 ° C で 4 秒間延長します。 各アニーリング工程中に蛍光を測定した。 蒸発を防ぐために、プレートは透明なプレートシーラーで密封されました。 CFX Maestro ソフトウェア バージョン 3.1.1517.0823 (Bio-Rad) を使用して、ベースライン補正を実行し、閾値サイクルを計算しました (C_t).

PAGEゲル分析を用いたキメラ形成の決定

総反応量は 25 µl で、KAPA HiFi HotStart、0.5 µM プライマー、および 2.5 µl のプロティノソーム溶液で構成されていました。 サーモサイクリングは、T1000 Touch サーモサイクラー (Bio-Rad) で実行されました。 3 °C で 95 分間の初期変性に続いて、20 °C で 98 秒間の変性、20 °C で 65 秒間のアニーリング、15 °C で 72 秒間の伸長を 15 サイクル行い、続いて 72 で最終伸長を行いました。 30 ° C に冷却する前に 4 秒間 ° C。 PCR 混合物に、5% TB-Mg PAGE ゲルに 6 μl をロードする前に、12 μl の 10x ローディング色素 (ThermoFisher) を添加しました。 ゲルは、30% (19:1 モノマー:ビス) アクリルアミド溶液を使用してキャストされました。 ランニングバッファーとゲルバッファーは、44.5 mM Tris、44.5 mM ホウ酸、および 11.5 mM MgCl でした。₂. Criterion垂直細胞電気泳動装置（Bio-Rad）でゲルを1 Vで15時間150分間泳動し、SYBR Gold（ThermoFisher）を使用して10〜15分間染色しました。 ImageQuant 400 Digital Imager (GE Healthcare) を使用して画像を撮影しました。 ImageJ のゲル解析プラグインを使用して、対象バンドの画像強度を決定しました。 一部のゲルでは、ゲルの上部にシグナルが観察されます。これは、未精製の反応混合物に存在するより大きな複合体 (ポリメラーゼ-DNA 複合体など) に起因すると考えられます。 これらのシグナルは分析では考慮されませんでした。 統計分析は、Python を使用して実行されました。

エマルジョンPCR

ライブラリーのエマルジョン PCR は、Micellula DNA エマルジョンおよび精製キットを使用して実行されました。 50 μl KAPA HiFi HotStart 25X、2 ng テンプレート DNA、50 μM プライマー (ペアあたり 4 μM) および 0.16 mg ml を含む 1.25 μl 反応混合物^-1 BSA を使用した。 エマルジョンは、製造元の指示に従って、300 μl の事前に混合された無機相を添加し、4 °C の冷蔵庫内で最大速度で 5 分間ボルテックスすることによって形成されました。 得られたエマルションを 3 つのチューブに分割し、次のようにサーモサイクルを行いました。95 °C で 18 分間の初期変性、95 °C で 20 秒間の変性を 65 サイクル、15 °C で 72 秒間のアニーリング、15 °C での伸長72 秒を実行した後、30 °C で 4 秒の最終伸長を行った後、XNUMX °C に冷却しました。 反応物をプールし、エマルジョンを破壊し、製造元の指示に従ってDNAを精製した。

精製された DNA の個々 のファイルの相対濃度は、qPCR を使用して定量化されました。

マルチプレックス PCR 濃度の定量化

プロテインソームの混合プール内またはバルクに局在するDNAは、25μlのテンプレートDNAとプライマー（各フォワードおよびリバースペアの2μM;補足表）からなる0.4μlの反応で増幅されました 4 KAPA HiFi HotStartポリメラーゼを使用してプライマー配列をリストします。 サーモサイクルは、C1000 Touch サーモサイクラー (Bio-Rad) で実行されました。 3 °C で 95 分間の初期変性に続いて、18 °C で 98 秒間の変性を 20 サイクル、65 °C で 15 秒間のアニーリング、72 °C で 15 秒間の伸長を行い、続いて 72 での最終伸長を行いました。 30 ° C に冷却する前に 4 秒間 ° C。 反応混合物は、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ抽出キットを製造元の指示に従って使用して精製した。

精製された DNA の個々 のファイルの相対濃度は、qPCR を使用して定量化されました。

ライブラリの準備とシーケンス

マルチプレックス PCR 反応は、アイントホーフェン工科大学で実施され、室温でワシントン大学に発送されました。 受領時に、サンプルは Implen ナノフォトメーターを使用して検証されました。 その後、Illumina TruSeq Nano DNA Library Prep プロトコルに従ってシーケンス用にサンプルを調製しました。 末端をEnd Repair buffer (ERP2)で平滑化し、Beckman Coulter AMPure XPビーズで精製しました。 「A」ヌクレオチドは、A テーリング リガーゼで 3' 末端にアニーリングされました。 ライゲーションは、イルミナの TruSeq DNA CD インデックス キットのイルミナ シーケンス アダプターを使用して実行され、各サンプルは固有のイルミナ インデックスにライゲーションされました。 最後に、イルミナのサンプル精製ビーズを使用してサンプルを洗浄し、12 サイクルの PCR を使用して濃縮しました。 最終産物の長さと純度は、QIAxcel Bioanalyser を使用して認定されました。 次に、qPCR を使用してサンプルを個別に定量化し、混合して等質量ライブラリを作成しました。

最終ライブラリーは、Illumina NextSeq Denature and Dilute Libraries Guide に従ってシーケンス用に準備されました。 シーケンシング ライブラリは、連結された PhiX ゲノムの 1.3% のコントロール スパイクを含む 20 pM で Illumina NextSeq にロードされました。

イルミナのシーケンスデータの分析

シーケンスされたサンプルのベースコーリングと逆多重化は、bcl2fastq を使用して実行されました。 次に、生成された FASTQ ファイルは、Burrows–Wheeler Aligner を使用して参照配列に対して整列されました⁵⁹. 次に、SAMtools を使用して各シーケンスのカバレッジを決定しました。⁶⁰.

一括での反復アクセス PCR

0.5 つのファイルを等モル比で混合し、最終濃度を 100 nM にしました。 KAPA HiFi HotStart ポリメラーゼを使用して、5 μl のテンプレート ミックスとプライマー (0.5 μM) からなる 3 μl の反応液で 95 つのアリコートを増幅しました。 PCR サイクリング プロトコルは、10 °C で 98 分間の初期変性、20 °C で 65 秒間の 15 サイクルの変性、72 °C で 15 秒間のアニーリング、72 °C で 30 秒間の伸長、その後の最終伸長で構成されていました。 4 ° C に冷却する前に 5 ° C で 5 秒間。 Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit (NEB) を使用してプライマーと dNTP を不活化した 95 μl のアリコートを採取しました。 得られた混合物のうち、30μlを鋳型として次のPCRに使用した。 PCR 反応液の残りの XNUMX µl は、-XNUMX °C で保存しました。

エマルジョン PCR を使用した繰り返しアクセス

50 つのファイルを等モル比で混合し、Micellula DNA エマルジョンおよび精製キットを使用してライブラリーのエマルジョン PCR を実行しました。 25 μl KAPA HiFi HotStart 2X、50 ng テンプレート DNA、0.5 μM プライマーおよび 1.25 mg ml を含む XNUMX μl 反応混合物^-1 BSA。 エマルジョンは、製造元の指示に従って、300 μl の事前に混合された無機相を添加し、4 °C の冷蔵庫内で最大速度で 5 分間ボルテックスすることによって形成されました。 得られたエマルションを 3 つのチューブに分割し、次のようにサーモサイクルを行いました。95 °C で 10 分間の初期変性、95 °C で 20 秒間の変性を 65 サイクル、15 °C で 72 秒間のアニーリング、15 °C での伸長72 秒を実行し、続いて 30 °C で 4 秒の最終伸長を行った後、1 °C に冷却しました。 反応物をプールし、エマルジョンを破壊し、製造元の指示に従ってDNAを精製した。 この精製反応から、XNUMXμlを次の反応に使用した。

アクセスを 25 回繰り返した後、バルク PCR を使用して最終的に精製された混合物を増幅し、シーケンス実験に十分な量の DNA を生成しました。 この増幅のプロトコールでは、総反応量 0.5 µl を使用し、KAPA HiFi HotStart、2 µM プライマー、および 1000 µl の精製反応混合物で構成されていました。 サーモサイクリングは、T3 Touch サーモサイクラー (Bio-Rad) で実行されました。 95 °C で 20 分間の初期変性に続いて、98 °C で 20 秒間の変性、65 °C で 15 秒間のアニーリング、72 °C で 15 秒間の伸長を 72 サイクル行い、続いて 30 で最終伸長を行いました。 4 ° C に冷却する前に XNUMX 秒間 ° C。 次いで、反応混合物を、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ抽出キットを製造業者の指示に従って使用して精製した。

プロティノソームにおける反復アクセス PCR

100 つのファイルが個々のプロテイノソーム集団にローカライズされ、5 回洗浄され、混合されて最終的なプールが作成されました。 KAPA HiFi HotStart ポリメラーゼを使用して、0.5 μl のプロテノソーム ライブラリーとプライマー (3 μM) からなる 95 μl 反応で 10 つのアリコートを増幅しました。 PCR サイクリング プロトコルは、98 °C で 20 分間の初期変性、65 °C で 15 秒間の 72 サイクルの変性、15 °C で 72 秒間のアニーリング、30 °C で 4 秒間の伸長、その後の最終伸長で構成されていました。 3 ° C に冷却する前に 95 ° C で 30 秒間。 次いで、反応混合物を磁気分離ラック（ＤｙｎａＭａｇ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に３分間置いて、プロテイノソームを回収した。 次に、5 µl の反応混合物をピペットで取り、-100 °C で保存しました。 残りの 10.0 µl を 8.0 µl の洗浄バッファー (1 mM Tris (pH 11.5)、XNUMX M NaCl、XNUMX mM MgCl₂ および 0.1% vol/vol Tween 20)。 プロテインソームの磁気回収後、新しい反応混合物を洗浄した 5 µl のプロテインソーム溶液に加えて、最終容量を 100 µl にしました。

タマビジン 2-HOT を含むプロティノソームの並べ替えの準備

使用されるノズルに必要なサイズが小さいこと、および通常使用される磁性粒子からの干渉のために、選別実験で使用されるプロテイノソームは、わずかに変更されたプロトコルに従って調製されました。 タマビジン 2-HOT および磁性粒子 (Dynabeads MyOne カルボン酸) を含むプロテイノソームは、上記と同様の方法を使用して調製されました。 BSA–PNIPAm ナノコンジュゲート (6.00 mg ml^-1 合計、1.00 mg ml^-1 そのうち蛍光標識されたもの）を4 µMタマビジン2-HOTおよび0.75 mg ml と混合しました^-1 合計 20 µl の水相中のダイナビーズ。 次に、0.6 mg の PEG-bis(N-スクシンイミジルスクシネート) (M_w = 2,000) を 40 μl の 50 mM 炭酸ナトリウム緩衝液 (pH 9) に溶解し、混合物に加えて短時間ボルテックスしました。 次に、1mlの2-エチル-1-ヘキサノールを添加し、続いて混合物を30分間ボルテックスして、ピカリングエマルジョンを得た。 得られた混合物を室温で1.5時間放置して、ナノコンジュゲートを架橋した。 上部の油層をピペットで除去することにより油相を除去し、500 μl の 70% エタノールを添加して沈殿物を再懸濁しました。 次に、分散液を 12% および 14% エタノールに対してそれぞれ 70 時間、最後に一晩、Milli-Q 水に対して連続的に透析 (Medicell 透析チューブ; MWCO、50-2 kDa) し、30 µm CellTrics を使用してろ過する前に、水中のプロテオソームを得ました。セルストレーナー（シスメックス）。 共焦点顕微鏡を使用して、これらのプロテイノソームのサイズの縮小を確認しました。その結果は、補足図に示されています。 2. その後、プロティノソームを後で使用するために4°Cで保存しました。

蛍光支援ソーティング

低中圧で動作する FACS Aria III フローサイトメーター (BD Biosciences) を使用して、100 μm ノズルを介してプロテイノソームの混合物を調査しました。 DyLight-405 および FITC で標識されたプロティノソームを FACS 用に調製し、DNA にエンコードされたファイルをプロティノソームで一晩ローカライズしました。 その後、これらのプロテイノソームを 500 µl の洗浄バッファー (10.0 mM Tris (pH 8.0)、1 M NaCl、11.5 mM MgCl₂ および 0.1% vol/vol Tween 20) を 4 °C で一晩保存します。 翌日、500 μl の上清を除去し、蛍光バーコード DNA (ビオチンおよび Cy5 または Cy3 のいずれかで標識) をプロティノソームに添加し、室温で 15 分間ローカライズさせました。 バーコードの位置を特定した後、500 μl の洗浄バッファーを加えてプロティノソームをさらに 1,000 回洗浄した後、磁気分離し、上清を除去しました。 プロティノソーム集団は、選別の直前に混合されました。 合計 2,000 ～ 488 のイベントが記録され、そこから前方散乱光の高さ (FSC-H) と前方散乱光の面積 (FSC-A) の 530 次元プロットが得られました。 FITC 蛍光は、30 nm レーザーと 405/405 nm 検出器を使用して調査されました。 Dylight 460 は 55 nm で励起され、5/633 nm で検出されました。 Cy660 (ex, 20;​​ em, 3/561)。 Cy582 (ex, 15; em, 405/3)。 ゲーティングは、BD FACSDiva ソフトウェア (BD Biosciences) を使用して実行され、FSC-H 対 FSC-A プロットでの最初のゲーティングで構成され、バックグラウンドおよび取り込まれていない磁気ビーズに対してプロテイノソームを選択しました。 この最初のゲートから、高 FITC および高 DyLight 5 ゲートを定義し、その後、それぞれが高 CyXNUMX および高 CyXNUMX ゲートに分割されました。 これらは、プロティノソームをソートするために使用される最終ゲートでした。 補足図 16 詳細なゲーティング戦略を示しています。 選別は BSA でコーティングされたチューブで行い、選別された集団は、選別せずに BD Aria III フローサイトメーターを使用して再分析しました。 最終的なグラフは、R の flowCore および flowViz パッケージを使用してプロットされました。

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• 情報源： https://www.nature.com/articles/s41565-023-01377-4