動物研究

すべてのマウスは、コロンビア大学の動物施設で 57 ± 6 °C および 23 時間の明暗サイクルで維持された C1BL/12J バックグラウンド上にありました。 アドリブで 固形飼料 (PicoLab Rodent 5053) と水へのアクセス。 60% の脂肪を含む HFD は、Research Diets (D12492i) から購入しました。 肥満予防研究では、オスまたはメスのマウスに HFD を与え、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中の P-G3 (体重 10 kg あたり 3 mg) を指示された時間、週 10 回腹腔内注射しました。 やせたマウスの治療では、16 週齢のオスのマウスに固形飼料を与え、P-G4 を週 XNUMX 回 XNUMX 週間腹腔内注射しました。 肥満治療研究では、オスのマウスに XNUMX 週間の HFD 給餌後に肥満を誘発し、NP (体重 XNUMX kg あたり XNUMX mg) を週 XNUMX 回、さらに XNUMX 週間腹腔内注射しました。 体重は毎週モニターされ、体組成はEchoMRIで測定されました。 XNUMX時間の絶食とそれに続くXNUMX時間の再給餌の後、マウスはCO によって殺されました₂ 組織および血漿収集のための安楽死。 それに応じて、血漿インスリン（インスリンELISA、Mercodia）、TG（Thermo Scientific）、およびNEFA（Fujifilm Wako）を測定しました。 脂質吸収を測定するために、前述のように糞便サンプルから脂質を抽出しました³⁸、および遊離脂肪酸含有量（NEFA、富士フイルム和光）が決定されました。 コロンビア大学動物管理利用委員会は、すべての動物研究を承認しました。

代謝表現型

間接比色研究では、雄マウスの別のコホートを、HFD 給餌の開始から 3 回の P-G16 注射後に、Comprehensive Lab Animal Monitoring System (Columbus Instruments) にかけました。 耐糖能試験 (GTT) では、マウスを清潔な寝具ケージで 2 時間絶食させ、その後、グルコース (体重 2 kg あたり 4 g) を腹腔内注射しました。 指定された時点でBreeze 0.75グルコメーター（Bayer）を使用して血糖を測定しました。 インスリン耐性試験 (ITT) では、マウスを 4 時間絶食させ、インスリン (体重 200 kg あたり 10 U) を腹腔内注射しました。 脂質耐性試験では、マウスを 6428 時間絶食させ、経口胃管栄養法でオリーブ オイル (マウスあたり XNUMX μl) を与えました。 血液サンプルは、指示された時点で尾静脈出血によって採取されました。 その後、それに応じて血清脂質含有量を測定した。 脂肪分解のために、マウスにイソプロテレノール（体重１ｋｇあたり１０ｍｇ）をｉ．

脂肪組織 ECM 分離

WAT は、修正を加えた前述の方法に従って脱細胞化されました³⁹. 簡単に説明すると、組織を 50% トリプシン – 0.02% エチレンジアミン四酢酸溶液を含む 0.05 ml 遠心管に入れ、37 °C で 30 分間軌道振とうし、新しいトリプシン – エチレンジアミン四酢酸溶液でさらに 30 分間インキュベートしました。 次に、組織を振盪しながら室温（RT）で次の溶液で連続的にインキュベートしました：3％Triton X-100で1時間、4％デオキシコール酸溶液で1時間、および4％エタノールと0.1％過酢酸で2時間h. 組織を蒸留脱イオン水（ddH₂O) ソリューションの変更の間。 次に、組織を室温でPBS（pH 7.4）で15分間、XNUMX回洗浄し、次にddHで洗浄しました₂O 15 分間 100 回、XNUMX% n-プロパノールを 30 分間 XNUMX 回。 最後に、組織を ddH で XNUMX 回洗浄しました₂O 使用する準備ができる前に 1 時間。

Cy5標識P-G3イメージング

Ex vivo 組織分布イメージング: マウスに HFD を 5 日間与えて、固形飼料からの微量バックグラウンド信号の可能性を排除した後、組織を収集しました。 iWATおよびeWATからの組織およびECMを、Cy3標識P-G100（30 ml中45μg）の有無にかかわらず、PBSで37°Cで振とうしながら4.5.5分間インキュベートしました。 その後、組織を PBS で XNUMX 回洗浄し、PerkinElmer IVIS Spectrum 光学イメージング システム (Living Image XNUMX ソフトウェア) を使用してイメージング分析を行いました。

インビボ 組織分布イメージング：固形飼料またはHFDを与えられたマウスに、Cy5標識ポリマーまたはNP（マウスあたり200μg）を腹腔内または静脈内経路を介して、または局所的にiWATに注射しました。 所定の時点で、PerkinElmer IVIS システム (Living Image 4.5.5 Software) を使用してマウスを in vivo イメージングに供しました。 その後、マウスを殺し、同じシステムを使用して組織信号を測定しました。

細胞培養と脂肪細胞の分化

3T3-L1 (ATCC CL-173) および C3H10T1/2 (CCL-226) 細胞は ATCC から購入し、10% 子ウシ血清 (Gemini Bio-Products 100–506) または胎児血清を添加した高グルコース ダルベッコ改変イーグル培地で培養しました。ウシ血清（熱不活性化; Corning 35-011-CV）および1×ペニシリン - ストレプトマイシン（Thermo Fisher）。 細胞は、10日間コンフルエントに達した後、標準的な脂肪生成カクテルで分化しました。 カクテルには、ダルベッコ改変イーグル培地、1% ウシ胎児血清、10 μM デキサメタゾン、XNUMX μg ml が含まれています。^-1 インスリンおよび 0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン。 さらに、C5H3T10/1 細胞の分化を促進するために、最初の 2 日間は 2.5 μM ロシグリタゾンを使用しました。 XNUMX日間誘導した後、細胞をXNUMXμgml を含む完全培地で維持しました^-1 完全に分化するまでインスリン。 P-G3ポリマーまたはNP（10μgml^-1）指定された時間に追加され、細胞は分析のために分化中に採取されました。 脂肪滴は、オイルレッドO染色またはBODIPY染色を使用して視覚化されました。 3T3-L1 細胞は、100 日目から 4 日目までラパマイシン (6 nM) で処理されました。C3H10T1/2 細胞は、長期ラパマイシン機能分析のために、100 日目から 4 日目までラパマイシン (9 nM) で処理されました。 3T3-L1 細胞を分化の 20 日目から 0 日目まで NMN (3 mM) で処理し、4 日目に分析のために採取しました。

ヒト前脂肪細胞は、以前に公開されたプロトコルに従って培養および分化されました⁴⁰. 細胞は、P-G3（10μgml^-1）0日目から7日目まで、その後3日目からP-G7を含むまたは含まない維持培地に切り替えた。さらなる遺伝子発現分析のために、分化の7日目または9日目に細胞を採取した。

ヒト脂肪移植治療

ヒト脂肪生検を収集するためのプロトコルは、Weill Cornell Medicine Institutional Review Board (19-05020126) によってレビューおよび承認されています。 新鮮なヒト大網脂肪組織を小片（約10 mg）に切り刻み、RT PBSで洗浄し、199 µg ml を添加した培地50で培養しました^-1 ゲンタマイシン、7 nM インスリン、および 25 nM デキサメタゾン⁴¹、同時に10μgml の有無にかかわらず処理^-1 P-G3。 培地は8日ごとに交換し、組織はRNA分析のために処理のXNUMX日目に採取されました。

オイルレッドO染色

分化した脂肪細胞を PBS で 4 回洗浄し、30% ホルマリン緩衝溶液で 60 分間固定しました。 次に、固定した細胞を水で 5 回洗浄し、続いて 60% イソプロパノールで 15 分間覆い、新しく作成してろ過した XNUMX% オイルレッド O イソプロパノール溶液で XNUMX 分間染色しました。 次に細胞を蒸留水で洗浄し、画像化した。

初期のエンドソーム染色

C3H10T1/2 細胞を 22 ウェル プレート (Corning、22 mm × 1 mm、No. 2.0) のカバー ガラスに播種し、上記のプロトコルを使用して分化させました。 初期エンドソーム マーカー (CellLight Early Endosomes-GFP、BacMam 12、Thermo Fisher Scientific、各ウェルに 5 μl) を細胞培地に添加して、初期エンドソームを一晩染色しました。 PBSで洗浄した後、Cy3標識P-G5またはCy100標識NPを最終濃度XNUMXμgml で培地に添加しました^-1. 15 分または 1 時間のインキュベーション後、Cy5 標識 P-G3 または Cy5 標識 NP を除去し、細胞を PBS ですすぎ、4% パラホルムアルデヒドで固定しました。 核は、DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) で染色されました。 画像はNikon A1共焦点顕微鏡で撮影されました。

細胞小器官の染色

成熟した 3T3-L1 細胞を、5 ウェルの Lab-Tek II チャンバー付きカバーガラス (Thermo Fisher Scientific) に播種しました。 Cy3標識P-G10を最終濃度XNUMXμgml で培地に添加しました^-1. 24時間後、細胞を50 nM LysoTracker Red DND-99（Thermo Fisher Scientific）または100 nM MitoTracker Red CMXRos（Cell Signaling Technology）を含む新鮮な培地で交換して、それぞれリソソームまたはミトコンドリアを30分間染色しました。 小胞体染色のために、細胞をカルシウムとマグネシウムを含むハンクス平衡塩類溶液ですすぎ、1 μM ER-Tracker Red 色素 (Thermo Fisher Scientific) を生細胞の核染色のために Hoechst 33243 と一緒に添加しました。 脂肪滴の染色のために、細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで洗浄し、1μMBODIPY 493/503（Thermo Fisher Scientific）で5分間インキュベートした後、PBSで7回洗浄しました。 画像は、ZEISS Axio Observer XNUMX 機器で撮影されました。

カルボン酸マイクロビーズの P-G3 コーティング

過剰な P-G3 ポリマーを微量遠心チューブ内のカルボキシレート マイクロビーズ (Polybead Carboxylate Microspheres 6.00 μm、Polysciences) に添加し、短時間ボルテックスし、4 °C で一晩振とうしながらインキュベートしました。 マイクロビーズを細胞培養グレードの水で洗浄し、4°C、10,000×でスピンダウンしましたg 5分間。 90回洗浄した後、沈殿したマイクロビーズを元の容量の細胞培養グレードの水に再懸濁し、Malvern Zetasizer Nano ZS3で表面電位を測定しました。 マイクロビーズ上の P-G5 含有量を定量化するために、Cy3 標識 P-G3 を上記の手順に従って使用しました。 Ｐ－Ｇ３量は標準曲線に従って決定した。 3T3-L1細胞を12ウェルトランスウェルプレート(Corning)で分化させた。 次に、10μgml^-1 P-G3または等量のP-G3を含むマイクロビーズを直接培地に添加した。 トランスウェルグループでは、マイクロビーズは、0.4μmの孔径のインサートによって細胞から分離されました。

NP の合成とキャラクタリゼーション

ここでは、15 ml メタノール (Thermo Fisher Scientific) 中の 3 μmol P-G5 (Sigma-Aldrich) を 75 ml ジクロロメタン (Thermo Fisher Scientific) 中の 5 μmol クロロギ酸コレステロール (Sigma-Aldrich) と混合し、続いて 300 μmol を添加しました。 N,N-ジイソプロピルエチルアミン (Sigma-Aldrich)。 次に、混合物を50°Cで3時間攪拌し、超純水で72時間透析して、P-G3-Chol(5)を生成しました。 P-G3-Chol(5) NP を作製するために、1 mg の P-G3-Chol(5) を 200 μl のクロロホルム (Thermo Fisher Scientific) に溶解し、続いて 1 ml の H₂Oおよび2分間の超音波処理。 最後に、5mlのH₂O を混合物に添加し、ロータリーエバポレーターを使用して過剰な溶媒を除去して、P-G3-Chol(5) NP を生成しました。 得られた NP の構造は、Bruker Avance III 400 NMR 装置によって特徴付けられました。 形態は、Titan Themis 200 透過型電子顕微鏡を使用して画像化されました。 NPの流体力学的直径とゼータ電位は、Malvern Nano ZS90 Zetasizerによって測定されました。 Denovix DS-11+ 分光光度計を使用して吸光度を測定しました。

NAD⁺ 細胞濃度

前脂肪細胞または脂肪細胞をP-G3（10μgml^-1) または 14 時間の PBS、および細胞 NAD⁺/NADHレベルはNADによって決定されました⁺/NADH 定量比色キット (BioVision K337) 製造元の指示に従います。

遺伝子発現解析

ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）をＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬのＲＮＡ単離キットと組み合わせて使用​​して、組織または細胞から全ＲＮＡを抽出した。 ここでは、大容量cDNA逆転写キット（Applied Biosystems）を使用して、1μgのRNAを逆転写に使用してcDNAを合成しました。 Bio-Rad CFX96リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）システムを使用して、GoTaq qPCR Master Mix（Promega）で定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）を実行しました。 相対遺伝子発現は、ΔΔCt法を使用して計算されました シクロフィリンA or Rpl23 参照遺伝子として。 プライマー配列は、補足表で入手できます 4 & 5.

scRNA配列

3T3-L1細胞を培養し、上記のように分化させた。 P-G3 (10 μg ml^-1) または PBS は、分化の 0 日目から細胞に追加されました。 細胞は、それぞれ前脂肪細胞、初期脂肪生成、および成熟脂肪細胞として、分化0、3、および6日目に収集されました（補足表 1）。 収集時に、細胞はトリプシン酵素消化により単一細胞に穏やかに解離されました。 細胞生存率は、85x Genomics Chromium テクノロジーを使用して scRNA-seq を行う前に、トリパン ブルー排除によって 10% 以上であることが確認されました。 得られた単一細胞の 3' 末端 cDNA ライブラリーは、Columbia Genome Center の Single Cell Analysis Core にある Illumina NovaSeq 6000 配列決定システム (2 × 100 bp ペア末端) で配列決定されました。 ここでは、マウス参照トランスクリプトーム GRCm10 を含む 3.1.0x Genomics の Cell Ranger パイプライン (v. 38) を使用してデータを処理しました。 scRNA-seqのサンプル情報の詳細は、補足表に記載されています 2. 成熟脂肪細胞 (LQ004 および LQ005) を含むサンプルでは、​​細胞懸濁培地にも脂肪滴が含まれていました。 脂肪滴も偶然にもバーコード化されていました。 これが、LQ004 と LQ005 の平均読み取り値が低いシーケンサーからの期待値が高い理由でした。 遺伝子数 (2,500 ～ 9,000 遺伝子) の細胞のみを保持し、ダウンストリーム分析用にミトコンドリア遺伝子の割合を 20% 未満にすることで、シーケンシング データの脂肪滴ノイズを除外しました。 ソフトウェアとアルゴリズムの詳細は、補足表に記載されています 3.

RNA速度と調節ネットワーク分析

正規化および教師なしクラスタリングのための単一細胞分析の前処理は、Python (v. 1.7.1) で Scanpy (v. 3.6) を使用して実行されました。 既知の脂肪生成および脂質生成マーカーに基づいて細胞型に注釈を付けました。 脂質蓄積遺伝子の高発現が観察された場合、成熟脂肪細胞のサブグループを脂肪生成脂肪細胞として分類しました。 全体として、私たちのデータセットでは、前脂肪細胞、未熟脂肪細胞、脂肪細胞、脂質生成脂肪細胞のXNUMXつの細胞タイプが観察されました（図. 4b、拡張データ図 5a と補足表 1）。 次に、scVelo (v. 0.2.1) と velocyto (v. 0.17.16) を使用して、すべての単一細胞のスプライシングされたおよびスプライシングされていない mRNA ダイナミクスに基づいて、RNA 速度 (スプライシングと分解の速度) を計算しました (Fig. 4e–h 拡張データ図 5d、e）。 調節ネットワークは、SCENIC (v. 1.2.2) による転写因子とその下流のエフェクター遺伝子の共発現パターンによって特定されました (拡張データ図. 5c）。 RNA 速度とレギュロンを回復する方法は、データの正規化の影響を受けません。 上記の分析を実行するための入力として、生のシーケンス データと細胞型の注釈を使用しました。

改変遺伝子経路解析

QIAGEN IPAソフトウェアを使用して、統計的有意性を計算しました（図. 4i）。 簡単に言えば、IPA ソフトウェアは、フィッシャーの正確確率検定を使用して、データセットと参照データベース (つまり、正規経路内の分子のセット) との重複を計算しました。 の p 値は、ランダム チャンスによる実験データセットと特定の正規経路との間で観察された関連の可能性を測定します。 対応する経路は、実験データセットに大きく関連しています。 p 値が小さい (つまり、 p <0.05）。

リソソーム細胞内活性分析

リソソーム活性は、BioVision リソソーム細胞内活性アッセイキット (k448-50) を使用して決定されました。 手短に言えば、C3H10T1/2 細胞は、分化 3 日目から 5 日目まで、P-G7 の有無にかかわらず前処理されました。バフィロマイシン A1 は、リソソーム阻害剤コントロールとして使用されました。 次いで、細胞を、０．５％ウシ胎児血清および自己クエンチ基質を補充した細胞培地中で２時間インキュベートし、続いてアッセイ緩​​衝液を添加して実験を終了させた。 次に、細胞を解離させ、フローサイトメトリー分析（0.5 nm励起レーザー）にかけました。 ゲーティング戦略は、拡張データの図に示されています。 6e. フローサイトメトリー データは、FCS Express (v. 7.14.0020) ソフトウェアによって分析されました。

ウエスタンブロッティング

細胞または組織は、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを添加した総タンパク質溶解バッファーで溶解しました。 タンパク質上清を、Pierce BCAキットと10％ゲルドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動分離を使用してタンパク質定量化にかけました。 この研究で使用される抗体は次のとおりです。 p-AKT (T2971、CST #6)、p-GSK9205b (Ser 4、CST #1)、FASN (CST #2855)、ADIPSIN (R&D Systems、#AF473)、アディポネクチン (Thermo Fisher、#PA9271-308)、 CEBPA (Santa Cruz、sc-13038)、HSP3 (Proteintech、#9-9322-AP)、および GAPDH (Proteintech #HRP-3180)。 抗体の希釈は、製造元の Web サイトの推奨に基づいています。

組織学的評価

解剖後、eWAT、iWAT、および肝臓は、10% ホルマリン緩衝液で直ちに固定されました。 固定と脱水後、組織をパラフィンに包埋し、F4 / 80（CST、＃70076）、ヘマトキシリンとエオシン（H＆E）または過ヨウ素酸シッフに対する抗体で染色し、顕微鏡（オリンパスIX71）で撮影しました。 免疫組織化学では、eWAT、iWAT、および肝臓をすぐに 4% パラホルムアルデヒドで 4 °C で一晩固定し、30% スクロースで室温で一晩脱水した後、最適な切断温度媒体 (Sakura Tissue-Tek OCT コンパウンド 4583) に埋め込みました。 5 μm スライドにマウントした後、凍結切片を抗体カベオリン-1 (D46G3) (CST、#3267; 1:250 希釈)、次に抗ウサギ Alexa 488 抗体 (Thermo Fisher Scientific、#A27034; 1:1,000) とインキュベートしました。希釈)、さらに共焦点顕微鏡で画像化します。 画像は、ImageJ ソフトウェア (v. 2.1.0; National Institutes of Health) を使用して処理されました。

統計分析

グループ間の有意性は、スチューデントの両側検定を使用して評価されました。 t-テスト。 次の場合、グループ間の差は統計的に有意です。 p 値は 0.05 未満です。 この研究では、すべてのデータは平均±平均の標準誤差（sem）として表されます。 分析には Prism 9.3.1 (GraphPad) を使用しました。

レポートの概要

研究デザインの詳細については、 ネイチャー ポートフォリオ レポートの概要 この記事にリンクされています。

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• 情報源： https://www.nature.com/articles/s41565-022-01249-3