Upptäckten under Human Genome Project i början av 2000-talet att vi människor bara har cirka 20,000 XNUMX proteinkodande gener – ungefär lika många som den lilla jordlevande nematodmasken och mindre än hälften så många som risplantan – kom som en chock . Det slaget mot vår stolthet mildrades dock av tanken att det mänskliga genomet är rikt på regulatoriska kopplingar. Våra gener samverkar i ett tätt nätverk, där bitar av DNA och molekylerna de kodar för (RNA och proteiner) styr "uttrycket" av andra gener, vilket påverkar om de gör sina respektive RNA och proteiner. För att förstå det mänskliga genomet behövde vi förstå denna process av genreglering.

Den uppgiften har dock visat sig vara mycket svårare än att avkoda genomets sekvens.

Till en början misstänkte man att genreglering var en enkel fråga om att en genprodukt fungerade som en på/av-brytare för en annan gen, på digitalt sätt. På 1960-talet förtydligade de franska biologerna François Jacob och Jacques Monod för första gången en genreglerande process i mekanistisk detalj: In Escherichia coli bakterier, när ett repressorprotein binder till ett visst segment av DNA, blockerar det transkriptionen och translationen av en intilliggande uppsättning gener som kodar för enzymer för att smälta sockret laktos. Denna regleringskrets, som Monod och Jacob döpte till lac operon, har en snygg, transparent logik.

Men genreglering i komplexa metazoer - djur som människor, med komplexa eukaryota celler - verkar i allmänhet inte fungera på detta sätt. Istället involverar det ett gäng molekyler, inklusive proteiner, RNA och bitar av DNA från hela en kromosom, som på något sätt samarbetar för att kontrollera uttrycket av en gen.

Det är inte bara så att denna reglerande process i eukaryoter har fler spelare än vad som vanligtvis ses i bakterier och andra enkla, prokaryota celler; det verkar vara en kategoriskt annorlunda process och en grumligare sådan.

Ett team vid Stanford University, ledd av biofysikern och bioingenjören Polly Fordyce, verkar nu ha avslöjat en komponent i denna luddiga genreglering. Deras arbete, publicerad i september förra året i Vetenskap, antyder att DNA:t nära en gen fungerar som en slags ytlig brunn för att fånga olika reglerande molekyler, och hålla dem redo för handling så att de vid behov kan lägga sin röst till beslutet om huruvida de ska aktivera genen.

Dessa regulatoriska brunnar är gjorda av avgjort udda sträckor av DNA. De består av sekvenser där en kort DNA-sträcka, från ett till sex baspar långa, upprepas många gånger om. Tiotals kopior av dessa "korta tandemupprepningar" (STR) kan strängas ihop i dessa sekvenser, som samma lilla "ord" skrivet om och om igen.

STR finns rikligt i det mänskliga genomet: De utgör cirka 5 % av allt vårt DNA. De ansågs en gång vara klassiska exempel på "skräp"-DNA eftersom en repetitiv DNA-"text" som endast består av STR:er inte kan innehålla tillnärmelsevis lika mycket meningsfull information som, säg, den oregelbundna sekvensen av bokstäver som utgör en mening i denna artikel.

Och ändå är STR helt klart inte obetydliga: De har kopplats till åkommor som Huntingtons sjukdom, spinobulbar muskelatrofi, Crohns sjukdom och vissa cancerformer. Under de senaste decennierna har bevis samlats på att de på något sätt kan förbättra eller hämma genreglering. Mysteriet var hur de kunde vara så kraftfulla med så lite informationsinnehåll.

Komplexa kontroller för komplexa celler

För att förstå hur STR passar in i den stora bilden av genreglering, låt oss ta ett steg tillbaka. Gener flankeras rutinmässigt av bitar av DNA som inte kodar för RNA eller protein men har regulatoriska funktioner. Bakteriegener har "promotor"-regioner där polymerasenzymer kan binda för att påbörja transkriptionen av intilliggande DNA till RNA. De har också rutinmässigt "operator"-regioner, där repressorproteiner kan binda för att blockera transkription, vilket stänger av en gen, som i lac operon.

Hos människor och andra eukaryoter kan de reglerande sekvenserna vara fler, olika - och förbryllande. Regioner som kallas förstärkare, till exempel, påverkar sannolikheten för att en gen kommer att transkriberas. Förstärkare är ofta målen för proteiner som kallas transkriptionsfaktorer, som kan binda för att öka eller hämma genuttryck. Konstigt nog är vissa förstärkare tiotusentals baspar borta från generna de reglerar och förs endast nära dem genom den fysiska omarrangemanget av DNA-slingorna i en packad kromosom.

Eukaryotisk genreglering involverar vanligtvis dessa många olika regulatoriska block av DNA, tillsammans med en eller flera transkriptionsfaktorer och andra molekyler, alla samlas kring en gen som en kommitté som sammankallats för att besluta vad den ska göra. De samlas i en lös, tät klunga.

Ofta verkar de molekylära deltagarna inte heller interagera genom de mycket selektiva "lås och nyckel"-parningar som är vanliga inom molekylärbiologi. De är istället mycket mindre kräsna, interagerar ganska svagt och oselektivt, som om de vandrade runt och träffade korta samtal med varandra.

Faktum är att hur transkriptionsfaktorer binder till DNA i eukaryoter har varit något av ett mysterium. Det antogs länge att någon del av en transkriptionsfaktor måste matcha en bindande "motiv"-sekvens i DNA:t, som bitarna i ett pussel. Men även om vissa sådana motiv har identifierats, korrelerar deras närvaro inte alltid särskilt bra med var forskare hittar transkriptionsfaktorer som fastnar på DNA i celler. Ibland finns transkriptionsfaktorer kvar i områden utan några motiv, medan vissa motiv som verkar som om de starkt skulle binda transkriptionsfaktorer förblir tomma.

"Traditionellt inom genomik har målet varit att klassificera genomiska platser på ett [binärt] sätt som antingen 'bundna' eller 'obundna'" av transkriptionsfaktorer, sa Fordyce. "Men bilden är mycket mer nyanserad än så." De enskilda medlemmarna i dessa genreglerande "kommittéer" verkar inte alltid vara närvarande för eller frånvarande från sina möten, utan snarare har olika sannolikheter att vara där eller inte.

Tendensen för genreglering i eukaryoter att förlita sig på så många olika svaga interaktioner mellan stora molekylära komplex "är en av de saker som gör det notoriskt svårt att få grepp om teoretiskt", sa biofysikern Thomas Kuhlman från University of California, Riverside, som skrev en kommentar på Fordyce-labbets papper för Vetenskap. Det är ett djupt pussel hur, ur denna till synes kaotiska process, exakta beslut om att slå på och av gener uppstår.

Utöver den mystiska flummiga logiken i den beslutsprocessen, finns det också frågan om hur alla kommittéledamöter ens hittar till rätt rum - och sedan stannar där. Molekyler rör sig i allmänhet runt cellen genom diffusion, stöts av alla andra omgivande molekyler, såsom vatten, och vandrar i slumpmässiga riktningar. Vi kan förvänta oss att dessa lösa kommittéer kommer att glida isär för snabbt för att göra sitt reglerande jobb.

Det, tror Fordyce och hennes kollegor, är där STR kommer in. STR är slående vanliga inom förstärkarställen på DNA. I sin artikel hävdar forskarna att STR fungerar som klibbiga fläckar som sammankallar transkriptionsfaktorer och hindrar dem från att förirra sig.

Finjustera klibbigheten

Fordyces grupp undersökte systematiskt hur skillnader i STR-sekvens påverkar fastsättningen av transkriptionsfaktorer till ett bindande motiv. De tittade på två faktorer - en från jäst, en från människor - som håller sig till ett visst sexbasmotiv. Forskarna mätte både styrkan (eller affiniteten) av den bindningen och hastigheten med vilken transkriptionsfaktorerna fastnar och inte fastnar (kinetik) när motivet flankeras av en STR istället för en slumpmässig sekvens. Som jämförelse tittade de på hur lätt faktorerna binder till enbart STR och till en helt slumpmässig DNA-sekvens.

"En av de största utmaningarna på detta område är att lösa de otaliga variablerna som påverkar bindning av [transkriptionsfaktor] vid en specifik position av genomet," sa David Suter, en molekylärbiolog vid Swiss Federal Institute of Technology Lausanne i Schweiz. DNA-form, närhet till andra DNA-segment och fysisk spänning i DNA-molekylerna kan alla spela en roll för transkriptionsfaktorbindning. Värdena på dessa parametrar skiljer sig förmodligen vid varje position i genomet, och kanske också mellan celltyper och inom en enskild cell över tid vid en given position. "Detta är ett stort utrymme av okända variabler som är mycket svåra att kvantifiera," sa Suter.

Det är därför välkontrollerade experiment som de från Stanford-teamet är så användbara, tillade Kuhlman. Vanligtvis, när forskare behöver mäta svaga interaktioner som dessa, har de två val: de kan göra några mycket detaljerade, extremt exakta mätningar och generalisera från dem, eller så kan de ta många snabba och smutsiga mätningar och använda matematiskt komplexa. statistiska metoder för att härleda resultat. Men Fordyce och hennes kollegor, sa Kuhlman, använde en automatiserad, mikrofluidisk chipbaserad procedur för att ta exakta mätningar under experiment med hög genomströmning "för att få det bästa av två världar."

Stanford-teamet fann att olika STR-sekvenser kan förändra bindningsaffiniteterna för transkriptionsfaktorer till DNA med så mycket som en faktor 70; de har ibland större inverkan på transkriptionsfaktorbindning än att ändra sekvensen för själva bindningsmotivet. Och effekterna var olika för de två olika transkriptionsfaktorerna de tittade på.

Så STR verkar kunna finjustera förmågan hos transkriptionsfaktorer att docka på ett DNA-ställe och därmed reglera en gen. Men hur, exakt?

Ett väntrum nära en gen

Forskarna ansåg att den del av en transkriptionsfaktor som binder DNA kan interagera svagt med en STR, med den exakta styrkan av den affiniteten beroende på STR-sekvensen. Eftersom en sådan bindning är svag, kommer den inte att ha mycket specificitet. Men om en transkriptionsfaktor är löst greppad och frigörs av en STR om och om igen, är den kumulativa effekten att hålla transkriptionsfaktorn i närheten av genen så att det är mer sannolikt att den binder säkert till motivregionen om det behövs.

Fordyce och hennes kollegor förutspådde att STR sålunda fungerar som en "lobby" eller brunn där transkriptionsfaktorer kan samlas, dock övergående, nära ett regulatoriskt bindningsställe. "Den repetitiva karaktären hos en STR förstärker den svaga effekten av varje enskild bindningsplats som den är gjord av," sa Connor Horton, den första författaren på studien, som nu är doktorand vid University of California, Berkeley.

Omvänt, tillade han, kan vissa STR också verka för att dra transkriptionsfaktorer bort från regulatoriska sekvenser, och suga upp transkriptionsfaktorer på andra ställen som en svamp. På så sätt kan de hämma genuttryck.

Arbetet, sa Suter, "visar övertygande att STR direkt påverkar bindningen av transkriptionsfaktorer in vitro." Dessutom använde Stanford-teamet en maskininlärningsalgoritm för att visa att effekterna som ses i deras in vitro-experiment också verkar förekomma i levande celler (det vill säga in vivo).

Men Robert Tjian, en biokemist vid Berkeley och en utredare vid Howard Hughes Medical Institute, tror att det kan vara för tidigt att vara säker på vilken inverkan en given STR-transkriptionsfaktorkombination har på genuttryck i verkliga celler.

Tjian, Xavier Darzacq och deras kollegor i labbet som de driver tillsammans på Berkeley är överens om att STR verkar erbjuda ett sätt att koncentrera transkriptionsfaktorer nära genreglerande platser. Men utan att veta hur nära faktorerna måste vara för att aktivera transkription, är det svårt att förstå den funktionella betydelsen av det resultatet. Tjian sa att han skulle vilja se om införandet av en STR i en levande cell förutsägbart påverkar uttrycket av en målgen. För närvarande, sa han, är han "inte övertygad om att STR nödvändigtvis kommer att vara en viktig aspekt av [reglerande] mekanismer in vivo."

En kombinatorisk grammatik

Ett kvardröjande pussel är hur en sådan mekanism på ett tillförlitligt sätt tillhandahåller den typ av exakt genreglering som celler behöver, eftersom både styrkan och selektiviteten hos transkriptionsfaktorbindningen i STR-brunnarna är svag. Fordyce tror att en sådan specificitet av påverkan kan komma från många källor - inte bara från skillnader i STR-sekvenserna utan också från samverkande interaktioner mellan transkriptionsfaktorer och andra proteiner som är involverade i reglering.

Med tanke på allt detta, sa Horton, är det inte klart att det kommer att vara enkelt att förutsäga effekten av en given STR-transkriptionsfaktorkombination på uttrycket av en gen. Logiken i processen är verkligen flummig. Och inflytandets "grammatik" är förmodligen kombinatorisk, tillade Horton: Resultatet beror på olika kombinationer av transkriptionsfaktorer och andra molekyler.

Stanford-teamet tror att kanske 90 % av transkriptionsfaktorerna är känsliga för STR, men att det finns många fler typer av transkriptionsfaktorer i det mänskliga genomet än det finns typer av STR. "Att mutera en STR-sekvens kan påverka bindningen av 20 olika transkriptionsfaktorer i den celltypen, vilket leder till en total minskning av transkriptionen av den närliggande genen utan att implicera någon specifik transkriptionsfaktor," sa Horton.

Så i själva verket håller Stanford-teamet med Tjian om att genreglering i levande celler inte kommer att drivas av en enda enkel mekanism. Snarare kan transkriptionsfaktorer, deras DNA-bindningsställen och andra regulatoriska molekyler samlas till täta samlingar som utövar sitt inflytande kollektivt.

"Det finns nu flera exempel som stöder tanken att DNA-element kan tränga transkriptionsfaktorer till den punkt där de bildar kondensat med kofaktorer," sa Richard Young, en cellbiolog vid Whitehead Institute vid Massachusetts Institute of Technology. Enhancers binder många transkriptionsfaktorer för att skapa den trängseln. STR kan vara en ingrediens som hjälper till att samla transkriptionsfaktorer att samlas nära en gen, men de kommer inte att vara hela historien.

Varför reglera gener på detta komplicerade sätt, snarare än att förlita sig på den typ av starka och specifika interaktioner mellan regulatoriska proteiner och DNA-ställen som dominerar i prokaryoter? Det är möjligt att sådan luddighet är det som överhuvudtaget gjorde stora komplexa metazoer möjliga.

För att vara livskraftiga arter måste organismer kunna utvecklas och anpassa sig till förändrade omständigheter. Om våra celler förlitade sig på något enormt men ändå strikt föreskrivet nätverk av genreglerande interaktioner, skulle det vara svårt att göra några förändringar i det utan att störa hela utrustningen, precis som en schweizisk klocka kommer att gripa om vi tar bort (eller till och med lite förskjuter) någon av dess otaliga kugghjul. Om de regulatoriska molekylära interaktionerna är lösa och ganska ospecifika, finns det dock nyttigt slack i systemet – precis som en kommitté i allmänhet kan komma till ett bra beslut även om en av dess ledamöter är sjuk.

Fordyce noterar att i prokaryoter som bakterier kan det vara relativt lätt för transkriptionsfaktorer att hitta sina bindningsställen eftersom genomet som ska genomsökas är mindre. Men det blir svårare när arvsmassan blir större. I de stora genomen av eukaryoter, "kan du inte längre tolerera risken att du tillfälligt fastnar på ett "fel" bindningsställe," sa Fordyce, eftersom det skulle äventyra förmågan att reagera snabbt på förändrade miljöförhållanden.

Dessutom är STR själva mycket utvecklingsbara. En förlängning eller förkortning av deras sekvens, eller en förändring av storleken och djupet av "transkriptionsfaktorbrunnen", kan lätt uppstå genom missöden i DNA-replikation eller reparation, eller genom sexuell rekombination av kromosomerna. För Fordyce antyder det att STR:er "därför kan fungera som råmaterial för att utveckla nya regleringselement och finjustera befintliga regleringsmoduler för känsliga transkriptionsprogram", som de som styr utvecklingen av djur och växter.

Kraften i svaga interaktioner

Sådana överväganden leder till att molekylärbiologer ägnar mycket mer uppmärksamhet åt svaga och relativt oselektiva interaktioner i genomet. Många av dessa involverar proteiner som, istället för att ha en fast och exakt struktur, är lösa och floppiga - "inneboende oordnade", som biokemister uttryckte det. Om proteiner bara fungerade genom stela strukturella domäner, förklarade Young, skulle det begränsa inte bara hur väl regulatoriska system kunde utvecklas utan också vilka typer av dynamisk reglering som ses i livet. "Du kommer inte hitta en levande organism - eller ens ett virus - som fungerar med bara stabila strukturella element som de i en schweizisk klocka," sa Young.

Kanske snubblade evolutionen bara på STR som en del av en så komplex men i slutändan mer effektiv lösning på genreglering i eukaryoter. STR själva kan uppstå på flera sätt - till exempel genom fel i DNA-replikation eller aktiviteten hos DNA-segment som kallas transposerbara element som gör kopior av sig själva i hela genomet.

"Det råkade bara vara så att de resulterande svaga interaktionerna mellan proteiner och de repetitiva sekvenserna var något som kunde ... ge selektiv fördel till cellerna där det inträffade," sa Kuhlman. Hans gissning är att denna luddighet förmodligen tvingades på eukaryoter, men att "de sedan kunde utnyttja [det] för sin egen fördel." Bakterier och andra prokaryoter kan förlita sig på väldefinierad "digital" regulatorisk logik eftersom deras celler tenderar att existera i endast ett fåtal enkla, distinkta tillstånd, som att flytta runt och replikera.

Men de olika celltillstånden för metazoer är "mycket mer komplexa och ibland nära ett kontinuum", sa Suter, så de är bättre betjänta av suddigare "analog" reglering.

"De genreglerande systemen i bakterier och eukaryoter verkar ha avvikit ganska kraftigt," instämde Tjian. Medan Monod sägs en gång ha anmärkt att "vad är sant för E.coli är sant för elefanten”, verkar det inte alltid vara så.