Goedkeuring dierethiek

C57BL/6-muizen werden verkregen van het Fudan University Animal Center.

Alle dieren werden in roestvrijstalen kooien geplaatst in een goed geventileerde ruimte met een omgevingstemperatuur van 24-26 °C en gecontroleerde relatieve vochtigheid. Tijdens het experiment kregen de proefdieren dieetpellets en kraanwater. Aan het einde van de experimentele periode werden alle dieren onder milde verdoving geëuthanaseerd met 20 mg/kg ketamine en 3 mg/kg xylazine. Alle dierexperimenten werden uitgevoerd met goedkeuring van de Scientific Investigation Board van Fudan University (2019-JS-011). De studie wordt gerapporteerd in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen (https://arriveguidelines.org). Alle methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften.

Door bleomycine geïnduceerd longfibrosemodel

Vrouwelijke of mannelijke C8BL/57-muizen van 6 weken oud (Shanghai, China) werden verdoofd met isofluraan en kregen op dag 50 een enkele endotracheale dosis bleomycinesulfaat (3 μl, 0 U/kg) om longfibrose te induceren. Bleomycine-naïeve muizen (controle) kregen een endotracheale dosis zoutoplossing (50 μl). Op dag 14 ontving de behandelde groep een enkele intraveneuze (staartader) dosis MSC (200 μl; dosis, 5 x 10⁶ MSC's). De controlegroep kreeg een equivalent volume fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Muizen werden beoordeeld op dag 14 en/of op dag 21 of dag 28 voor cytometrische, histologische en/of kwantitatieve PCR (qPCR) analyse.

Isolatie en kweek van MSC's en longfibroblasten

MSC's en longfibroblasten werden verkregen van C57BL/6-muizen. Alle procedures voor de isolatie en kweek van deze cellen werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Scientific Investigation Board van Fudan University.

De mannetjesmuizen werden onder milde verdoving geëuthanaseerd met 20 mg/kg ketamine en 3 mg/kg xylazine. Vetweefsel werd met behulp van chirurgische manipulatie uit de epididymis verkregen en de bloedvaten werden van het vet gescheiden en in 1 mm gesneden³ op een koud bord. Het weefsel werd vervolgens verteerd met behulp van 1 mg / ml collagenase I (Biosharp, China) bij 37 ° C gedurende 0.5, 2000 uur om een ​​eencellige suspensie te verkrijgen. De suspensie werd 5 minuten gecentrifugeerd bij 100 rpm en de cellen werden uitgeplaat in een schaal van 10 mm. Het kweekmedium bestond uit Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium, dat 100% FBS, 100 mM niet-essentiële aminozuren en 20 mM natriumpyruvaat, 20 mM natriumpyruvaat, β-mercaptoethanol L-glutamine, 100 μg/ml EGF, 100 IE bevat. / ml penicilline en 37 μg / ml streptomycine (allemaal van Gibco, Carlsbad, CA). Daarna werden de MSC's gekweekt bij 5 ° C en XNUMX% COXNUMX₂ voor ongeveer 5 dagen. Wanneer de cellen 70-80% confluentie bereikten, werden ze geoogst met behulp van 0.05% trypsine (Gibco) en in subcultuur gebracht in hetzelfde medium. Alle experimenten werden uitgevoerd met behulp van MSC's van de derde generatie.

Het longweefsel van muizen werd in 1 mm gesneden³ stuk onder een steriele omgeving en vervolgens in een H-glutamine, 20 μg / ml EGF, 100 IU / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine (allemaal van Gibco, Carlsbad, CA) geplaatst. Daarna werd longweefsel gekweekt bij 37 ° C en 5% COXNUMX₂ voor ongeveer 7 dagen. Wanneer de cellen 80% confluentie bereikten, werden ze geoogst met behulp van 0.05% trypsine (Gibco) en in subcultuur gebracht in hetzelfde medium. Alle experimenten werden uitgevoerd met behulp van longfibroblasten van de derde generatie.

Flowcytometrie-analyse

Om de identiteit van de MSC's te bevestigen, werd flowcytometrie-analyse uitgevoerd volgens de richtlijnen van de International Society for Cellular Therapy (ISCT). heeft gedefinieerd dat de MSC's de oppervlaktemarkers CD29, CD44, CD73 en CD90 tot expressie kunnen brengen, maar een gebrek aan expressie van CD34, CD45, CD11b^24,25,26. MSC's bij de derde passage werden getrypsiniseerd, tweemaal gewassen met PBS en elke 1 x 10⁵ cellen werden afzonderlijk gekleurd met menselijke monoklonale antilichamen, waaronder CD29-FITC, CD44-FITC, CD90-FITC, CD45-FITC en CD11b-FITC (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Cellen werden gedurende 4 minuten bij 20 ° C in het donker met de antilichamen geïncubeerd, samen met een fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) isotypecontrole. Na wassen werden de cellen gesuspendeerd in 500 ul FACS-buffer en geanalyseerd met Flow Cytometer (Accuri C6, BD Biosciences).

Identificatie van MSC-celdifferentiatie

Om het differentiatiepotentieel van meerdere lijnen van de MSC's te bepalen, werden adipogene, osteogene en chondrogene differentiatie-experimenten uitgevoerd met behulp van de Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN). De inductieprocessen voor de drie lijnen werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant, waarbij de differentiatiemedia om de twee dagen werden vervangen. Na 10 dagen werden de adipogene, osteogene en chondrogene differentiatie beoordeeld met behulp van respectievelijk olierode kleuring, Alizarin Red-S-kleuring en alcian 8GX blauwe kleuring (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Cel fluorescerende labeling

Voor celvisualisatie werden de MSC's gelabeld met PKH26 Red Fluorescent Cell Connection Kit (Tanon; Tanon Science & Technology, Shanghai, China) om het celmembraan te kleuren, en DAPI werd gebruikt om de kern te kleuren. In totaal 2 × 10⁷ MSC-cellen werden gekleurd volgens de instructies die bij de kit werden geleverd. Celbeelden werden vastgelegd met een laser scanning confocale microscopie (Olympus, Tokyo, Japan).

RNA-extractie en qRT-PCR-analyse

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit weefsels of gekweekte cellen zoals eerder beschreven²⁷. Totaal RNA werd geëxtraheerd met trizol volgens de kitinstructies (Ambion, Foster City, CA). Vervolgens werd cDNA gesynthetiseerd met behulp van de All-In-One RT MasterMix (ABM). Voorwaartse en achterwaartse primersequenties gebruikt in reverse transcriptase-PCR (Tabel 1) zijn ontworpen door Primer 5.0-software (PREMIER Biosoft International, Palo Alto, CA), gebaseerd op mRNA-informatie van elk gen verkregen uit de database van het National Center for Biotechnology Information (NCBI). Realtime PCR werd uitgevoerd met behulp van EvaGreen 2 × qPCR MasterMix (ABM) op een Light Cycler 480 II (Roche Diagnostics, Basel, Zwitserland) met de ontworpen voorwaartse en achterwaartse primers.

Western-blotting-analyse

Een Western-blot-assay werd uitgevoerd zoals beschreven²⁸. Voor Western-blotanalyse van extracten van hele cellen werden de volgende primaire antilichamen gebruikt: TGF-β1 (1: 5000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, VS), α-SMA (1: 5000; Abcam,) en Col ik (1:5000; Abcam). Smad2 (1:1,000 verdunning, Protein-Tech, China), fosfo-Smad2 (1:1,000 verdunning, Protein-Tech, China), Smad3-antilichaam (1:1,000 verdunning, Protein-Tech, China), fosfo-Smad3 (1 :1,000 verdunning, Protein-Tech, China), p62 (1:1,000 verdunning, ProteinTech, China), α-tubuline (1:1,000 verdunning, Affinity, China). De eiwitten werden gescheiden met behulp van SDS-PAGE en overgebracht op een membraan, gevolgd door incubatie met mierikswortelperoxidase-geconjugeerd anti-IgG (1: 5000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, VS). Eiwitbanden werden gevisualiseerd met behulp van een verbeterde chemiluminescentiekit (Tanon; Tanon Science & Technology, Shanghai, China). Om nauwkeurige kwantificering te garanderen, werden de resultaten genormaliseerd met GAPDH (1:2000; Abcam).

In vitro migratie van longfibrotische cellen

Om de migrerende en invasieve eigenschappen van fibrotische longcellen te analyseren, werden wondgenezing en transwell-migratietesten uitgevoerd, gebaseerd op eerder gepubliceerde methoden²⁷. Om het migratievermogen van longfibrotische cellen te beoordelen, werden celmigratie-experimenten uitgevoerd met behulp van een transwell-plaat met 24 putjes (PET-membraan 8 μm poriegroottes, Corning Incorporated Costar, Corning, NY). Longfibrotische cellen (2 × 10⁵) gesuspendeerd in 200 μl serumvrij medium werden afzonderlijk in de bovenste put van de transwell-kamers gezaaid. In elke groep was één bodem gevuld met 600 μl 0.5, 4% serummedium als controle, terwijl in de experimentele groep de bodem was gevuld met 10 x XNUMX⁵ MSC's opgehangen in hetzelfde medium. Na 24 uur incubatie werden niet-migrerende cellen op het bovenoppervlak van het membraan verwijderd met een wattenstaafje en werden de cellen op het onderoppervlak gefixeerd met methanol en gekleurd met 0.1% kristalviolet gedurende 20 minuten. De gekleurde cellen werden geobserveerd en geteld met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop (Olympus, Tokyo, Japan). Er werden 10 foto's gemaakt in een tienvoudige objectieflens om het aantal gekleurde cellen te tellen dat door de membraanporie migreerde.

histologie

Muizen werden geëuthanaseerd en hun rechterlongen werden ingebed in paraffine en doorgesneden voor H&E of Masson's trichroomkleuring²⁹. De linkerlong werd ofwel snel ingevroren in vloeibare stikstof en gebruikt voor RNA- en eiwitisolatie of vers gebruikt voor kwantificering van collageen of cytometrische analyse. Willekeurig geselecteerde gebieden (10-15 velden) van 5 μm dikke longsecties werden onderzocht onder een Nikon Eclipse 80i-microscoop (Nikon) met een vergroting van × 100 en × 200. Voor histologische kwantificering werd de Ashcroft-score geblindeerd gebruikt³⁰. De Ashcroft-score varieert van 0 tot 8, waarbij hogere scores duiden op ernstigere fibrose. Scores van 0-1 vertegenwoordigden geen fibrose, scores van 2-3 vertegenwoordigden minimale fibrose, scores van 4-5 werden beschouwd als matige fibrose en scores van 6-8 duidden op ernstige fibrose.

Sircol-collageentest

Kwantificering van collageen werd uitgevoerd met behulp van de Sircol-collageenassay volgens het protocol van de fabrikant (Bicolor, Life Science Assays)³¹. In het kort werd de linkerlong overnacht gehomogeniseerd bij 4 °C in 5 ml 0.5 M azijnzuur met 0.6% v/v pepsine. Een totaal van 1 ml kleurstofreagens werd toegevoegd aan 100 μl transparant supernatant en de monsters werden gedurende 30 minuten gevortext. De resterende pellet werd gewassen met zuur-zout wasbuffer om ongebonden collageen te verwijderen, en de pH werd genormaliseerd met alkalisatiebuffer. De absorptie werd gemeten bij een golflengte van 550 nm in een microplaatlezer. Het collageengehalte werd bepaald door het te vergelijken met een standaardkromme, weergegeven als mg/ml linkerlonghomogenaat.

statistische analyse

Alle experimentele gegevens werden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de Student's onafhankelijke t-test via Prism 9-software (GraphPad Software, La Jolla, CA, VS) tussen experimentele groepen. Het significantieniveau is vastgesteld op *P <0.05; **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P <0.0001.

• Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
• PlatoData.Network Verticale generatieve AI. Versterk jezelf. Toegang hier.
• PlatoAiStream. Web3-intelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
• PlatoESG. Automotive / EV's, carbon, CleanTech, Energie, Milieu, Zonne, Afvalbeheer. Toegang hier.
• Plato Gezondheid. Intelligentie op het gebied van biotech en klinische proeven. Toegang hier.
• ChartPrime. Verhoog uw handelsspel met ChartPrime. Toegang hier.
• BlockOffsets. Eigendom voor milieucompensatie moderniseren. Toegang hier.
• Bron: https://www.nature.com/articles/s41598-023-40531-9