Entnahme von Patientenproben

Patientenproben wurden gesammelt, indem die Rückseite des Rachens (oropharyngealer Abstrich) von Patienten, wie zuvor beschrieben, abgewischt wurde²⁶. Die Proben wurden von Patienten mit dem COVID-19-ähnlichen Krankheitsbild gesammelt und nach Nukleinsäureextraktion mit qRT-PCR getestet. Kurz gesagt, nach der Entnahme wurden die Tupfer in ein markiertes Probenröhrchen gegeben, das einen Lysepuffer (4 M Guanidinthiocyanat, 25 mM Tris-HCl, 0.5 % β-Mercaptoethanol und MS2-RNA (200 ng µl^-1; Roche)). Das Röhrchen wurde leicht geschüttelt, um eine gleichmäßige Verteilung des Lysepuffers sicherzustellen. Die Sicherheitsschritte wurden zuvor beschrieben und wurden in einem zertifizierten CL2-Labor durchgeführt²⁶.

Nukleinsäureextraktion

Die gesamte Nukleinsäure wurde unter Verwendung von Spinsäulen-basierten Systemen extrahiert und wie bei standardisierten qRT-PCR-Tests verwendet²⁶. Die interne Amplifikationskontrolle (MS2 (~6 × 10⁴ PFU ml^-1) pro 10 ml Lysepuffer) wurde in den Nachfüll-Lysepuffer (25 &mgr;l pro 10 ml Lysepuffer) gegeben. Die Probe wurde in 100 µl Nuklease-freiem Wasser (nfH₂Ö; Invitrogen) und 1 min stehen gelassen, bevor 1 min bei 21,130× zentrifugiert wirdg (15,000 U/min) in einer Tischmikrozentrifuge. Die eluierten Proben wurden direkt einer qRT-PCR unterzogen. Die verbleibenden Nukleinsäureextrakte wurden bei −80 °C gelagert und für die Nanoköder-Nanoporen-Erkennung weiterverwendet.

qRT-PCR für SARS-CoV-2

Der SARS-CoV-2-Nachweis wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt²⁶. Pro Reaktion enthielt der Master-Mix 12.5 µl 2× Luna Universal Probe One-Step-Reaktionsmix, 0.5 µl 20 µM Wu-Vorwärtsprimer (5′-ATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGA-3′), 0.5 µl 20 µM Wu-Rückwärtsprimer (5′). -GCAGTTGTGGCATCTCCTGATGAG-3′), 0.3 µl 10 µM MGB-Sonde 3 Fluorescein (5′-ATGCTTAGAATTATGGCCTCAC-3′), 0.5 µl 10 µM interner Kontroll-Vorwärtsprimer für MS2-RNA, 0.5 µl 10 µM interner Kontroll-Rückwärtsprimer für MS2 RNA, 0.3 µl 10 µM interne Sonde (MS2 ROX), 1 µl Luna WarmStart RT Enzyme Mix und 3.9 µl nfH₂O. Dann wurden 20 &mgr;l der Mastermischung in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen aliquotiert und dann mit 5 &mgr;l jedes Extrakts kombiniert. Die MS2-interne Extraktions- und Amplifikationskontrolle, die dem vollständigen Extraktionsprotokoll unterzogen wurde, wurde als negative Extraktionskontrolle in mindestens zwei Vertiefungen auf der qRT-PCR-Platte eingeschlossen. Zur Bestimmung einer möglichen Kontamination im qRT-PCR-Prozess 5 µl nfH₂O wurde als negative qRT-PCR-Kontrolle eingeschlossen. Dann wurden 5 µl des gespikten SARS-CoV-2-Matrizenplasmids in eine einzelne Vertiefung als qRT-PCR-Positivkontrolle aufgenommen. Nach Zugabe von 5 &mgr;l jeder Probe in die dafür vorgesehene Vertiefung wurde die Platte mit einem optisch klaren Kunststoffsiegel verschlossen. Die Platte wurde für 1 min bei 2,000 × zentrifugiertg (1,000 U/min) bei 4 °C und dann in die qRT-PCR-Maschine (QuantStudio, Thermo Fisher Scientific) eingesetzt und der Lauf wurde parametrisiert. Signale für Fluorescein (FAM) und Carboxyrhodamin (ROX) wurden erfasst. ROX wurde zum Nachweis der internen MS2-Kontrolle und Fluorescein zum Nachweis von SARS-CoV-2-RNA verwendet. Der Assay wurde für 2 min bei 25 °C, 15 min bei 50 °C (für die reverse Transkriptase), 2 min bei 90 °C, vor 45 Zyklen von 95 °C für 3 s, gefolgt von 60 °C für 30 s durchgeführt . Die Ergebnisse wurden durch die Bestätigung korrekter Positivkontrollen (Amplifikation des Plasmids), Extraktions- und Amplifikationskontrollen aller Proben (ROX-Kanal), keine Amplifikation in den Negativkontrollen und konsistente Mittelwerte der Kontrollen bestimmt. Die SARS-CoV-2-Positivität wurde durch Amplifikation im Fluorescein-Kanal mit einer entsprechenden sigmoidalen Kurve mit einem CT-Wert von ≤36 bestätigt. Die CT-Werte von MS2 und MGB-Sonde 3 wurden beibehalten, um die Qualität und Reproduzierbarkeit des Assays zu verfolgen⁴⁴.

Programmierbares RNase H Schneiden für Nanoköder

Für die Nanoporen-Erkennung wurden SARS-CoV-2-RNA-Kontrollen, Nukleinsäureextrakte (Patientenproben) oder MS2-Virus-RNA weiter zum Nachweis mit Nanobait verwendet. Zuerst mischten wir Leitoligos mit der Probe und erhitzten sie für 70 min auf 5 °C. RNase H (5,000 Einheiten pro ml; NEB) wurde zugegeben, gemischt und für 20 min bei 37 °C erhitzt, damit das Enzym RNA in dem DNA:RNA-Hybrid schneiden kann, das die Ziel-RNA effektiv freisetzt. RNase H wurde durch 65-minütige Inkubation bei 10 °C thermisch inaktiviert. Leitoligos wurden unter Verwendung der NUPACK-Software dahingehend validiert, dass sie keine intramolekularen Strukturen, Homo- oder Heterodimere bilden⁴⁵. Für die Messung mit dem fehlenden Ziel wurde das gleiche Protokoll einschließlich Leit-Oligos verwendet. Die Kontrollmessungen zeigen keine Verdrängung, und daher können wir jede wesentliche Kreuzbindung von Leit-Oligos ausschließen.

Virale Zielsequenzeigenschaften für Nanoköder

Ziellänge, Toehold-Länge und GC-Gehalt wurden ausgewählt, um eine optimale Hybridisierung sicherzustellen²¹. Für die DNA-Nanobait-Designs wurden die Zielsequenzen so ausgewählt, dass sie in den konservierten Regionen eines viralen Genoms liegen und einen GC-Gehalt von 40–60 % aufweisen, um einen stabilen 20-bp-Duplex zu bilden. Die Toehold-Länge wurde so gewählt, dass sie 6 nt lang war und 40–60 % GC-Gehalt aufwies. Wir haben alle Sequenzen mit der NUPACK-Software (Webanwendung 2020) auf potenziell unerwünschte hochstabile intramolekulare Wechselwirkungen oder Homodimere getestet.⁴⁵. Dann führten wir eine Kreuzreaktivitätsprüfung zwischen mehreren Standorten durch, die in jedem Experiment verwendet wurden⁴⁵.

Präparation einer DNA-Blume für Nanoköder

Wir haben eine DNA-Blume als weiteres Etikett für den SARS-CoV-2-RNA-Nachweis aus den Patientenproben entworfen. Drei DNA-Blüten, die für jedes SARS-CoV-2-Ziel spezifisch sind (7-Wege-Verbindungen, 7WJa, 7WJb und 7WJc), wurden separat präpariert. Am Beispiel von 4WJc, 1 μM DNA-Strang J2, J3, J4 und JXNUMXc (Ergänzungstabelle 1) wurden in TM-Puffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl) gemischt₂, pH 8.0) und 90 min auf 5 °C erhitzt, dann 65 min auf 15 °C, 45 min auf 15 °C, 37 min auf 20 °C, 25 min auf 20 °C und schließlich auf 4 °C abgekühlt C für 20 min. Strang J4c wurde durch J4b ersetzt, um 7WJb herzustellen. Um bei 7WJa eine Selbstfaltung an Stelle 43 auf dem Nanoköder zu vermeiden, wurden J1, J2, J3, J4a und C43 vor dem Tempern miteinander vermischt.

Selbstorganisation von DNA-Nanoködern

Der DNA-Nanoköder wurde zusammengesetzt, indem linearisierte einzelsträngige M13-DNA (M13mp18, 7,249 nt, Guild Biosciences, 100 nM) mit kurzen komplementären Oligonukleotiden gemischt wurden¹² (von denen einige Referenzstrukturen und Einfangstränge enthielten) und durch Hinzufügen von teilweise komplementären Strängen, die für die Toehold-vermittelte Strangverdrängungsreaktion 3′-biotinyliert wurden. Die linearisierte M13-DNA (Länge 7,228 nt) wurde durch Oligonukleotide ergänzt, wodurch ein gekerbter doppelsträngiger Nanoköder mit zwei endständigen vier Desoxythymidin-Überhängen geschaffen wurde, die eine Multimerisierung verhindern¹². Die Mischung enthielt 20 nM linearisierte M13-DNA, 60 nM Oligonukleotide (dreifacher Überschuss gegenüber M13-DNA), 3'-biotinylierte Stränge in einer Konzentration von 180 nM, 10 mM MgCl₂ und 1 × TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0). Es wurde durch Pipettieren gemischt und zentrifugiert, bevor es für 70 s auf 30 °C erhitzt und über 45 min auf Umgebungstemperatur abgekühlt wurde. Überschüssige Oligonukleotide wurden unter Verwendung von Amicon Ultra 0.5 ml Zentrifugalfiltern mit 100 kDa Cutoff mit einem Waschpuffer (10.0 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM MgCl₂). Wurden DNA-Blüten als Markierung eingesetzt, wurden die partiell komplementären Stränge, die diese tragen, in 10 mM MgCl inkubiert₂ für 2 h bei Umgebungstemperatur, und anschließend wurde eine Amicon-Filtration wie oben beschrieben durchgeführt. Die Asymmetrie des Nanobait-Designs ermöglicht die eindeutige Identifizierung der Bindungsstellen. Der Nanoköder wurde bis zur Verwendung für weitere Experimente bei 4–10 °C in 0.5 mM MgCl gelagert₂, 10.0 mM Tris-HCl, pH 8.0. Das Nanobait-Design wurde vor jeder Messung durch Nanoporenauslesung überprüft.

Nanoporen-Auslesung von DNA-Nanoködern

Der Nanoköder wurde mit einer Probe (Nukleinsäureextrakt oder gereinigte virale Ziele im zehnfachen Überschuss) in 10 mM MgCl gemischt₂ und 100 mM NaCl. Die Mischung (5 &mgr;l) wurde bei Raumtemperatur (~10 min) inkubiert, bis sie für die Nanoporenmessung vorbereitet war. Der Unterschied in der Zusammensetzung der Zielsequenz und ihren physikalischen Eigenschaften könnte zu einer Variabilität bei der Hybridisierung und damit der Verdrängungseffizienz von Sensorstellen führen²¹. Wir haben htRNA (100 ng μl^-1; Invitrogen) als Hintergrund, wo angegeben, um zu zeigen, dass es keine unspezifischen Signale gibt, die durch menschliche native RNAs induziert werden. Für die Nanoporenmessung wurde die Probe auf <0.5 nM Nanobait verdünnt (für gereinigte virale Targets) oder 4.7 μl RNase-H-geschnittene Patientenprobe wurde mit 0.3 μl monovalentem Streptavidin (SAe1D3) gemischt¹⁸ (1 μM), 5 μl LiCl (4.0 M) und 5.0 μl LiCl (8.0 M). Wir haben 14 ± 3 nm (Mittelwert ± Standardabweichung) Nanoporen hergestellt¹² unter Verwendung von Quarzglaskapillaren mit 0.5 mm Außendurchmesser und 0.2 mm Innendurchmesser (Sutter-Instrument) durch laserunterstützten Puller P-2000 (Sutter-Instrument). Die Mischung wurde in einen Nanoporen-Polydimethylsiloxan-Chip pipettiert, und alle Messungen wurden bei einer konstanten Spannung von 600 mV durchgeführt. Details der Nanoporenmessung sind in der Ergänzungstabelle gezeigt 30.

Echtzeit-Nanoporen-Datenanalyse

Die Nanoporen-Datenanalyse wird ausführlich im ergänzenden Abschnitt erläutert 14. Kurz gesagt, Nanobait-Ereignisse wurden aus rohen Ionenstromspuren herausgefiltert, und dann wurde der Detektionsbereich bestimmt, und Informationen über das Vorhandensein der Spitze an jeder spezifischen Stelle wurden extrahiert. Die aufgetragene Verdrängungseffizienz wurde als Verdrängungseffizienz für eine Messung berechnet, die von einer Nicht-Target-Kontrolle für jeden Standort abgezogen wurde (50 Nanobait-Ereignisse für jede der drei Nanoporenaufzeichnungen), sofern nicht anders angegeben:

Wir haben überprüft, dass das Convolutional Neural Network QuipuNet²⁷ war in der Lage, Nanoporendaten nach dem beschriebenen Verfahren in Echtzeit zu analysieren. Zuvor haben wir gezeigt, dass wir bei etwa zehn Ereignissen ein Vertrauen von 99 % in einen positiven Nachweis unserer entworfenen DNA-Strukturen erreichen⁴⁶.

AFM-Bildgebung

Die AFM (Nanosurf Mobile S)-Bildgebung von Nanoködern wurde in Luft im berührungslosen Modus durchgeführt. Die Nanobait-Strukturen wurden auf 1 ng μl verdünnt^-1 in 1 mM MgCl₂ und 10 &mgr;l wurden zu frisch gespaltenem Glimmer gegeben, 1 min inkubiert, mit filtriertem Milli-Q-Wasser gespült und dann mit Stickstoff geblasen. Vor dem Scannen wurde die Glimmerplatte mit doppelseitigem Klebeband auf dem AFM-Probentisch befestigt. Bildvisualisierung und -analyse wurden mit Gwyddion (Version 2.60) durchgeführt.

statistische Analyse

Für alle Messungen wurden 99.9 % Konfidenzintervalle für die Verdrängungseffizienzen berechnet. Die statistische Signifikanz zwischen zwei Stellen ohne und mit dem Target wurde unter Verwendung eines zweiseitigen Student's getestet tDurch.

Berichtzusammenfassung

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie im Nature Portfolio-Berichtszusammenfassung mit diesem Artikel verlinkt.

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• Quelle: https://www.nature.com/articles/s41565-022-01287-x