初代ニューロン培養の準備

動物組織の採取を伴う実験プロトコルは、動物福祉に関するスイス連邦法に従ってバーゼルシュタット州獣医局によって承認され、承認されたガイドラインに従って実施されました。 HD-MEA チップまたはカバーガラスを 70% エタノールで 60 分間滅菌し、層流気流下で滅菌脱イオン水で洗浄しました。次に、電極アレイまたはカバースリップを、ホウ酸緩衝液 (Thermo Fisher Scientific) 中の 10% (v/v) ポリ(エチレンイミン) (Sigma-Aldrich) 0.05 μl で室温で 40 分間処理し、脱イオン水で洗浄しました。 8 mg ml 0.02 μl とのインキュベーションによる^-1 ラミニン (Sigma-Aldrich) を神経基礎 (NB) 培地 (Gibco) 中で 30 °C で 37 分間培養します。 E-18 Wistar ラット胚を氷冷 HBSS (Gibco) 中で解剖して皮質を採取し、0.25% トリプシン-EDTA (Gibco) 中で解離させました。解離した皮質細胞を穏やかに粉砕し、0.45 μm の篩で濾過して単一細胞を得ました。細胞密度を推定し、10 個の細胞のうち 3,000 μl を μl^-1 溶液を電極アレイ上にメッキした。 37 mlのNBプレーティング培地を添加する前に、チップを40℃で2分間インキュベートすることにより、細胞をアレイに付着させた。 ＮＢプレーティング培地は、５０ｍｌのウマ血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１．２５ｍｌのｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０ｍｌのＢ－２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４５０ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ）に添加することによって調製した。 HD-MEA チップは、50 °C、1.25% CO の細胞培養インキュベーター内に保管されました。₂。 ３日後、３日ごとに培地の５０％を新鮮なＮＢ平板培地と交換することにより、細胞を無血清ＮＢ平板培地中でＤＩＶ２０まで培養した。図に示すデータを除くすべての実験。 1i、細胞は増殖中に異なる機械的特性を示したため、DIV 14 と 16 の間で実施されました。¹¹。図に示したデータに対する実験は次のとおりです。 1i は、ニューロンネットワークが同期バースト活動を示した DIV 22 と 24 の間に収集されました。

小脳スライスの準備

野生型マウス (生後 14 日目の C57BL/6Rj、Janvier Labs) をイソフルラン麻酔下で断頭しました。彼らの脳は摘出され、氷冷したカーボゲンの泡（95％OXNUMX）の中に浸漬された。₂ + 5% CO₂）人工脳脊髄液（aCSF）溶液。小脳の矢状スライス 〜ビブラトーム (VT350S、Leica) を使用して 1200 μm を得ました。すべてのスライスは、使用するまで aCSF 中で室温に維持されました。 aCSF は 125 mM NaCl、2.5 mM KCl、2 mM CaCl で構成されていました。₂1 mM MgCl₂、25 mM グルコース、1.25 mM NaH₂PO₄ および 25 mM NaHCO₃。次に、HD-MEA チップの電極アレイを、ホウ酸緩衝液 (Thermo Fisher Scientific) 中の 10% (v/v) ポリ(エチレンイミン) (Sigma-Aldrich) 0.05 μl で室温で 40 分間処理し、脱イオン水で洗浄しました。水、続いて 8 mg ml 0.02 μl とインキュベート^-1 ラミニン (Sigma-Aldrich) を Neurobasal 培地 (Gibco) 中で 30 °C で 37 分間培養します。インキュベーション後の過剰なラミニンをピペットで取り除き、アレイを乾燥させた。次に、ピペッティング中のせん断力によって引き起こされる損傷を避けるために、カットされたピペットチップを使用して、小脳スライスを電極アレイ上にそっと配置しました（補足図）。 13）。 ２ｍｍの特注ハープを組織切片上に置き、組織切片を固定した。次いで、組織切片を、一滴ずつ穏やかに加えることによってａＣＳＦに浸漬した。次いで、ａＣＳＦに浸漬された固定化された組織切片を電極アレイに３０分間付着させた。録音直前にハープを取り外し、AFM ヘッドを HD-MEA チップに取り付けました。細胞の生存率と活性を維持するために、組織にカーボゲンで泡立てた aCSF を継続的に灌流しました。

HD-MEAのセットアップ

26,400 × 17.5 mm の全体検知領域内に 3.85 個の電極 (2.10 μm ピッチ) を備えた相補型金属酸化物半導体 (CMOS) ベースの HD-MEA チップ² に使われていた²⁵。チップは商業鋳造工場で製造され、社内で後処理およびパッケージ化されました（補足図）。 1b）。直径 4 cm の透明なポリカーボネート リング (GB Plex) をチップ上に接着し、ワイヤ ボンドを生体適合性のダーク エポキシ (EPO-TEK 353 ND) でカプセル化しました。電極のプラチナブラックコーティングは、電極のインピーダンスを低下させ、信号対雑音特性を改善するために電着されました（補足図）。 1c）。当社のカスタム開発された HD-MEA システムの商用バージョンは、MaxWell Biosystems から購入できます (MaxOne モデル)。

サンプルホルダーとステージヒーター

閉ループフィードバック用の温度プローブを備えた熱電ペルチェベースのサンプルヒーターは、サンプルを 37 °C に維持するために自作の温度コントローラーによって制御されました。サンプルヒーターは、HD-MEA チップ上の熱伝導パッドと位置合わせされました。次に、チップをサンプルホルダーに取り付け、ホルダーのバネ仕掛けのピンで所定の位置にロックしました。 Prusa I3 MK3S+ を使用して、サンプル ホルダーに取り付けられた灌流セットアップ用の質素なシリンジ ホルダーを 3D プリントしました。セットアップ全体はカスタムメイドに取り付けられました x,y ベースプレートを介してピエゾステージに接続します。

x,y ピエゾステージ

エンコーダー分解能が1 nmの5つのリニアピエゾステージ（Xeryon XLS-XNUMXシリーズ）が互いに垂直に取り付けられました（補足図）。 1a）。リニア ステージは、LabVIEW ベースのユーザー インターフェイスに接続された Xeryon XD-M 多軸コントローラによって制御されました。 HD-MEA チップの左上の電極を座標系の原点として登録し、対象のニューロンとの電極座標を MaxWell Biosystems ユーザー インターフェイスから抽出しました。これらの座標はカスタム スクリプトを使用して XD-M コントローラーに供給され、AFM カンチレバーの下にニューロンを簡単に配置できました。

長作動距離蛍光顕微鏡

25 倍の調整可能なズームレンズと 15.75 倍の対物レンズ (Nikon、MNH1 P55100-SHR PlanApo 2X、開口数、1) を備えた光学顕微鏡 (Nikon SMZ 0.156) を、本文で述べたセットアップと調整しました。 TTL 制御可能な発光ダイオード (LED) イルミネーター (CoolLED PE 300)^ウルトラ）を励起/発光フィルターフリーのイメージング用の光源として使用しました。トリプルバンドパスビームスプリッター (F66-412、AHF Analysentechnik) を使用して、HD-MEA チップからの反射励起光をフィルターしました。 2×4,908画素（画素サイズ3,264×7.3μm）の大型CMOSアレイカメラ（Nikon DS-QI7.3）²）は、2.5× f マウントのプロジェクター レンズを使用して顕微鏡に取り付けられ、最終倍率で最大 45 fps のサンプリングが可能になりました。 〜40倍、ピクセルあたり0.46μmの解像度。

AFM

本文で述べたように、AFM ヘッド (Catalyst、Bruker) が取り付けられ、セットアップと位置合わせされました。ヘッド上の 15 μm ピエゾ スキャナーを使用してすべての力 - 変位および力 - 時間曲線を収集し、150 μm ピエゾ スキャナーを使用してカンチレバーをニューロン上に配置しました。データは、AFM ソフトウェア (Nanscope v.9.2、Bruker) を使用して収集され、.txt ファイルにエクスポートされました。データは Python スクリプトで分析され、プロットされました。直径5μmのシリカビーズ(Kisker Biotech)を、紫外線接着剤(Dymax)を使用してチップレスマイクロカンチレバー(CSC-37または38、Micromash HQ)の自由端に接着し、20分間紫外線硬化させた。ビーズ付きカンチレバーをプラズマ クリーナー (Harrick Plasma) を使用して 5 分間洗浄し、その後 2 mm のサファイア ウィンドウを備えた流体プローブ ホルダーに取り付け、熱雑音法を使用して校正しました。⁴⁸.

相関AFM、HD-MEAおよび光学顕微鏡検査

AFM、HD-MEA、光学顕微鏡は図のように配置されました。 1a）。 HD-MEA チップ上のニューロンからの蛍光は、AFM カンチレバー ホルダーのサファイア窓を通して収集され、光学顕微鏡に送られました。 HD-MEAチップ上のニューロンの蛍光画像は、関心のある領域で順次収集され、ステッチされてMaxwell MEAユーザーインターフェイスに登録され、HD-MEAチップ上のニューロンの位置を特定しました（補足図）。 2a–d）。 ザ x,y 次に、関心のあるニューロンの座標が x,y LabVIEW スクリプトを介してステージングし、AFM カンチレバーを希望の位置に配置します。 〜5nmの精度。機械的騒音と熱ドリフトを低減するために、セットアップ全体は減衰絶縁テーブル上に設置され、騒音から保護された温度制御されたチャンバー内に配置されました。

TTL同期

DS-Qi2 からの TTL パルスは、3.5 インチ 24 極ピン、片側にミニプラグ、もう一方の側にメス 255 AWG ジャンパ (RND 00015-1、Distrelec) を備えた自作コネクタを使用して抽出されました。ピン 4 はグランドで、ピン 2.4 (EXP_TMG) は、設定された露光時間に従って、ライブ動作時に HI (ハイ) レベルで 0 V を受け取りました。 5 ～ 1 V の負のパルスが、片側に標準 BNC 雄ピンと雌の 24 AWG ジャンパ (RND 255) を備えた自作コネクタを介して、AFM コン​​トローラ (Bruker Nanoscope V) のフロント パネル出力チャンネル 00015 から抽出されました。 -2、ディストレレック) 反対側。カメラと AFM の両方から抽出された信号は、単一の高速フォトカプラのピン 8 と 20 に配線されました。次に、信号はフィールド プログラマブル ゲート アレイを介して HD-MEA データ収集システムに送信され、XNUMX kHz で収集された HD-MEA データの生ファイル記録に AFM と光学顕微鏡によって検出されたイベントの正確なタイムスタンプが提供されます。

剛性追跡プロトコルと測定値

見かけのヤング率は、神経細胞体で収集された 30 つの力 - 変位曲線の平均から計算されました。次に、ニューロンに測定による機械的変化がないことを確認するために XNUMX 秒待って、XNUMX つの力 - 変位曲線を再度収集しました (図 XNUMX)。 2a）、これを 1 つの測定サイクルとしてラベル付けし、1 つのドットで表します（図 2）。 2b）。この測定サイクルを 5 つのニューロンで最大 XNUMX 分間繰り返し、ネットワーク内の次のニューロンに移動しました。最初のニューロンでの最初の測定から XNUMX 分後、同じニューロンに戻り、測定サイクルが繰り返されました。測定は、長期の時間スケールの追跡サイクルで構成されていました。この長時間スケールの追跡サイクルは XNUMX 回繰り返されました (図 XNUMX)。 2c）。神経突起の剛性測定では、まずニューロンの電気生理学的活動を 5 分間記録し、次にニューロンごとに 38 つの十分に分離された神経突起を特定し、それらの力 - 変位曲線を収集しました。力 - 変位曲線は、CSC-XNUMX マイクロカンチレバー (公称バネ定数、 〜0.02N・m^-1）上記のように直径 5 μm のビーズを特徴とします。体細胞には700 pN、神経突起には400 pNの最大力を使用して、力-距離曲線を収集しました（補足図。 14a、b）。すべての測定において、先端速度は 10 µm s で一定に保たれました。^-1。接触点は、アプローチ力 - 変位曲線から次のように決定されました。 x ベースライン ノイズの標準偏差の 5 倍高い力の値でインターセプトし、その後手動でキュレーションします。押し込み深さは、カンチレバーのたわみを差し引き、力-変位曲線の最大力での変位値をゼロに設定した後の接触点での変位値として計算されました（補足図）。 14c）。同じ最大の力に対する押し込みの深さは、その剛性に応じて体細胞ごとに異なります。したがって、押し込み深さのカットオフを 750 nm に設定しました。力 - 変位曲線では、対応する変位値が押し込み深さのカットオフを超えたすべての力の値が破棄されました。見かけのヤング率は、弾性半空間を持つ球形圧子のヘルツモデルが適用される曲線から計算されました。⁴⁹ Python のカスタム コードを使用して適合されました。

私たちの研究でニューロンの体細胞について測定されたヤング率の値は、以前の報告と同等の範囲にあります。^10,11。ただし、神経突起のヤング率は報告されている値よりも低いものの、依然として同程度の大きさです。この偏りは、ニューロンの最も太い 5 つの基底神経突起 (通常は柔らかい) を測定するという選択に起因する可能性があります。バーストおよび IBI 中の神経細胞体の硬さを測定するために、XNUMX Hz の周波数で力 - 変位曲線を収集しました。このプロセスを各体細胞に対して数回繰り返し、破裂期および IBI 中の体細胞の平均硬さを計算しました。通常、バーストはリズミカルなパターンで現れます (図 XNUMX)。 2h)、単一のニューロンがバーストするとき、培養ニューロンについて予測することは困難です。バースト期間または IBI 中に少なくとも 5 つの力 - 変位曲線を収集するために、プローブがニューロンに接触する回数を最小限に抑えながら、ニューロンを XNUMX 回インデントしました。^-1.

静的圧縮プロトコル

チップレス AFM マイクロカンチレバー (CSC-5、公称バネ定数、 〜0.8N・m^-1）、体細胞の上に位置しました。 0.1 kPa または 5 kPa を加えるのに必要な設定値の力に達するまでビーズを細胞体上に下げ、一定の高さのフィードバックを使用して 60 秒間接触を維持した後、ビーズを後退させました (図 XNUMX)。 5b）。 500 kHz のサンプリング レートで記録された力と時間の曲線は、AFM ヘッドの垂直変位と細胞体の力の応答の両方を示しています。ラットの皮質ニューロンの細胞体の平均高さは、 〜8 μm (補足図 11a).

カルシウムの機能イメージング

遺伝的にコードされたカルシウムセンサーは、アデノ随伴ウイルス（AAV）を使用してニューロンで発現されました。 AAV1-EF1a-GCaMP6s (1.8×10)¹³ ウイルスゲノムml^-1) 感染多重度 5.0 × 10 で使用されました。⁴ GCaMP6s を表現します。ニューロンは DIV 3 で感染しました。発現は通常 DIV 5 ～ 9 で見られました。

機械的に刺激されたニューロンの機能的カルシウムイメージング解析

平均蛍光強度曲線ΔI/I GCaMP6s 曲線の は、画像のベースラインに対する画像全体の平均信号として計算されました。信号内のピーク検出は、3 秒のウィンドウ内で極大値を見つけることによって実行されました。カルシウム信号の振幅がピーク値の 10% に達したときに、イベントがニューロン応答の開始としてマークされました。応答ピークの開始の 2.5 秒前と 10 秒後のデータ (t = 0) をプロットしました。

HD-MEA記録

MaxWell Biosystem ユーザー インターフェイス (MaxLab Live v.22.13) を使用してデータを記録しました。チップ全体の蛍光画像がユーザーインターフェイスに登録されました（補足図）。 2c）。対象となるニューロンはカルシウム スパイクから特定され、スパイク活動 (活動電位) はユーザー インターフェイス上のライブ ラスター プロットから取得されました。対象のニューロンが特定されると、このニューロンの周囲にある長方形の構成の 512 個の電極が読み出しに配線されました。 AFM カンチレバーをニューロン上に配置した後、記録を開始する前に、AFM がカンチレバーのたわみを検出するために使用する赤外線レーザーからのノイズを補正するために、チャネルを 512 回オフセットしました。すべての録音には、ゲイン 300 とカットオフ XNUMX Hz のハイパス フィルターが使用されました。図のスパイクソートアルゴリズムのパフォーマンスを向上させるには、 5、ニューロンの活動電位を機械的刺激の前後 2.5 分に記録しました。

HD-MEAデータ解析

収集されたすべての HD-MEA データは、Spikeinterface に基づいたカスタム スクリプトを介して処理されました⁵⁰。簡単に説明すると、Kilosort2 を使用して細胞外記録をフィルター処理およびスパイクソートし、その後すべての記録を手動でキュレーションしました。慎重なスパイク間間隔違反閾値 0.5 と信号対雑音比閾値 5.0 がキュレーションに使用されました。テンプレートの類似性、自動コレログラム、および相互コレログラムがユニットの品質評価に使用されました。半幅や再分極傾きなどの波形特徴は、Spikeinterface の関数を使用して Python スクリプトを使用して、各エポックのスパイクで分類されたユニットから抽出されました (補足図 12a–i）。ニューロンの細胞外フットプリント内のすべての電極上の波形特徴の相対的な変化は、機械的圧縮中のすべてのスパイクの平均波形特徴の値を圧縮前のすべてのスパイクの平均波形特徴で割ることによって得られました。平均発火率とスパイク間隔は、Elephant 電気生理学解析ツールキット 0.11.2 を使用して、抽出されたスパイク列から計算されました。⁵¹。剛性相関データの平均発火率は、剛性値の時点と一致するようにスパイクを 30 秒のビンに配置することによって計算されました。圧迫プロトコルの平均発火率は、圧迫前、圧迫中、圧迫後の XNUMX つのビンにスパイクを配置することによって計算されました。

AFM と共焦点顕微鏡を組み合わせた

タイムラプス共焦点イメージングは​​、1x/700 LCI PlanApo 水浸対物レンズ (Zeiss) を備えた倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡 (Observer Z25、LSM 0.8; Zeiss) で実行されました。 ＡＦＭ（ＣｅｌｌＨｅｓｉｏｎ ２００；ＪＰＫ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を共焦点顕微鏡に取り付けた。機械的圧縮プロトコルは、JPK CellHesion ソフトウェアを使用して実行されました。機械的刺激の場合、AFM を使用して、ビーズを備えたカンチレバーを 200、0.1、1、または 10 μm s の速度でセルに近づけました。^-1 設定値の力に達するまで、その後はアプローチに使用したのと同じ速度ですぐに後退します。ニューロンを機械的に刺激するための閾値力を決定する実験では、適用される設定値の力は、50 nN 刻みで 400 秒間隔で 50 から 20 nN まで段階的に増加しました（補足図）。 6）。接近するビーズの設定値の力は、神経反応が記録されるまで段階的に増加されました。ニューロンの刺激が成功した後、カンチレバーは後退され、刺激のために新しいニューロンが選択されました。

統計分析

波形特性を示すすべてのデータは、Shapiro-Wilk テストで正規性がテストされ、 Q–Q プロット。すべてのデータ グループは正規分布しておらず、依存データ グループでした。したがって、Wilcoxon の符号付き順位検定を使用しました。帰無仮説は、ペアごとに比較した分布間に中央値に差がないということでした。 P 値 >0.05 は有意ではないとみなされました。波形特徴は、次のように得られた各ニューロンの平均波形から抽出されました。 n > 5,000 スパイク。平均発火率を示すすべてのデータは、Wilcoxon の符号付き順位検定と比較されました。 n > 10,000 スパイク。 AFM データグループは、両側マン・ホイットニー法を使用して比較されました。 U-テスト。 P 各比較の値は図の凡例に記載されています。ピアソン相関を使用して、剛性と平均発射速度値の線形相関を決定しました。サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。データの収集と分析は、実験条件を無視して実行されたわけではありません。

レポートの概要

研究デザインの詳細については、 ネイチャー ポートフォリオ レポートの概要 この記事にリンクされています。

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• 情報源： https://www.nature.com/articles/s41565-024-01609-1