Vật liệu

Amino polyetylen glycol-block-poly(axit lactic-co-glycolic) (NH₂-CỌC-b-PLGA), polyetylen glycol-block-poly(axit lactic-co-glycolic) (PEG-b-PLGA), carboxyl poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA-COOH) và cyclo(-RGDfC) (ký hiệu là RGD) được mua từ Quảng Châu Tansh-Tech Ltd., Trung Quốc. SPION được mua từ Nanoeast, Trung Quốc.

Chuẩn bị SPHN

Để điều chế SPHN, SPION được gói gọn trong lõi PLGA kỵ nước, sau đó phối hợp CDDP với các nhóm carboxyl trên bề mặt lõi PLGA và liên hợp RGD trong vỏ PEG. Tóm lại, NH₂-CỌC-b-PLGA (0.5 mg, 1 đương lượng), PEG-b-PLGA (2 mg, 4 eq), PLGA-COOH (2.5 mg) và SPION (2 mg) được phân tán trong 2 mL tetrahydrofuran (THF). Sau đó, dung dịch này được thêm vào 20 mL dung dịch đệm photphat (PBS, 1 mg/mL) và khuấy mạnh, sau đó khuấy qua đêm ở 35°C để loại bỏ THF. Sau đó, CDDP (2 mg) được bổ sung vào và khuấy dung dịch hỗn hợp này trong bóng tối ở 60°C trong 12 giờ. RGD bị ràng buộc với PEG theo công việc chuẩn bị SPHN trước đây của chúng tôi⁸. Sau đó, dung dịch SPHN được thẩm tách bằng PBS trong 48 giờ. Để chuẩn bị các hạt nano có nhãn huỳnh quang, Cy5-NHS đã được sử dụng để dán nhãn cho các hạt nano trước khi liên hợp RGD. Tóm lại, NH₂-CỌC-b-PLGA (0.5 mg, 1 đương lượng), PEG-b-PLGA (2 mg, 4 eq), PLGA-COOH (2.5 mg) và SPION (2 mg) được phân tán trong 2 mL tetrahydrofuran (THF). Sau đó, dung dịch này được thêm vào 20 mL dung dịch đệm photphat (PBS, 1 mg/mL) và khuấy mạnh, sau đó khuấy qua đêm ở 35°C để loại bỏ THF. Thêm CDDP (2 mg) vào và khuấy dung dịch hỗn hợp này trong bóng tối ở 60°C trong 12 giờ. Sau đó, 100 µL dung dịch Cy5-NHS (100 µg/mL) hòa tan trong DMSO được thêm vào và phản ứng ở 37°C trong 2 giờ. Cuối cùng, RGD bị ràng buộc với PEG theo công việc chuẩn bị SPHN trước đây của chúng tôi⁸. Dung dịch thu được được thẩm tách trong dung dịch PBS trong 48 giờ.

Đặc tính hóa lý của SPHN

Tán xạ ánh sáng động (DLS) và thế zeta được ghi lại bằng máy đo hạt Malvern. Các mẫu kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) được chuẩn bị bằng dung dịch SPHN (khoảng 0.05 mg/mL), sau đó, hình thái của SPHN được quan sát qua TEM. Hiệu suất tải của SPION và CDDP được ghi lại bằng phép đo khối phổ plasma kết hợp cảm ứng (ICP‒MS).

Đánh giá độ ổn định trong ống nghiệm

Độ ổn định của SPHN (0.5 mg/mL) được đánh giá trong PBS và độ phân tán trong 12 giờ được ghi lại bằng camera. Sau đó, dung dịch SPHN được pha loãng với PBS và đường kính của SPHN được ghi lại bằng DLS (0, 6 và 12 h).

Phát hành thuốc

Việc giải phóng CDDP từ SPHN được xác định bởi ICP‒MS. Tóm lại, 1 mL SPHN đã được thẩm tách với 9 mL PBS ở độ pH 7.4, 6.5 và 5.0. Sau đó, 1 mL dịch thẩm tách được thu thập tại thời điểm đã định để phân tích ICP‒MS.

Phát hiện các loại oxy phản ứng trong ống nghiệm (ROS)

Các tế bào ung thư biểu mô vòm họng ở người (tế bào CNE-1) được đặt trên các đĩa đồng tâm và được xử lý bằng PBS, NPs/CDDP (10 µg CDDP/mL), NPs/SPION (100 µg Fe₃O₄/mL) và SPHN (10 µg CDDP/mL, 100 µg Fe₃O₄/mL). 3 giờ sau, các tế bào được xử lý bằng tia X (XNUMX Gy), sau đó, nồng độ ROS trong tế bào ung thư được kiểm tra thông qua một bộ xét nghiệm các loại oxy phản ứng và được quan sát bằng kính hiển vi quét laser đồng tiêu (CLSM).

Xét nghiệm hình thành khuẩn lạc

Các tế bào CNE-1 trên các đĩa 6 giếng được xử lý bằng SPHN (5 µg CDDP/mL) trong 24 giờ và tiếp xúc với chiếu xạ tia X (3 Gy). Sau 7 ngày ủ thêm, các khuẩn lạc được cố định bằng 4% paraformaldehyde trong 15 phút. Sau đó, các khuẩn lạc được nhuộm bằng tím pha lê 0.1% và được ghi lại bằng đầu đọc đĩa AID vSpot Spectrum.

Phân tích apoptosis tế bào

Tế bào CNE-1 trên đĩa nuôi cấy 6 giếng được xử lý bằng PBS, tia X (3 Gy), SPHN (10 µg CDDP/mL) và SPHN (10 µg CDDP/mL) + tia X (3 Gy). Sau khi ủ thêm 24 giờ, tất cả các tế bào được thu thập, rửa bằng PBS ba lần, nhuộm màu bằng bộ apoptosis Phụ lục V-FITC / PI và sau đó được ghi lại thông qua phương pháp tế bào học dòng chảy (FCM).

Tác dụng chống ung thư kết hợp in vitro

Đánh giá hiệu quả xử lý in vitro của SPHN trên tế bào CNE-1 thông qua Bộ dụng cụ đếm tế bào-8 (CCK-8). Các tế bào CNE-1 được mạ trên các đĩa 96 giếng được xử lý bằng SPHN trong 12 giờ với nồng độ CDDP khác nhau (0-50 μg/mL) và được chiếu xạ bằng tia X (3 Gy). Sau khi ủ thêm 12 giờ, các tế bào CNE-1 được tiêm 5% CCK-8 trong 2 giờ. Sau đó, hiệu quả điều trị được theo dõi bằng máy đọc vi đĩa.

Đánh giá thiệt hại DNA

Các tế bào CNE-1 được gieo trên các đĩa đồng tiêu được xử lý bằng SPHN (10 µg CDDP/mL) trong 24 giờ và sau đó chiếu xạ bằng tia X (3 Gy). Mười hai giờ sau, các tế bào được cố định bằng 4% paraformaldehyde trong 15 phút, xử lý bằng Triton X-0.1 100% trong 20 phút, xử lý bằng 1% BSA trong 1 giờ và nhuộm bằng kháng thể γH2AX (Alexa Fluor® 488 Mouse anti- H2AX (pS319)) ở 4°C qua đêm. Cuối cùng, các tế bào được rửa bằng PBS ba lần, nhuộm bằng DAPI và sau đó chụp ảnh bằng CLSM.

Tây phương

Tế bào CNE-1 được gieo trên đĩa nuôi cấy 6 giếng được xử lý bằng tia PBS, tia X, SPHN và SPHN + với liều CDDP 10 µg/mL và liều bức xạ 3 Gy và ủ trong 24 giờ, rửa sạch. với PBS ba lần, ly giải bằng dung dịch đệm RIPA chứa chất ức chế phosphatase và protease trong 0.5 giờ và ly tâm ở tốc độ 12,000 vòng/phút ở 4°C trong 0.5 giờ. Các protein được thu thập và nồng độ của chúng được định lượng bằng xét nghiệm protein BCA. Các chất ly giải tế bào được phân tách bằng TRANG WEB SDS, được chuyển vào màng PVDF và được thử nghiệm với các kháng thể chính. Màng sau đó được thử nghiệm với các kháng thể thứ cấp chống lại H₂AX, γH₂AX và β-actin và được chụp ảnh sau khi dùng thuốc thử phát quang hóa học (ECL) tăng cường.

Giải trình tự phiên mã (RNA-Seq)

Các tế bào CNE-1, được mạ trong các đĩa nuôi cấy 6 giếng, được xử lý bằng PBS, SPHN, tia X và tia X SPHN + với liều CDDP là 10 µg/mL và liều bức xạ là 3 Gy. Sau 24 giờ chiếu xạ tia X, các tế bào được thu thập, thêm vào 1 ml TRIzol và gửi đến Ige Biotechnology, Ltd. (Quảng Châu, Trung Quốc), để chiết xuất và giải trình tự RNA. Hệ thống Illumina NovaSeq 6000 đã được sử dụng cho RNA-seq. Các mảnh trên mỗi kilobase trên một triệu mảnh được ánh xạ (FPKM) đã được sử dụng để phân tích mức độ biểu hiện gen.

Hiệu ứng nhắm mục tiêu trong cơ thể

Hiệu suất nhắm mục tiêu kép in vivo của SPHN được đánh giá ở chuột mang khối u CNE-1. Nhóm 1 và 2 được xử lý lần lượt bằng Cy5 không phải RGD và SPHN. Nhóm 3 được tiêm SPHN có nhãn Cy5 và sau đó được xử lý bằng từ trường trong 1 giờ. Hình ảnh in vivo được thực hiện trong hệ thống hình ảnh Kodak IS in vivo FX vào lúc 12 giờ sau khi dùng. Sau đó, tất cả những con chuột đều bị giết để thu hoạch các cơ quan và khối u chính để chụp ảnh ex vivo. Cuối cùng, các khối u được thu thập để chuẩn bị các phần parafin dày 12 μm, nhuộm màu xanh Phổ và quan sát qua kính hiển vi quang học.

Tác dụng hóa xạ trị in vivo

Chuột trụi lông BALB/c (4-5 tuần) được tiêm tế bào CNE-1. Mười ngày sau, những con chuột được điều trị bằng tia X PBS, CDDP +, SPHN, SPHN + X, từ trường SPHN+ (ký hiệu là SPHN(M)) và SPHN(M) + tia X vào Ngày 1, Ngày 3 và ngày 5 với liều CDDP 2 mg/kg. Vào Ngày 2, 4 và 6, các nhóm tia X CDDP +, tia X SPHN + và tia X SPHN(M) + được xử lý bằng tia X với liều chiếu xạ 3 Gy. Kích thước khối u và trọng lượng cơ thể được ghi lại trong 21 ngày.

Nhuộm hóa mô miễn dịch

Các khối u được thu thập và cố định trong 4% paraformaldehyd trong 48 giờ. Sau đó, các phần parafin dày 4 μm được chuẩn bị để nhuộm HE và quan sát hình thái tế bào của các mô khối u thông qua kính hiển vi quang học (Leica DMI6000 B). Với phương pháp tương tự, nhuộm HE các cơ quan chính của nhóm được điều trị bằng tia SPHN(M) + đã được thực hiện. Tám phần đông lạnh dày micromet đã được chuẩn bị để nhuộm TUNEL và γ-H2AX. Sau khi nhuộm bằng 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, huỳnh quang màu xanh), các tế bào được quan sát bằng CLSM.

Xét nghiệm sinh hóa máu

Các mẫu máu từ chuột được điều trị bằng PBS- hoặc SPHN được thu hoạch trong ống Eppendorf có heparin hóa. Các chỉ số chính, bao gồm alanine transaminase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), albumin (ALB), bilirubin toàn phần (TBIL), nitơ urê máu (BUN) và creatinine (Crea), được phát hiện bằng máy phân tích sinh hóa hoàn toàn tự động (Chemray). 800, Trung Quốc).

Hình ảnh cộng hưởng từ (MR) in vivo

Chuột trụi lông mang khối u CNE-1 được quét bằng máy quét MR (Fov: 45 × 45, độ dày: 1 mm, ma trận: 224 × 221, lát: 12, TE: 600 ms, TR: 1200, voxel: 0.2 × 0.203 ). Với phương pháp tương tự, việc thu nhận tín hiệu MRI do SPHN tạo ra ở vùng khối u được thực hiện sau khi điều trị bằng SPHN (50 µL, 10 µg SPION/mL).

• Phân phối nội dung và PR được hỗ trợ bởi SEO. Được khuếch đại ngay hôm nay.
• EVM tài chính. Giao diện hợp nhất cho tài chính phi tập trung. Truy cập Tại đây.
• Tập đoàn truyền thông lượng tử. Khuếch đại IR/PR. Truy cập Tại đây.
• PlatoAiStream. Thông minh dữ liệu Web3. Kiến thức khuếch đại. Truy cập Tại đây.
• nguồn: https://www.nature.com/articles/s41427-023-00484-x