Cell kultur

Bruna adipocyter differentierades från en odödlig brun preadipocyt-muscellinje från B. Spiegelman (Harvard University) som tidigare beskrivits¹⁹. Preadipocyter bibehölls och expanderade vid låg konfluens (<50%) i ett tillväxtmedium (Dulbeccos modifierade Eagles medium, hög glukos (Gibco), kompletterat med 20% fetalt bovint serum (Sigma-Aldrich), 20 mM HEPES (Sigma-Aldrich) och 100 U ml^-1 penicillin-streptomycin (Gibco)). För differentiering tvättades preadipocyter två gånger med fosfatbuffrad lösning (PBS) (Gibco, pH 7.4, 1×), dissocierades med TrypLE Express och såddes vid en densitet av cirka 23,000 XNUMX celler cm.^-2 i tillväxtmediet. Mediet byttes efter 24 timmar till ett differentieringsmedium (Dulbeccos modifierade Eagles medium, högt glukos, kompletterat med 10 % fetalt bovint serum, 20 nM insulin, 1 nM trijodtyronin och 100 U ml^-1 penicillin-streptomycin) och cellerna odlades i 2 dagar. Celldifferentiering inducerades sedan genom tillsats av ett induktionsmedium (differentieringsmedium kompletterat med 0.125 mM indometacin, 0.5 μM dexametason och 0.5 mM isobutylmetylxantin) under 2 dagar, varefter mediet byttes till differentieringsmediet under ytterligare två dagar. Differentierade adipocyter tvättades en gång med ett svältmedium (Dulbeccos modifierade Eagles medium, lågglukos (Gibco), kompletterade med glukos till en slutlig koncentration av 8 mM, 0.5 % bovint serumalbumin (Sigma-Aldrich) och 100 U ml^-1 penicillin–streptomycin) och inkuberades i 2 timmar i svältmediet före behandling med insulin NanoRods eller NanoRods utspädda i svältmediet under de tider som anges i huvudtexten. Efter behandling tvättades cellerna en gång i PBS och skördades för isolering av protein för immunoblots eller RNA för genuttryck. För IR-analys med DNA-PAINT differentierades preadipocyter såsom beskrivits ovan med följande modifieringar. Efter behandling med induktionsmediet dissocierades cellerna med TrypLE Express och såddes i differentieringsmediet i μ-Slide 18 Wells Glass Bottom-brunnar (ibidi). Efter 2 dagar inkuberades cellerna med svältmediet under 2 timmar följt av behandling med 10 nM insulin i svältmediet under 10 min. I kontrollexperiment uteslöts tillsatsen av insulin. Före behandling analyserades differentierade adipocyter visuellt för att bedöma cellyttätheten och för att utvärdera differentieringen av celler, och fördelades sedan slumpmässigt till behandlings- och kontrollgrupperna.

Cellerna hölls, expanderade och differentierades i en fuktad atmosfär innehållande 5% CO₂ vid 37°C.

DNA-PAINT av IR

Differentierade adipocyter fixerades i 12 minuter vid rumstemperatur (RT) med förvärmd 4% paraformaldehyd i PBS, tvättades tre gånger med PBS, blockerades i 90 minuter vid RT med en blockerande lösning (3.0% fetalt bovint serum/0.1% Triton X -100 i PBS) och inkuberades med kanin anti-IR β-antikropp (Cell Signaling (4B8); 1:300 utspädning i blockeringslösningen) i 2 dagar vid 4 °C. Cellerna tvättades sedan tre gånger med PBS och inkuberades med nanokroppen FluoTag-XM-QC anti-kanin IgG (Massive Photonics) utspädd 1:200 i en blockerande buffert (Massive Photonics) under 1 timme vid RT. Efter tre tvättar med PBS inkuberades cellerna med 80 nm guldnanopartiklar (Sigma-Aldrich; 1:5 spädning i blockeringsbufferten) i 10 minuter. Cellerna tvättades en gång med PBS och inkuberades med 5 nM Cy3b-märkta strängar (Massive Photonics) utspädda i en bildbuffert (Massive Photonics).

Avbildningen utfördes på ett Nikon ECLIPSE Ti-E-mikroskop med ett Perfect Focus-system (Nikon Instruments), med användning av en total internreflektionsfluorescenskonfiguration av objektivtyp med användning av en iLAS2 cirkulär total internreflektionsfluorescensmodul (Gataca Systems) med en oljedoppning 1.49-numerisk bländare CFI Plan Apo total intern reflektion fluorescens ×100 objektiv (Nikon Instruments) utrustad med ×1.5 extra Optovar-förstoring motsvarande en slutlig pixelstorlek på 87 nm. Lasern som användes var en OBIS 561 nm LS 150 mW (Koherent) med anpassad iLas ingångsstråleexpansionsoptik (Cairn) optimerad för reducerad fältupplösning med superupplösning. Den fluorescerande ljusstrålen leddes först genom en filterkub (89901, Chroma Technology) innehållande ett excitationsfyrbandsfilter, ett fyrbandigt dikroiskt filter och ett fyrbands emissionsfilter (ZET405/488/561/640x, ZET405/488/561/640bs och ZET405bs /488/561/640m, Chroma Technology). Fluorescensljus spektralfiltrerades sedan med ett emissionsfilter (ET595/50m, Chroma Technology) och avbildades på en iXon Ultra 888 elektronmultiplicerande laddningskopplad enhetskamera (Andor). Micro-Manager programvara v. 1.4 användes för att förvärva 12,000 10 ramar med 130 MHz avläsningsram, XNUMX ms exponering och ingen elektronmultiplikationsförstärkning. Totalt tio celler från tre oberoende experiment avbildades i varje tillstånd (Tilläggsanmärkning och tilläggsbild. 1).

INS-DNA produktion och rening

Insulin (Merck, 1 mg ml^-1) omsattes med dibensocyklooktyn-sulfo-N-hydroxisuccinimidylester (DBCO-sulfo-NHS, Click Chemistry Tools; 690 µM) i 100 mM Na₂CO₃ buffert (pH 11.5) under 20 minuter vid RT. Reaktionen avbröts sedan under 5 min genom tillsats av Tris-bas (Sigma-Aldrich, 100 mM). Lösningen tvättades tre gånger med 400 ul 100 mM Na₂CO₃ använda Amicon Ultra 0.5 ml centrifugalfilterenheter med ett 3 kDa cut-off membran (Merck). Vid varje tvättsteg centrifugerades kolonnerna i 10 minuter vid 14,000 XNUMX xg. Efter det sista tvättsteget blandades insulin-DBCO (690 µM) med azidmodifierat DNA (Biomerer, 35 µM; Kompletterande tabell 3100 mM Na₂CO₃ och lämnades att reagera i 3 timmar vid RT. Reaktionen avbröts genom tillsats av NaN₃ (Sigma-Aldrich, 6.9 mM). Proverna kördes på en naturlig polyakrylamidgel (6 % 19:1 polyakrylamid i 1× TAE, 20 min, 200 V, TAE löpbuffert) och färgades med SYBR Gold (Thermo Fisher) enligt tillverkarens instruktioner, för att bekräfta INS- DNA-bildning. Avbildningen utfördes med hjälp av en ImageQuant LAS 4000 gelbildapparat. Insulin-DBCO-sulfo-NHS-konjugeringsprotokollet optimerades för att främja bindningen av ssDNA-oligon till lysin-29 i B-kedjan (B29-lysin) jämfört med amingrupperna vid N terminalen av insulin A- och B-kedjor. pKa-värdet för B29-aminen är högre än för aminerna hos de två N termini (11.2 mot 8.6 och 6.8). Vid högt pH förutsägs NHS-gruppen i tvärbindaren företrädesvis reagera med den mest grundläggande amingruppen, som är B29-lysinaminen³². Därför optimerades pH-reaktionsbetingelserna för att främja en enda INS-DNA-produkt.

INS-DNA-reaktionsblandningar renades med en omvänd fas högpresterande vätskekromatografi C₁₈ kolumn (Agilent Poroshell 120 EC-C₁₈) på en Amersham Pharmacia Biotech ÄKTA Ettan LC. Buffert A (50 mM trietylaminacetat) och buffert B (90 % acetonitril och 10 % buffert A) användes i en gradientprofil, i vilken procenten buffert B ökades från 30 % till 50 % under 20 minuter. Fraktioner samlades upp och centrifugerades på en vakuumkoncentrator (Thermo Scientific SpeedVac Savant DNA 120) under 30 minuter vid hög värme för att avlägsna de flyktiga komponenterna i de högpresterande vätskekromatografibuffertarna. Utvalda toppar buffertbytes till PBS med Amicon Ultra 0.5 ml centrifugalfilterenheter med ett 3 kDa cut-off membran (Merck), genom att snurra tre gånger i 10 minuter vid 14,000 XNUMX ×g och tvättning varje gång med 400 ul PBS. Prover av renade fraktioner kördes på en naturlig polyakrylamidgel och färgades med SYBR Gold (Thermo Fisher) för att visualisera det renade INS-DNA. Den slutliga renheten hos konjugat analyserades för varje beredning via tre metoder: jämförelse av silverfärgningsbandintensiteter (Pierce Silver Stain Kit) på natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (Invitrogen, 4–12 % Bolt gel) mot insulinstandarder (Merck) , jämförelse av SYBR Gold-bandintensitet på nativ polyakrylamidgelelektrofores mot DNA-standarder (Integrated DNA Technologies) och genom Qubit ssDNA Assay Kit (Qubit 4 Fluorimeter, Invitrogen). Slutliga koncentrationer av INS-DNA beräknades baserat på Qubit ssDNA-mätningar. Renat INS-DNA frystes och förvarades vid -20 ° C tills vidare användning.

Tillverkning av NanoRods och insulin NanoRods

Origamistrukturer framställdes genom att blanda ställningsplasmid-DNA (p7560, Tilibit, 10 nM) med lämpliga stapelsträngar (Integrated DNA Technologies, 100 nM) (kompletterande tabeller 4-9) i en vikningsbuffert (5.0 mM Tris vid pH 8.5 (Sigma-Aldrich), 1.0 mM EDTA (Panreac AppliChem) och 12.5 mM MgCl₂ (Sigma-Aldrich)). Blandningen placerades sedan i en termocykler (MJ Research PTC-225 Gradient Thermal Cycler) och glödgades genom upphettning till 80.0 °C i 5 minuter, kylning till 60.0 °C vid 1.0 °C per minut under 20 minuter och sedan långsam kylning till 20.0 °C vid 0.5 °C per min. Överskott av häftklamrar avlägsnades med Amicon Ultra 0.5 ml centrifugalfilterenheter med ett 100 kDa cut-off membran (Merck) genom att snurra fem gånger under 2 minuter vid 14,000 XNUMX×g och tvättning varje gång med 400 µl av vikningsbufferten. Koncentrationen av den renade strukturen bestämdes genom att mäta DNA-absorbansen vid 260 nm (Thermo Scientific NanoDrop 2000). Renat INS-DNA tillsattes sedan i 3× stökiometriskt överskott till tillgängliga utökade strängbindningsställen på NanoRod-strukturen och härdades i en termocykler genom uppvärmning till 37.0 °C i 1 timme, kylning till 22.0 °C med 0.1 °C per minut, inkubering vid 22.0 °C i 14 timmar och kylning till 4.0 °C vid 0.1 °C per min. Obundet INS-DNA avlägsnades med användning av Amicon Ultra 0.5 ml centrifugalfilterenheter med ett 100 kDa cut-off membran (Merck), som snurrade fem gånger under 2 minuter vid 14,000 XNUMX ×g och tvättning varje gång med 400 µl PBS + 10 mM MgCl₂. Insulin NanoRods förvarades vid 4 °C tills vidare användning.

Agarosgelelektrofores

NanoRod-strukturer analyserades genom att köra prover på agarosgeler på is i 4 timmar vid 70 V. Geler bestod av 2 % agaros (Thermo Scientific TopVision Agarose) i 0.5× TBE-buffert (Panreac AppliChem) plus 10 mM MgCl₂ (Sigma-Aldrich) och 1× SYBR Safe DNA-färgning (Invitrogen). Avbildningen utfördes med hjälp av en ImageQuant LAS 4000 gelbildapparat.

Dynamisk ljusspridning

NanoRod och insulin NanoRod-prover preparerades i PBS + 10 mM MgCl₂spruta filtrerades med användning av 0.1 µm membran (Merck) och analyserades på ett Zetasizer Ultra-instrument (Malvern Panalytical). Tre mätningar gjordes vid 25 °C i en cell med låg volym (ZSU1002) och medelvärdet beräknades sedan.

oxDNA-simulering av NanoRod

NR-, NR-1-, NR-2-, NR-4-, NR-7- och NR-15-strukturer analyserades med oxDNA grovkornig modellering (https://oxdna.org/). NanoRod-strukturer med dsDNA-strängar som sträcker sig från ställena för insulininkorporering skapades med vHelix och konverterades till oxDNA-formatet med tacoxDNA-webbplatsen (http://tacoxdna.sissa.it/). Strukturer lämnades till oxDNA.org webbserver för simulering vid 37 °C, med 1 som saltkoncentration, 1 × 10⁸ tidssteg med annonst värde på 0.0001 och ett preliminärt avslappningssteg med standardparametrarna. Simuleringar visualiserades och videor gjordes med hjälp av verktyget oxView (https://oxdna.org/).

Negativt färgande TEM

Renade NanoRods (10 nM) dispenserades på ett glöd-urladdat kol-understödd koppar TEM-galler (TEM-CF200CU50, Thermo Fisher Scientific) och inkuberades i 60 s innan lösningen avlägsnades. Gallren färgades sedan under 10 s med 5 ul 2% vikt/volym uranylformiat, som därefter avlägsnades. Färgningsproceduren upprepades sju gånger och TEM-näten lufttorkades i 30 minuter före avbildning. Avbildning utfördes på en Talos 120C G2 (120 kV, Ceta-D-detektor) vid × 92,000 1.53 för närfältsvyer. Råbilder bearbetades med hjälp av programvaran ImageJ (vXNUMX).

AFM

NanoRod-strukturer avbildades på en skiva av glimmer fäst med epoxilim till mitten av ett mikroskopobjektglas och omslöts av en plastring fäst vid objektglaset med Reprorubber. Nanostrukturer späddes till 1 nM i TE-Mg-buffert (5 mM Tris-bas, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl₂8.0 ul pipetterades på nyklyvd glimmer. Efter 10 s, 30 µl 4 mM NiSO₄ tillsattes och inkuberades i ytterligare 4.5 min. Ytan sköljdes sedan med 1.0 ml 0.1 µm-filtrerad TE-Mg-buffert, varefter 1.5 ml filtrerad TE-Mg-buffert tillsattes till glimmerskivan för avbildning. Avbildning utfördes i vätska med ett JPK Instruments NanoWizard 3 Ultra atomic force-mikroskop med en Bruker AC40 fribärande i AC-läge.

DNA-PAINT av insulin NanoRod nanostrukturer

µ-Slide 18-brunnars glasbotten (ibidi) rengjordes med isopropanol och torkades med N₂. Brunnarna inkuberades med 1 mg ml^-1 Biotin bovint serumalbumin (Thermo Fisher) i buffert A (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl och 0.05 % (v/v) Tween 20 vid pH 8.0) i 5 minuter vid RT, tvättad tre gånger med buffert A och inkuberad med 0.5 mg ml^-1 neutravidin (Thermo Fisher) i buffert A under 5 min vid RT. Brunnarna tvättades sedan tre gånger med buffert A följt av tre tvättar med buffert B (5 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂1 mM EDTA och 0.05 % (volym/volym) Tween 20 vid pH 8.0). Sedan, 500 pM NanoRods som innehåller fyra biotinmärkta DNA-strängar (Utökad data Fig. 2a), med INS-DNA innehållande en PAINT-dockningssekvens på 9 nukleotider (DS1; tilläggstabell 3(Na5S1), sattes till varje brunn under 647 min. Brunnarna tvättades tre gånger med buffert B. Därefter, 1 nM av Atto-XNUMXN avbildarsträng (ISXNUMX; kompletterande tabell 10Till varje brunn sattes i buffert B kompletterat med syrefångare (protokatekusyra (Sigma), protokatekuat 3,4-dioxygenas (Sigma) och Trolox (Sigma)). För PAINT med dubbla utbyten, tre dockningssekvenser (DS2; tilläggstabell 10) lades till på båda ändarna av NanoRods. Prover preparerades som tidigare beskrivits, varvid brunnarna tvättades tio gånger med buffert B mellan varje bildtagning. Varje bildåtervinning gjordes med en annan Atto-647N imager-sträng (IS1 och IS2; tilläggstabell 10). Micro-Manager programvara användes för att förvärva 9,000 10 bildrutor med 200 MHz avläsningsram, XNUMX ms exponering och ingen elektronmultiplikationsförstärkning (Tilläggsanmärkning och kompletterande figurer. 2 och 3).

SPR

Ett Biacore T200-instrument (Cytiva) användes för att utföra SPR-experimenten och data insamlades med hjälp av Biacore T200 systemkontrollprogramvara v. 2.01. Biotinylerad ECD-IR (Nordic BioSite) immobiliserades på en streptavidin Sensor Chip SA (Cytiva). HBS-P+-buffert (Cytiva) användes som löpbuffert. Efter immobiliseringen av ECD-IR infördes en stabiliseringstid på 15 minuter för att nå en stabil baslinje. NR-1, NR-2, NR-4, NR-7, NR-15, NR-8 och NR-8dsDNA injicerades vid 11.4 nM koncentration av insulin i löpbufferten. Insulin och INS-DNA injicerades vid 55 nM, den lägsta koncentrationen för att erhålla en bindningskurva som kunde analyseras. NR injicerades som en negativ kontroll vid en koncentration lika med den högsta koncentrationen av NanoRod som användes i insulin NanoRod-injektioner (NR-1 = 11.4 nM). Alternativt injicerades NR-2, NR-4, NR-7 och NR-15 vid 5.7 nM koncentration av nanostruktur (Utökad data Fig. 4e) och NR-7^K-PEG injicerades också en 50 nM koncentration av insulin (Utökad data Fig. 9c). Injektionen av varje prov utfördes med en associationsfas på 180 s och en dissociationsfas på 300 s. Dissociationsjämviktskonstanten (K_D), associationshastighetskonstant (k_on) och dissociationshastighetskonstant (k_sänkt3.0-programvaran. De t_1/2 värden, som definierar uppehållstiden, bestämdes med formeln ln2/k_sänkt. För att jämföra bindningen av NR-7-strukturer mellan IR och IGF1R immobiliserades ECD-IR- och ECD-IGF1R-proteiner (Nordic BioSite) på två olika flödesceller av ett CM5-sensorchip via aminkopplingsreaktioner, enligt tillverkarens instruktioner. Bindningen av insulin och INS-DNA testades genom att injicera olika koncentrationer av insulin (6.2, 18.5, 55.6, 166.7 och 500.0 nM) i löpbufferten (HBS-P+) i kinetisk enkelcykelmod, med användning av en associationsfas av 140 s och en dissociationsfas på 300 s. Bindning av NR-7 testades genom att injicera en enda strukturkoncentration (11.4 nM insulin) med användning av en associationsfas på 180 s och en dissociationsfas på 300 s.

Coomassie gel

Här återsuspenderades 0.5 µg rekombinant ECD-IR (Nordic BioSite) i Laemmli provbuffert (Bio-Rad). För reducerande betingelser tillsattes 2-merkaptoetanol till en slutlig koncentration av 2.5 %. Proverna denaturerades vid 80 °C i 10 minuter, löstes upp genom natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores och färgades med GelCode Blue säker proteinfärgning (Thermo Fisher Scientific).

Gelskiftanalys

NanoRods (NR och NR-7) vid 20 nM inkuberades med 300 nM rekombinant extracellulär domän av human IR (Nordic BioSite) eller med PBS i 30 minuter vid 4 °C. Proverna kördes sedan på en 2% agarosgel och färgades med SYBR Safe.

immunoblotting

Cellerna tvättades med PBS, lyserades i radioimmunutfällningsanalysbuffert (Sigma-Aldrich) kompletterad med proteas- och fosfatasinhibitorcocktail (Thermo Fisher Scientific) och inkuberades på is under skakning i 30 minuter. Lysatet rensades genom centrifugering (20,000 XNUMX xg under 20 minuter vid 4°C) och proteinlysaten kvantifierades med användning av Bradford-proteinanalysen (Bio-Rad). Proteinlysat återsuspenderades i Laemmli-provbufferten (Bio-Rad) innehållande 2.5% 2-merkaptoetanol, denaturerades vid 80 °C i 10 minuter, löstes upp genom natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores och överfördes till polyvinylidenfluoridmembran. Membran inkuberades 1 timme i en blockerande lösning (Tris-buffrad saltlösning med 0.1 % Tween 20 (TBST) och 5.0 % fettfri torrmjölk), följt av inkubation över natten vid 4 °C med primära antikroppar mot fosfo-IR beta/IGF1R beta (CST 3024, 1:1,000 473), fosfo-AKT-S4058 (CST 1, 1,000:1 987) eller GAPDH (Invitrogen PA1-5,000, 31460:1 5,000). Efter tre tvättar med TBST inkuberades membranen med pepparrot-peroxidas-konjugerade sekundära antikroppar (Invitrogen, 1, XNUMX:XNUMX XNUMX) under XNUMX timme vid RT. Detektion av pepparrotsperoxidas utfördes med kemiluminescerande substrat Immobilon Forte på ett ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad). Banddensiometri utfördes med hjälp av programvaran ImageJ.

Flödescytometri

Differentierade, serumsvältade adipocyter framställdes såsom beskrivits ovan. Adipocyter tvättades därefter två gånger med Hanks balanserade saltlösning (HBSS) och dissocierades i kollagenas D-lösning (1.5 U ml)^-1 kollagenas D (Roche) och 10 mM CaCl₂ i HBSS) i 20 minuter vid 37 °C. Cellerna återsuspenderades i HBSS, filtrerades genom en 35 µm HBSS-ekvilibrerad cellsil (BD Biosciences), pelleterad vid 300×g under 5 min och återsuspenderades i en färgningsbuffert (1 x PBS och 1 % bovint serumalbumin). De döda cellerna märktes med LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific) enligt tillverkarens instruktioner, och därefter pelleterades cellsuspensionen vid 300×g under 5 min och återsuspenderades i färgningsbufferten. Här inkuberades ~100,000 10 celler med 647 nM ATTO-100-märkta NanoRod-strukturer i en slutlig volym på 10 µl under 37 minuter vid 300 °C. Cellerna inkuberade utan NanoRod-strukturerna användes som den obehandlade kontrollen. Cellerna tvättades sedan två gånger med färgningsbufferten genom centrifugering vid XNUMXxg i 5 min. Flödescytometrimätningar utfördes på en BD FACSCANTO II med programvaran BD FACSDIVA v. 9.0 (BD Biosciences). Levande adipocytceller identifierades initialt genom gatingceller på FSC-A mot AmCyan-A, följt av gating på FSC-A mot FSC-H för att detektera singletter. De insamlade data analyserades med hjälp av programvaran FlowJo 10.7.1 (BD Biosciences). Det geometriska medelvärdet av fluorescensintensiteten efter normalisering till den obehandlade kontrollen användes för att definiera graden av cellmärkning av NanoRods.

Beredning och sekvensering av RNA-seq-bibliotek

Det totala RNA:t isolerades från differentierade adipocyter med hjälp av Quick-RNA Microprep Plus Kit (Zymo Research), och 500 ng renat RNA användes för mRNA-seq-biblioteksberedning med TruSeq RNA Library Prep Kit v2 enligt tillverkarens lågprovsprotokoll. Bibliotekskvantifiering utfördes med hjälp av QuantiFluor dsDNA-systemet (Promega) enligt tillverkarens flerbrunnsplattprotokoll på en Varioskan LUX multimode mikroplattläsare (Thermo Fisher). Bibliotekets storlek och kvalitet bedömdes med hjälp av Bioanalyser 2100 och High Sensitivity DNA Kit (Agilent). Bibliotek denaturerades och späddes ut med hjälp av NextSeq standardnormaliseringsprotokoll (Illumina), och sekvensering utfördes med enkeländsavläsningar (1 × 75 bp) med NextSeq 500/550 High Output Kit v. 2.5 (75 cykler) på en NextSeq 550-plattform ( Illumina).

RNA-seq kvantifiering, DEG-analys och GSEA

Sekvensavläsningar kartlades mot ett referenstranskriptom av musculus proteinkodande transkriptsekvenser (frisättning M29, GRCm39; https://www.gencodegenes.org/mouse/) och kvantifieras med användning av Salmon 1.7.0 (ref. ³³). Räknetabeller genererades med paketet tximport³⁴ och listor över DEG erhölls med hjälp av DESeq2-paketet (v. 1.34.0)³⁵, där endast gener med justerade P värden lika med eller under 0.001 och en log₂veckändringsgräns vid ±0.58 övervägdes för ytterligare analys. Värmekartor och UpSet-diagram genererades med ComplexHeatmap (v. 2.10.0)³⁶. GSEA för biologiska processer med både genontologitermer och KEGG-vägar utfördes med hjälp av en rankad lista över gener som input till clusterProfiler (v. 4.2.2)³⁷ och en betydelse av falsk-upptäckt-grad-justerad P värden under 0.10 respektive 0.05.

Zebrafisk mikroinjektioner och fri glukoskvantifiering

NanoRod och insulin NanoRods blandades med oligolysin-PEG (K₁₀-PINNE_5K, Alamanda Polymers) i ett förhållande på 1:1 mellan aminerna i lysiner i K₁₀-PINNE_5K och fosfaterna i DNA³⁰och inkuberades vid RT i 30 minuter före en mikroinjektion av 2 nl av provet i varje zebrafisklarv. Proverna för injektion preparerades med en slutlig koncentration av 100 nM strukturer för de belagda NanoRod-proverna och vid en slutlig koncentration av 100 nM insulin för de belagda insulin NanoRod-proverna (motsvarande 100.0 och 14.3 nM NanoRods för NR-1^K-PEG och NR-7^K-PEG, respektive). Injektion av 1 nl humant insulin vid 100 nM koncentration i zebrafisklarver har visat sig inducera en minskning av nivåerna av fritt glukos och transkriptionsförändringar i överensstämmelse med insulinsignalering³⁸. Vi injicerade därför 2 nl av 100 nM insulinkoncentration i våra analyser för att utvärdera de insulinmedierade effekterna på fria glukosnivåer. Eftersom den totala blodvolymen för en 2 dpf zebrafisk är 60–89 nl (ref. ³⁹), skulle den uppskattade koncentrationen av det injicerade insulinet i våra analyser vara cirka 2–3 nM. I dessa analyser var vi också begränsade i mängden prov som injicerades, med högre injektionsnivåer (3 och 4 nl) vilket resulterade i dålig larveröverlevnad.

Underhåll och korsning av zebrafisk (D. rerio) linjer genomfördes i enlighet med svensk lagstiftning om djurskyddsbestämmelser godkänd av Stockholms djurförsöksetiska nämnd. Eftersom endast djur yngre än 5 dagar användes för β-cellablation och fri glukosanalys, krävdes inget etiskt tillstånd enligt 2010/63/EU. Transgena zebrafisklinjer som används har tidigare beskrivits, nämligen Tg(ins:GFP-NTR)^s892 (Ref. ²⁷) Och Tg(ins:Kaede)^s949 (Ref. ²⁸).

Ablation av β-celler utfördes i två dagar gamla Tg(ins:GFP-NTR) Och Tg(ins:GFP-NTR);Tg(ins:Kaede) embryon genom behandling med 10 mM MTZ (Sigma-Aldrich) utspädd i 1% DMSO (VWR) i en äggvattenlösning (E3) kompletterad med 0.2 mM 1-fenyl-2-tiourea (PTU, Acros Organics) i 24 timmar. Efter β-cellablation, tre dagar gammal Tg(ins:GFP-NTR) larver (72 hpf) sövdes i 0.01 % trikain och injicerades med 2 nl 1× PBS, omodifierat insulin eller belagda NanoRod/insulin NanoRods i den gemensamma kardinalvenen (kanalen hos Cuvier)⁴⁰. Fenolrött (Sigma-Aldrich) till en slutlig koncentration av 0.1 % sattes till PBS, insulin eller belagt insulin NanoRod-prover för att underlätta visualiseringen av mikroinjektionsprocessen och bestämning av framgångsrikt injicerade larver. Zebrafisklarver tilldelades slumpmässigt till behandlingsgrupperna. Fri glukosnivåer mättes såsom beskrivits på annat ställe⁴¹ med användning av ett fluorescensbaserat enzymatisk kit (BioVision). Grupper om tre till sex injicerade larver användes per tillstånd/replikat.

Konfokal bildbehandling

Tg(ins:GFP-NTR);Tg(ins:Kaede)-ablerade larver samlades in 24 timmar efter ablationsbehandling, sövdes och injicerades enligt det tidigare angivna protokollet och fixerades i 4% paraformaldehydlösning innan β-cellsantal analyserades med konfokal avbildning. De konfokala bilderna togs med ett Leica TCS SP8-mikroskop och programvaran LAS X (v. 3.5.5.19976). De primära bukspottkörtelöarna i β-cell-ablerade Tg(ins:GFP-NTR);Tg(ins:Kaede) larver skannades med ett × 40 vatten-immersion objektiv och z stackar analyserades med hjälp av Fiji-mjukvara (v1.53). Alla visade bilder erhölls från samma experiment och deras kontrastvärden justerades för visualiseringsändamål. Kvantifieringen av β-celler utfördes på ursprungliga omodifierade bilder.

Statistisk analys

Inga statistiska metoder användes för att förbestämma urvalsstorlekarna, men urvalsstorlekarna liknade de som rapporterats i tidigare publikationer^28,38,42. Cellkulturprover och djur tilldelades slumpmässigt till kontroll- och behandlingsgrupperna. Datainsamling och analys utfördes inte blind för experimentens förhållanden. Individuella datapunkter plottas för de flesta grafer. Provstorlek (n) av antalet experimentella biologiska upprepningar och de använda statistiska metoderna anges i motsvarande figurförklaringar. Datauppsättningar testades för Gaussisk distribution följt av lämpligt statistiskt test. Statistisk analys och grafisk representation av data bearbetades med GraphPad Prism 9.4.0. Tvåsidigt Mann-Whitney-test utfördes för att jämföra klusteregenskaperna mellan kontrollceller och insulinbehandlade celler. För western blot-kvantifieringar utfördes envägsvariansanalys (ANOVA) följt av Dunnetts multipla jämförelsetest. För kvantifiering av β-celler utfördes Kruskal-Wallis-testet följt av Dunns multipla jämförelsetest. Analysen av fria glukosvärden utfördes med användning av envägs ANOVA med Tukeys multipla jämförelsetest.

Rapporteringsöversikt

Ytterligare information om forskningsdesign finns i Sammanfattning av naturportföljrapportering länkad till den här artikeln.

• SEO-drivet innehåll och PR-distribution. Bli förstärkt idag.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. Styrka dig själv. Tillgång här.
• PlatoAiStream. Web3 Intelligence. Kunskap förstärkt. Tillgång här.
• Platoesg. Kol, CleanTech, Energi, Miljö, Sol, Avfallshantering. Tillgång här.
• PlatoHealth. Biotech och kliniska prövningar Intelligence. Tillgång här.
• Källa: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01507-y