メチオニンはシスプラチン耐性膀胱がんの微小環境における代謝の脆弱性を調整する - 細胞死と病気

細胞株

ヒトおよびマウスの膀胱がん細胞 SV-HUC-1、RT4、UM-UC-3、T24、5637、MB49 を入手し、前述のように培養しました。44]。シスプラチン耐性T24、UMUC-3、およびMB49細胞を誘導するために、細胞を、シスプラチン濃度を1μMから25μMに増加させたシスプラチン含有培地中で10か月間培養した。

組織マイクロアレイと患者サンプル

Huashan コホート組織マイクロアレイは、90 年 2007 月から 01 年 2013 月までに膀胱癌で根治的膀胱切除術を受け、01 年間の追跡調査を受けた正常組織と悪性組織の 5 組で構成されています。44].

この研究で使用された組織マイクロアレイは、90 年 2007 月から 2013 年 XNUMX 月までに当センターで根治的膀胱切除術を受けた膀胱癌 XNUMX 例からのものです。包含基準と除外基準は次のとおりです。

1.
選択基準：

a.
当センターでは根治的膀胱切除術が施行されており、完全な病理標本が入手可能である。病理標本はXNUMX人の病理医によって膀胱がんであると確認された。標本には腫瘍と正常組織が含まれています。
b.
年齢：18-80歳

2.
除外基準：

a.
患者の臨床情報が不完全です。
b.
病理学的サンプルの品質は不適格です。
c.
-手術前3か月以内に膀胱灌流療法の履歴がある、または手術前6か月以内に補助化学療法/放射線療法を受けている。

患者から書面による同意を得て、華山病院の倫理委員会によって承認されました（承認番号 KY2011-009、2022-100）。 circRNA 配列決定および発現解析用の患者サンプルも同じ手順で収集されました。

メタボロミクス解析

T24/T24-CR 細胞および T24-CR-LV-NC/T24-CR-LV-circARHGAP10OE 細胞をメタボロミクス解析に使用しました。コンフルエントに達した後、培地を廃棄し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞を 3 mL の冷却メタノール中でこすり取り、前述のように溶解して代謝産物を抽出しました [44].

プロテオミクス解析

20 μg の抽出タンパク質を SDS-PAGE で分離しました。タンパク質をトリプシンで消化し、LC-MS/MS を Nanoelute (Bruker) と組み合わせた timsTOF-Pro 分光計で実行しました。生のタンパク質データは、定量分析のために MaxQuant 1.6.14 ソフトウェアを使用して検索されました。アノテーションのステップに続いて、タンパク質をブラストして KEGG ID を取得しました。この研究のメタボロミクスおよびプロテオミクス解析と統合マルチオミクス解析は、中国上海のアプライドプロテインテクノロジーで完了しました。

RNA シーケンス

ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いて５対の良性および悪性膀胱組織から抽出された。 3 mg の全 RNA が抽出され、前述のようにさらなる配列決定が行われました。41].

RNA FISH と免疫蛍光

circARHGAP10の結合部位を標的とするプローブを合成した(GenePharma Biotech、広州、中国)。 IF および写真撮影された手順は前述のように実行されました [41]。すべての細胞を固定し、DAPI で標識し、LSM700 共焦点顕微鏡 (Carl Zeiss、Oberkochen) で写真を撮影しました。

RNase R 処理

全RNAを抽出し、RNase R (Epicentre Technologies, USA)で処理しました。 circRNA および直系 mRNA の安定性は、qRT-PCR によって分析されました [44].

アクチノマイシン D アッセイ

2 mg/mL のアクチノマイシン D (Sigma) を細胞に添加し、前述したようにさらなる分析のために指定の時点で BCa 細胞を収集しました。41, 44].

qRT-PCR

PrimeScriptTMRT 試薬キット (TaKaRa、日本) を使用して ABI 7900HT マシン (Thermo Fisher Scientific、米国) で qRT-PCR を実行することにより、RNA を抽出し、cDNA を得ました。 2-ΔΔCT を使用して RNA 発現を分析しました [44].

ベクター構築と細胞トランスフェクション

shRNA 配列は、circRNA、MAT2A、TRIM25、または SLC7A6 を標的とするように設計され、クローン化され、pGPU6/GFP/ピューロマイシンベクターに挿入されました。 circRNA 配列をクローン化し、IGEbio (広州、中国) の plenti-ciR-GFP-T2A ベクターに挿入して、circRNA 過剰発現プラスミドを構築しました。 MAT2A または SLC7A6 を過剰発現するために、同一の遺伝子またはコントロールを含むベクター pENTER を Vigene (上海、中国) から入手しました。 Flag-TRIM25、Flag-Trim25ΔRBD、Myc-MAT2A、HA-Ub、およびK6、K11、K27、K48、およびK63変異体プラスミドは、Vigene (上海、中国)から購入しました。 siRNA は GenePharma (中国、上海) から購入しました。細胞トランスフェクションは、以前の研究として説明しました [43].

スフィア形成アッセイ

BCa 細胞を消化し、6 ng/mL 組換え EGF (Sangon、中国) を補充した 5 ウェル超低付着プレートに単一細胞として懸濁しました。１２日後に球体の形成が観察された。

細胞増殖アッセイ

CCK-8 アッセイでは、細胞を消化し、1,500 ウェルプレートにウェルあたり 96 細胞で播種しました。ウェルに播種した後のさまざまな時点で OD450 値を検出しました。 IC50 試験では、細胞をシスプラチンとともにインキュベートし、相対生存率を Graphpad Prism 8 で計算して IC50 値を計算しました。コロニー形成アッセイでは、細胞を消化して 6 ウェルプレートに播種し、14 日間インキュベートしました。コロニーは、0.2% クリスタルバイオレットで染色した後に画像化されました。

アポトーシスおよびEdUアッセイ

アポトーシスアッセイは、以前の研究としてアポトーシスキット（MultiSciences、中国）を使用して実行されました[41]。 EdU アッセイは、DNA 合成を検出するために EdU キット (RiboBio、中国) を使用して実行されました [44].

トランズウェルアッセイ

細胞は、Transwell チャンバー (CoStar、米国) 内で 0.2% クリスタルバイオレットで染色されました。統計分析を行うために、ランダムに選択された XNUMX つの細胞セクションが分析されました。

分子ドッキング

Autodock Vina 1.2.2 を使用して、タンパク質間の結合親和性を分析しました。タンパク質の 3D 座標は PDB からダウンロードされました (http://rcsb.org/PDB）。分子ドッキングは AutodockVina 1.2.2 を使用して視覚化され、実行されました (http://autodock.scripps。教育）。

免疫共沈降

co-IP実験では、RNase阻害剤の有無にかかわらず、プロテイナーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤の組み合わせを補充した冷却液で相対細胞を溶解しました。上清を抗体結合ビーズまたは抗体でプレインキュベートしたビーズとともにインキュベートした。ビーズを洗浄し、さらにウェスタンブロット分析を行うために co-IP バッファーで遠心分離しました。53].

RNAプルダウンアッセイとRIPアッセイ

ストレプトアビジンビーズ（Life Technologies、米国）をオリゴプローブを備えたビオチン標識circARHGAP10プローブで処理して、RNAプルダウンアッセイを実施しました。磁気 RIP キット (Millipore) を使用して、以前の研究として説明した製造業者の指示に従って RIP アッセイを実行しました。43].

ウエスタンブロット分析

タンパク質をRIPAバッファーで細胞から溶解し、SDS-PAGEで分離しました。ブロットをブロックし、抗体とともに一晩インキュベートしました。抗体: GLDC (アブカム、ab232989)、SHMT2 (アブカム、ab180786)、MAT2A (プロテインテック、55309-1-AP)、MTHFR (アブカム、ab203786)、SAHH (アブカム、ab151734)、CD44 (アブカム、ab243894)、Nanog (アブカム、ab109250)、H3 (アブカム、ab1791)、H3K4me3 (アブカム、ab213224)、H3K9me3 (アブカム、ab8898)、H3K27me3 (abcam、ab6002)、H3K36me2 (アブカム、ab176921)、および H3K36me3 (Abc)午前、ab9050)、H3K79me2 (アブカム、ab3594)、H3K79me3 (アブカム、ab2621)、Flag/DDDDK タグ (アブカム、ab205606)、Myc タグ (アブカム、ab32)、HA タグ (アブカム、ab9110)、TRIM25(アブカム、ab167154)、USP5(アブカム、 ab154170)、USP14(Abcam、ab192618)、p-STAT5(Abcam、ab32364)、STAT5(Abcam、ab230670)、SLC7A6(Abcam、ab235054)、GAPDH(Proteintech、60004-1-lg)をローディングコントロールとして使用しました。信号は、前述のように ECL イメージングシステム (CLiNX、上海) を使用して視覚化されました。44].

化合物と試薬

この研究で使用される化合物または酵素は次のとおりです: シスプラチン (Selleck、米国)、FIDAS (Selleck、米国)、MeAIB (Selleck、米国)、BCH (Selleck、米国)、RNase A (Yeason、中国)、SAM (シグマ、米国）、SAH（シグマ、米国）、および HCY（シグマ、米国）。特定のアミノ酸を含まない培地は、US Biological, USA から購入しました。アミノ酸は中国の Sangon から購入しました。

インビトロでの CD8 + T 細胞の調製と活性化

動物を屠殺した直後に新鮮な腫瘍サンプルを入手した。腫瘍を細かく刻み、コラゲナーゼ I (Sangon、中国) と DNase I (Sangon、中国) の組み合わせで消化しました。 PBMC は、Ficoll 患者に由来しました (GE Healthcare、米国)。細胞を刺激し、膜マーカーで染色し、さらなる分析のためにMACSカラムに適用しました。

フローサイトメトリー

末梢血または癌組織から採取した CD8 + T 細胞を収集しました。 CD8 + T 細胞の単細胞懸濁液は、CD45 (BD Biosciences、557833)、CD3 (BD Biosciences、552852)、CD8 (BD Biosciences、564526) および PD-1 (BD Biosciences、561272) を含む表面マーカーで染色されました。44]。 BD Cytofifix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences) を使用して、IFN-g (BD Biosciences、557643)、GZMB (BD Biosciences、560212)、および IL-2 (BD Biosciences、554566) を含む細胞内マーカーを染色しました。 CD8 + T 細胞は、以前に説明したように BD FACS Verse フローサイトメーターで分析されました [44].

動物実験

皮下 T24-CR 細胞異種移植モデルでは、生後 4 週齢の雄の胸腺欠損ヌード BALB/c マウス (SLARC、中国、上海) を特定の病原体を含まない培養環境で維持しました。対照食とメチオニン制限食はXietong（中国江蘇省）から購入し、我々の研究では対照食には0.86％のメチオニン栄養が含まれ、MR食には0.12％のメチオニン栄養が含まれていた[30]。マウスはランダムに 1 つのグループに選ばれました。合計10×XNUMX⁷ T24-CR-luc-LV-NC 細胞または T24-CR-luc-LV-circ 細胞を、対照食または MR 食を与えたヌードマウスに皮下注射しました。細胞移植の１週間後にシスプラチン（６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した（５日ごとに１回注射）。腫瘍体積 = 幅の計算により、腫瘍体積を 6 日ごとにモニタリングしました。² ×長さ/2。 6週間の薬物治療後にすべてのマウスを屠殺した。極限限界希釈分析は 5 × 10 で実行されました。⁶、5×10⁵ および5×10⁴ T24-CR細胞をヌードマウスに皮下注射し、腫瘍移植の成功率を計算します。

患者由来異種移植（PDX）モデルでは、BCa 患者の組織の 4 つの新鮮な断片を生後 1 週間の NOD/SCID マウス（SLARC、上海、中国）の皮下に移植しました。 XNUMXのとき^st 異種移植片の世代は約 100 mm に達しました³、PDX 組織ブロックを分離し、機械的に 1 mm に溶解しました。³ 第 2 PDX 世代の NOD/SCID マウスへの皮下移植のための組織ブロック。第 2 世代 PDX はランダムに 5 つのグループに分けられました。 PDX異種移植片に、対照食またはMR食を与えた5nmolのインビボグレードのコレステロール結合si-NCまたはsi-circARHGAP6（RiboBio、広州、中国）を注入した。細胞移植の１週間後にシスプラチン（６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した（５日ごとに１回注射）。腫瘍体積は、腫瘍体積 = (幅) の計算により 5 日ごとにモニタリングされました。² ×長さ/2)。 6回目のPDX移植の2週間後にすべてのマウスを屠殺した。

T24-CR細胞の肺転移モデルの場合、1×10⁵ T24-CR-luc-LV-NC または T24-CR-luc-LV-circ 細胞を、対照または対照を与えた生後 4 週齢の雄の胸腺欠損ヌード BALB/c マウス (SLARC、上海、中国) の尾に静脈内注射しました。 MRダイエット。細胞注射の１週間後にシスプラチン（６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した（５日ごとに１回注射）。 6日後、5 mg/kgのルシフェリンを腹腔内注射した後、IVISを介して腫瘍の転移をモニタリングした。

皮下 MB49-CR 細胞異種移植の場合、生後 4 週間の雄 C57BL/6 マウス (SLARC、上海、中国)。合計1×10⁷ MB49-CR-LV-NC または MB49-CR-LV-circ 細胞を、対照食または MR 食を与えたマウスに皮下注射しました。抗ＰＤ－Ｌ１およびＩｇＧ１（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）（１００μｇ／マウス）を、細胞移植の１週間後に腹腔内注射した（３日ごとに１回注射）。 BCH (1 mg/kg) を細胞移植の 1 週間後に静脈内注射しました (100 日ごとに 3 回の注射)。細胞移植の１週間後にシスプラチン（６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した（５日ごとに１回注射）。腫瘍体積は、腫瘍体積 = (幅) の計算により 180 日ごとにモニタリングされました。² ×長さ/2)。 6週間の薬物治療後にすべてのマウスを屠殺した。この研究を含むすべての動物実験は、承認番号 202212002 S で承認されました。

IHC

腫瘍組織サンプルとマウス肝臓組織をパラフィンに包埋し、IHC および H&E 染色を実行しました。44, 54]。一次抗体は、Ki-67 (Abcam、ab270650)、MAT2A (Proteintech、55309-1-AP)、SLC7A6 (Abcam、ab235054)、CD44 (Abcam、ab243894) および CD8A (Abcam、ab217344) でした。

統計分析

統計分析は Student's を使用して分析されました。 t-test または Graphpad Prism 8 のカイ XNUMX 乗検定 [55]。 KM 曲線は全生存期間分析に適用されました [56, 57]。私たちは次のように判断しました p < 0.05 は統計的に有意でした。

レポートの概要

研究デザインの詳細については、ネイチャーリサーチレポートの概要この記事にリンクされています。

SEO を活用したコンテンツと PR 配信。今日増幅されます。
PlatoData.Network 垂直生成 Ai。自分自身に力を与えましょう。こちらからアクセスしてください。
プラトアイストリーム。 Web3 インテリジェンス。知識増幅。こちらからアクセスしてください。
プラトンESG。自動車/EV、カーボン、クリーンテック、エネルギー、環境、太陽、廃棄物管理。こちらからアクセスしてください。
プラトンヘルス。バイオテクノロジーと臨床試験のインテリジェンス。こちらからアクセスしてください。
チャートプライム。 ChartPrime でトレーディングゲームをレベルアップしましょう。こちらからアクセスしてください。
ブロックオフセット。環境オフセット所有権の近代化。こちらからアクセスしてください。
情報源： https://www.nature.com/articles/s41419-023-06050-1

生成的データインテリジェンス

メチオニンはシスプラチン耐性膀胱がんの微小環境における代謝の脆弱性を調整します – 細胞死と疾患

細胞株