倫理ステートメント

すべての動物実験は、カナダ動物管理評議会ガイドラインの推奨に従って実施されました。 原稿におけるこのデータの報告は、ARRIVE ガイドラインの推奨事項に従っています。 カルガリー大学健康科学動物管理委員会は、この研究で使用されるすべての動物プロトコルと外科的手順を承認しました (倫理 ID# AC16-0043)。

iPS細胞の生成

C57BL/6 胚 (12.5 日目) を採取し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) ですすぎ、浸軟させました。 0.25% トリプシンで処理した後、得られた細胞懸濁液を濾過して破片を除去し、高グルコース DMEM (Gibco)、10% FBS (Gibco)、1× MEM 非必須アミノ酸 (Gibco)、50 単位/ml ペニシリンにプレーティングしました。 –ストレプトマイシン (Gibco)。 得られたマウス胎児線維芽細胞 (MEF) は、iPSC を生成するための細胞再プログラミングのために Applied Biological Materials Inc. (リッチモンド、ブリティッシュコロンビア州) に出荷されました。 MEF にレンチウイルス SFFV-OCT4、-SOX2、および -KLF4 を形質導入しました。 9週間後、ESC様コロニーをフィーダーを備えた新しいウェルに移した。 フィーダー細胞で 6 回継代した後、マウス iPSC はカリフォルニア大学カルガリーに輸送されました。 GFPをゲノムに組み込むには、CRISPR/Cas26を使用して、相同性非依存性標的組み込み（HITI）技術を使用してマウスのセーフハーバーROSA136遺伝子座に10 kbの導入遺伝子を挿入しました[916]。 各ヌクレオフェクション反応について、10 ng/μlからのCRISPR DNA 719μl、および9 ng/μl GFPコンストラクトからの28.98 μlと混合した414 ng/μl Cas1001 DNAコンストラクトからのDNA 023μlをiPSCに使用した。 すべての DNA 構築物は水に溶解されました。 各ヌクレオフェクション反応では、メーカーの指示に従って、プログラム A-1 のヌクレオフェクション キット (マウス ヌクレオフェクター キット、Lonza、カタログ番号 VPH-0.25) を使用して、5 万個の iPSC を含むコンストラクトを使用しました。 ヌクレオフェクトされた iPSC を、ESC 培地を含むゼラチンおよび MEF でコーティングされたプレート上で 37 日間増殖させました。 次に、SSEA1 マーカーを使用した FACS を実行しました。 iPSC は、1% トリプシンを使用して 21702 °C で 15 分間酵素的に消化されました。 単一細胞を冷DPBSで1回洗浄し、濃度96μg/mlの結合SSEA26-PE(Santa cruz: sc-1.10 PE)でXNUMX分間染色した。 GFP および SSEAXNUMX に対して二重陽性の iPSC を、ゼラチンでコーティングした XNUMX ウェル プレートに XNUMX 細胞/ウェルで選別しました。 クローンの配列を決定して、ROSAXNUMX 遺伝子座における導入遺伝子の正しい位置と方向を決定しました。 細胞が機能的な iPSC として残っていることを検証するために、奇形腫アッセイが行われました。⁶ 細胞をSCIDベージュマウスの背部皮下に移植した。 サンプルは固定、処理され、パラフィンに包埋されました。 それらを 10 μM の厚さに切片化し、サフラニン O で染色しました。

iPS細胞培養

マウス iPSC は、T25 フラスコ (Fisher) 内の有糸分裂的に不活化されたマウス胎児線維芽細胞 (MEF) 上で日常的に培養されました。 培地は、1% 非必須アミノ酸、1% Anti-Anti、15% ウシ胎児血清 (FBS)、および 0.1 mM β-メルカプトエタノール (すべて Invitrogen) を補充した高グルコース ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM、Lonza) で構成されました。 。 iPSC 多能性を維持するために、培地には 1000 U/ml の白血病阻害因子 (LIF) が補充されました。 細胞は、80 ～ 5 日ごとに約 XNUMX% コンフルエントに達したら定期的に継代し、XNUMX% CO の加湿インキュベーター内で維持しました。₂ 37℃で。 細胞をコラーゲン足場に加える0.1継代前に、細胞をゼラチン(XNUMX%、Fisher)でコーティングしたフラスコ上で培養して、過剰なMEFを除去した。

足場の準備

コラーゲン I 足場は、以前に公開された方法に従って調製されました^7,14,18。 ウシ原線維コラーゲン I (3 mg/ml、PureCol、Advanced Biomatrix) を 3D ゲルとして重合させました。 簡単に説明すると、80% v/v 3 mg/ml I 型コラーゲン溶液を、1 万細胞/ml iPSC 懸濁液および 20 倍濃縮ダルベッコ変法に溶解した 5% v/v ベータグリセロールリン酸 (βGP、Sigma Aldrich) と混合しました。イーグル培地（DMEM）¹⁸。 続いて、15% FBS (Invitrogen)、1% 非必須アミノ酸、1% Anti-Anti、および 0.1 mM β-メルカプトエタノール (すべて Invitrogen) を添加しました。¹⁸。 コラーゲン-I/iPSC構築物を、ウェルあたり96μlの容量で100ウェルプレートに分配した。 重合した足場を 37 °C、5% CO のインキュベーターに置きました。₂ 動物モデルへの in vivo 移植の前に 5 日間予備分化させます。 コラーゲンのみの足場コントロールについては、上記のプロトコルも実行されましたが、iPSC は追加されませんでした。 プロセスの一般的な概要を補足図に示します。 S1.

リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)

iPSC を含むコラーゲン I 足場は、播種後 0、1、3、5、8、11、13、15、18、および 21 日の時点で収集されました。 Trizol (Invitrogen) を添加し、26 6/XNUMX ゲージの針を使用して Trizol 内のコラーゲン/細胞マトリックスを溶解しました。 RNAは、製造元が推奨するプロトコールを使用して単離されました。 cDNAは、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (ThermoFisher)を使用して調製しました。 再びプローブを使用して、ABI QuantStudio XNUMX で RT-PCR を実行しました。 Sp7 (Mm04209856_m1) と ビーグラップ (Mm03413826_mH)、 Ibsp (Mm00492555_m1)、 Sox9 (Mm00448840_m1)、 Col2a1 (Mm01309565_m1)、 Oct4 (Mm03053917_g1)、 ナノグ (Mm02019550_s1) と 18S (Mm03928990_g1) をハウスキーピング コントロールとして使用します。

フローサイトメトリーによる生存率評価

コラゲナーゼ I 処理により細胞を単一細胞懸濁液に解離し、Attune NXT および FlowJo ソフトウェアを使用して分析用のフローサイトメトリーを行いました。 サンプルごとに少なくとも XNUMX 万件のイベントが登録され、細胞破片や凝集を避けるために適切な散乱ゲートを使用して細胞全体の分析が実行されました。 細胞は、製造業者の指示に従って、Annexin-PI キット (ThermoFisher) を使用して染色されました。

動物モデル

MPC系統追跡マウス（Hic1^cre-ERT2:ローザ^tdトマトC57BL/6 バックグラウンド上の ) は、T. Michael Underhill 博士 (ブリティッシュ コロンビア大学) によって提供されました。 この研究には、生後8〜12週の雄と雌の両方が使用されました。 無傷および卵巣摘出（OVX）マウスにおける骨損傷の実験計画を補足図に示します。 S2.

このマウス モデルでは、タモキシフェン誘導後に内因性 MPC を tdTomato で永久的に標識しました。 マウスに麻酔をかけ、タモキシフェンの活性異性体を腹腔内注射しました ((Z)-4-ヒドロキシタモキシフェン、Sigma) を滅菌ヒマワリ油に溶解しました。 マウスに、100μlのタモキシフェン溶液(100mg/kg)を4日1回、XNUMX日間にわたって注射し、その後、組換えを可能にするためにXNUMX週間待機した。

最後のタモキシフェン注射から XNUMX 週間後、バーホール (重大なサイズではない) 損傷が行われました。 バリホール損傷は、Taiani らによって以前に記載された手順に従って実行されました。.^12,13,19これは、Uusitalo らによって以前に公開された方法を修正したものです。.²⁰ マウスを獣医用イソフルランで麻酔し、手術前に0.1mlのブプレノルフィンを皮下投与した。 高速マイクロドリル（ファインサイエンスツール）を使用して、脛骨近位骨幹端の髄腔に（反対側を損傷することなく）直径0.7 mmの穴を開けました。¹⁹.

恒常性骨折モデルでは、マウスを 100 つのグループに分けました: 未処理の対照、空のコラーゲン I 構築物、およびコラーゲン I + iPSC。 バリホール損傷の直後に、未治療の対照マウスの皮膚をステープルで留めて切開部位を閉じた。 空のコラーゲン I およびコラーゲン I + iPSC 処置マウスの場合、細胞 (マウスあたり 100,000 iPSC) を含むゲルまたは細胞を含まない XNUMX μl のゲルを穿孔欠損に移植しました。 次いで、切開部位をステープルで閉じ、マウスをケージに戻し、手術直後に体重をかけさせた。

恒常性骨折治癒モデル Hic1 の実験デザインに似ています。^cre-ERT2:ローザ^tdトマト タモキシフェンの腹腔内注射を4日0.1回、XNUMX日間受けた。 最後のタモキシフェン注射から XNUMX 週間後、マウスに OVX 手術を受けました。 簡単に説明すると、手術前にマウスに麻酔をかけ、XNUMX mlのブプレノルフィンを投与した。 両方の卵巣を見つけて切除しました。 OVX手術のXNUMX週間後、バーホール手術が行われました。 OVX マウスは、OVX 未処理のコントロール、OVX 空のコラーゲン I 構築物、および OVX およびコラーゲン I + iPSC の XNUMX つのグループに分けられました。

組織学と免疫蛍光

脛骨を脱灰し、加工してパラフィンワックスに包埋し、10μmの断面を作成した。 サフラニン-O/ファストグリーン染色および免疫蛍光を行った。 使用した特異的マーカーは、TdTomato、GFP、Anti-Mo/Rt Ki-67 eFluor 660 クローン SolA15 (Invitrogen、Ki67)、骨シアロタンパク質 (BSP) クローン WVID1(9C5) (Developmental Studies Hybridoma Bank) でした。 スライドは、DAPI (Biotium) を含む EverBrite™ ハードセット マウント メディアで処理され、Zeiss Axioscan 顕微鏡を使用して画像化されました。

組織サイトメトリー

定量的分析のために、対象領域がデジタル グレースケール画像として取得されました。 所定の表現型の細胞を、TissueQuest ソフトウェア (TissueGnostics) を使用して同定および定量し、陰性対照 (非染色および二次単独対照) と比較してカットオフ値を決定しました。 これらの閾値を使用して、単一/二重陽性細胞のゲーティングと定量化を実施しました。

X線顕微鏡検査（Xradia）

C57BL/6 マウス (正常および OVX) で X 線顕微鏡 (XRM) イメージングを使用して、損傷領域内の骨構造と仮骨形成を評価しました。 脛骨 (軟組織および筋肉を含む) を採取し、10% 中性緩衝ホルマリン (NBF) で 24 時間固定しました。 24 時間後、すべての軟組織と筋肉を骨から除去しました。 XRM イメージングまでサンプルを 70% アルコール中に置きました。 XRM 用のサンプルを準備するために、脛骨をアルコールから取り出し、発泡体を使用して直立ホルダーに固定しました。 イメージング中の水分補給を確実にするために PBS を使用しました。 50 つのカルシウム ハイドロキシアパタイト (CHA) 骨校正ファントム (密度 1000、1200、および XNUMX mg/cm)³）を薄いフォーム層の上に同一平面上に置き、テープを使用してホルダーに固定しました。 低エネルギー (40 kVp 電圧、3 W 電力) XRM スキャンは、4 倍の対物レンズを使用して実行されました。 各投影の露光時間は 3 秒で、2001 回転あたり 4.9 個の投影が収集されました。 画像は、0.10.0 μm の等方性ボクセル サイズに再構成されました。 XRM スキャンから取得した生データは、Amira ソフトウェアとカスタム SimpleITK スクリプト (vXNUMX、 http://www.simpleitk.org/)²¹。 皮質骨の端までの領域と、欠陥部位から伸びるすべての新しく形成された骨カルスを含む、バリホール欠陥を含むすべてのスライスがセグメント化されました（補足図）。 S3）。 関心領域 (ROI) は、ITK-SNAP (v3.8.0、vXNUMX、 http://www.itksnap.org/)²²。 各 ROI で平均線形減衰が計算され、XRM 画像を校正するために線形校正方程式が当てはめられました。 すべてのキャリブレーションでは、R² > 99%。 800 mg/cm の密度閾値³ 完全に石化した組織をセグメント化するために使用されました。 仮骨骨体積骨折（BV/TV）は、仮骨セグメンテーション内の完全に石灰化されたボクセルの数を仮骨セグメンテーション内のボクセルの総数で割ったものとして計算されました。 仮骨骨密度 (BMD) は、仮骨セグメンテーション内の平均密度として計算されました。 カルスのレンダリングは、ParaView (5.7.0) ソフトウェアを使用して生成されました。 1 つのフィルターが適用されました: (0.5) しきい値 - 最小値 2、(3) 表面の抽出、および (400) スムーズ - XNUMX 回の反復。

統計分析

すべてのデータは、GraphPad Prism 9 を使用して分析されました。95 つ以上の実験グループを含むすべてのデータセットは、フィッシャー LSD 事後検定による 0.05% 信頼区間 (α = 95) の一元配置分散分析 (ANOVA) を使用して分析されました。 。 0.05 つのグループのみを含むデータセットは、XNUMX% 信頼区間 (α = XNUMX) の両側対応のないパラメトリック t 検定を使用して分析されました。

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• 情報源： https://www.nature.com/articles/s41598-023-36609-z