Dieren

Vrouwelijke Sprague Dawley (SD) ratten (leeftijd, 8~10 weken; gewicht, 180~200 g) en C57BL/6 muizen (half mannelijk en vrouwelijk; leeftijd, 8~10 weken; gewicht, 15~20 g) werden gekocht bij het Guangdong Medical Laboratory Animal Center en gehuisvest onder standaard specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden. Alle dieren werden gefokt in de specifieke pathogeenvrije (SPF) dierenstal onder een standaard gereguleerde omgeving (12 uur licht/donkercyclus) met vrije toegang tot voedsel en water, en men liet ze gedurende ten minste zeven dagen vóór de experimenten acclimatiseren. De dieren werden willekeurig toegewezen aan verschillende experimentele groepen en er werd tijdens de experimentele procedure geen blinderingsmethode gebruikt. Alle dierexperimentele procedures waarbij laboratoriumdieren werden gebruikt, werden uitgevoerd in overeenstemming met de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 1996) en goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van Sun Yat-sen University (SYSU-IACUC-2021 -000438).

NSC-cultuur en differentiatie

NSC's werden verkregen uit de foetale hersenen van embryonale SD-ratten van 14 dagen. In het kort werd het cerebrum van embryo's uitgesneden en werden de bedekkende pia mater en bloedvaten onder een microscoop verwijderd. Vervolgens werden de hersenen mechanisch gedissocieerd in voorkoelende fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om een ​​eencellige suspensie te genereren en gedurende 1000 minuten bij 10 omwentelingen per minuut (rpm) gecentrifugeerd. De celpellet werd opnieuw gesuspendeerd en gekweekt met DMEM/F-12-medium (Gibco, Life Technologies, VS) aangevuld met 2% B-27™-supplement (50X; Gibco, Life Technologies, VS), 20 ng/ml groeifactor (EGF Peprotech, New Jersey, VS), 20 ng / ml fibroblastgroeifactor (FGF; Peprotech, New Jersey, VS) en 1% penicilline / streptomycine (10,000 U / ml, Gibco, Life Technologies, VS). NSC's werden elke drie dagen gezuiverd door passage, en cellen tussen passages 2-5 werden geselecteerd om verder onderzoek uit te voeren. Alle cellen werden elke 3 maanden getest op mycoplasmabesmetting.

Voor differentiatie van NSC's werden de celpellets gedigereerd in afzonderlijke cellen met Accutase (Millipore, Bedford, MA) en onderworpen aan neuronale differentiatie op met 0.1% poly-L-lysine (Gibco, VS) gecoate kweekschalen in Neurobasal (Gibco, Life Technologies). , VS) aangevuld met 2% B-27™. Het medium werd elke 2-3 dagen vervangen.

Astrocytencultuur en inductie

Astrocyten werden geïsoleerd uit postnatale tweedaagse SD-ratten. Na het strippen van de hersenvliezen en bloedvaten werden de cortices mechanisch vervolgens enzymatisch gedissocieerd in eencellige suspensie met 0.25% trypsine bij 37 ° C gedurende 15 minuten, gevolgd door filtratie en centrifugatie om celpellets te verzamelen. Cellen werden gesuspendeerd met basaal medium (DMEM/F-12; 10% foetaal runderserum, FBS) en gedurende 30 minuten op onbeklede platen uitgeplaat om fibroblasten en endotheelcellen te verwijderen. Vervolgens werden de niet-hechtende astrocyten overgebracht naar nieuwe schalen die vooraf waren gecoat met 0.1% poly-l-lysine. Het celmedium werd elke drie dagen vervangen en gepasseerd toen de celfusiesnelheid ~90% bereikte. Astrocyten werden een nacht geschud bij 200 rpm om microglia uit de bovenste laag te verwijderen die aan het oppervlak van astrocyten waren gehecht, gevolgd door toediening van PLX5622, een specifieke microglia-wegvanger, om astrocyten verder te zuiveren vóór passage. Alle cellen werden elke 3 maanden getest op mycoplasmabesmetting. Om reactieve astrocyten te induceren werden de cellen gedurende 30 uur geïncubeerd met de drievoudige factoren TNFα (1 ng/ml), IL-3α (1 ng/ml) en C400q (24 ng/ml) en werd de succesvolle inductie van reactieve astrocyten geverifieerd door sterk verhoogde C3⁺ vorming van astrocyten via immunofluorescentiekleuring en flowcytometrietest.

Lentivirus-gemedieerde overexpressie van UCHL1

Het lentivirus dat UCHL1 (OE-UCHL1-LV) tot overexpressie brengt en de lege lentivirale vector (NC-LV) werden geconstrueerd door HanBio Technology (Shanghai, China). Lentivirus ontworpen om UCHL1 tot overexpressie te brengen, werd gekloneerd in de lentivirale vector pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-GFP-T2A-PURO die het ZsGreen-reportergen bevat. De lentivirusvectoren werden overgebracht naar 293 T-cellen in aanwezigheid van verpakkingsplasmiden (psPAX2 en pMD2G) met behulp van LipofiterTM (HanBio Technology) voor lentivirusverpakking. 293 T-cellen werden getransfecteerd en de werkzaamheid van overexpressie werd na 48 uur beoordeeld met qPCR. De uiteindelijke lentivirale vectortiter was 2 x 10⁸ TU/ml.

Voor NSC-infectie werden cellen getransfecteerd met verdunde lentivirale oplossing met een multipliciteit van infectie (MOI) van 25, met een supplement van 1 mg/ml polybreen. 24 uur na transfectie werd het medium gedurende nog eens 24 uur vervangen door vers basaal medium (FBS-vrij) zonder penicilline/streptomycine. GFP-expressie werd 48 uur na transfectie zichtbaar gemaakt onder een fluorescentiemicroscoop, en overexpressie van UCHL1 werd bepaald door Western blot- en qPCR-analyse.

Co-cultuur van NSC's en astrocyten

Hier werden twee in vitro co-cultuursystemen uitgevoerd (Fig. 4C): (1) We gebruikten een transwell-systeem dat interactie via diffundeerbare factoren mogelijk maakte. Ongestimuleerde controle-astrocyten of reactieve astrocyten in de transwell bevonden zich bovenaan de NSC's die in de onderste kamer waren gekweekt, en beide cellen werden gekweekt in het basale kweekmedium (vrij van FBS) van NSC's. (2) een eenvoudige astrocyten conditioneel medium (ACM) overdracht van de controle/reactieve astrocytenculturen naar de culturen van NSC's. Na incubatie in het normale of inducerende medium werden astrocyten gedurende nog eens 24 uur gekweekt met het basale kweekmedium (vrij van FBS) van NSC's, vervolgens werd de ACM van de controle-astrocyten of reactieve astrocyten verzameld en toegevoegd aan het basale medium van NSC's bij een verhouding van 1:1 ACM tot NSC's kweekmedium. De celproliferatie, agressieve vorming en proteasoomactiviteit werden 24 uur later beoordeeld.

Celproliferatietest

Celproliferatie in vitro werd onderzocht door EdU-opname. NSC's werden een nacht vóór het oogsten geïncubeerd met een kweekmedium aangevuld met 10 µM EdU. Cellen werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde (PFA), gevolgd door permeabilisatie, vervolgens tweemaal gewassen met 3% runderserumalbumine (BSA) en gekleurd met behulp van Click-iT EdU-testkit (US Everbright INC.) in overeenstemming met de instructies van de fabrikant. Na eenmaal wassen werden de cellen opnieuw gesuspendeerd met Hoechst-oplossing (2 µg/ml; US EVERBRIGHT INC.) voor DNA-tegenkleuring voorafgaand aan analyse op Cytoflex LX of laserscanning confocale microscoop (LSCM). De controlecellen die niet werden onderworpen aan EdU maar fluorescerende EdU-detectie ondergingen, werden gebruikt als een negatieve basis om de grenswaarden voor EdU-positiviteit te beoordelen. Voor kwantificering van de EdU-test wordt de verhouding van de EdU⁺ cellen in ten minste drie replicaties onder verschillende groepen werden geteld.

Proteostaat analyse

Cellen werden gefixeerd zoals hierboven vermeld, vervolgens gepermeabiliseerd met 0.5% Triton X-100/PBS op ijs en gedurende 30 minuten zachtjes geschud. Na tweemaal wassen met PBS werden de cellen opnieuw gesuspendeerd met PROTEOSTAT Aggresome Detection Reagent (1:2000) en beschermd tegen licht bij kamertemperatuur (RT) gedurende 30 minuten, en vervolgens tegengekleurd met Hoechst 33342 (1:1000). De gekleurde cellen werden geanalyseerd met behulp van een confocale microscoop. Voor flowcytometrie werd 500 µl vers verdund 1:10000 PROTEOSTAT Aggresome Detection Reagent aangebracht om de cellen gedurende 30 minuten te incuberen onder bescherming tegen licht. Als controles werd een test uitgevoerd op het gebied van deprivatie van voedingsstoffen die proteostaat en een proteasoomremmer opruimde. MG132, een proteasoomremmer die de vorming van perinucleaire agressie in cellen versnelt, werd als positieve controle gebruikt. Voor het onthouden van voedingsstoffen werden de cellen geïncubeerd in HBSS (Gibco) aangevuld met 1 mM HEPES dat oververzuring gedurende 3 uur voorkwam, waarna het medium werd vervangen door basaal kweekmedium. Proteostaatlabeling werd bepaald door het relatieve fluorescentiegebied van agressief eiwit in hetzelfde gezichtsveld bij verschillende behandelingen, met ten minste drie biologische replicaten.

Proteasoomactiviteitstest

Proteasoomactiviteitstesten werden uitgevoerd door een proteasoomactiviteitsonde volgens de instructies. De behandelde cellen werden gedurende 5 uur bij 4 ° C geïncubeerd met de 3 µM proteasoomactiviteitsonde Me3BodipyFl-Ahx2Leu37VS (Boston Biochem), vervolgens gewassen en geanalyseerd via flowcytometrie.

Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA)

Het C3a-niveau in het perifere bloed en CSF verzameld van SCI-ratten werd gedetecteerd via de RayBio menselijke C3a ELISA-kit (RayBiotech) volgens de instructies van de fabrikant. In het kort werd 100 µl standaard of monster aan elk putje toegevoegd en 2.5 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden geïncubeerd, vervolgens vier keer gewassen en 1 uur met gebiotinyleerd antilichaam geïncubeerd. Vervolgens werd 100 µl HRP-geconjugeerd streptavidine toegevoegd, gevolgd door incubatie van 3,3,5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) eenstapssubstraatreagens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker onder zacht schudden. Tenslotte werd het beëindigen van de werking met stopoplossing en de absorptiewaarde bij 450 nm gemeten en onmiddellijk geregistreerd.

Model voor ruggenmergletsel en toediening van lentivirus

Om een ​​rattenmodel van de 10e thoracale wervel (T10) met volledige dwarsdoorsnede SCI te produceren, werden vrouwelijke SD-ratten verdoofd en werd de rugbont geschoren en gedesinfecteerd met Jodium Volts Swab. Er werd een incisie van ongeveer 2 cm gemaakt op de T9-T11-huid, waarna het vet, de fascialaag en de paravertebrale spieren achtereenvolgens werden gescheiden om de T10-wervel bloot te leggen. Vervolgens werd T10-laminectomie uitgevoerd en werd T10-wervelweefsel volledig doorgesneden met behulp van een scherp scalpel. Na hemostase werden ratten willekeurig verdeeld in zes groepen, en een totaal van 10 μl specifiek mengsel werd als volgt in de laesieplaats geïnjecteerd met behulp van een microspuit volgens de diergroepen: schijngroep (geen SCI; n = 12); laesiecontrolegroep (PBS; n = 12); lege lentivirale vector (NC-LV; 2 × 10⁸ TU/ml; n = 12); lentivirale vector die codeert voor UCHL1 (OE-UCHL1-LV; 2 × 10⁸ TU/ml; n = 12) groep; recombinant menselijk UCHL1 (rh-UCHL1; 4 μm; n = 12) groep; en de LDN-57444 (UCHL1-remmer; 2 mM; n = 12) groep. Een totaal van 5 μl virus of recombinant eiwit werd afzonderlijk gemengd met 5 μl Matrigel voordat het in de laesies van SCI-ratten werd geïnjecteerd om verlies te voorkomen.

De lichaamstemperatuur van de dieren werd gedurende de gehele operatie op ~37 °C gehouden met behulp van een verwarmingskussen totdat ze volledig uit de anesthesie waren hersteld. Tijdens de postoperatieve zorg ondergingen de dieren handmatige blaasevacuaties tot ze zelfstandig konden plassen, en werden ze dagelijks gecontroleerd op wonden, infecties, gewichtsverlies, autofagie van de tenen en mobiliteit. Alle in dit experiment gebruikte dieren vertoonden geen wondinfectie, erosie of zelf veroorzaakte wonden.

Constructie en injectie van adeno-geassocieerd virus (AAV).

De AAV gericht op UCHL1 pAAV-Nestin-tdTomato-P2A-3xFLAG-Uchl1-tWPA of de controlevector alleen met tdTomato-fluorescentie (pAAV-Nestin-tdTomato-P2A-3xFLAG-MCS-tWPA) werd gegenereerd door OBiO Technology Corp., Ltd ( Sjanghai). Het UCHL1-gen werd gesubkloneerd in pAAV-Nestin-tdTomato-P2A-3xFLAG-WPRE-plasmiden om pAAV-Nestin-tdTomato-P2A-3xFLAG-Uchl1-tWPA te produceren. De virustiter was 6.81E + 12 vectorgenomen per ml (VG/ml), bepaald met qPCR. Vrouwelijke SD-ratten ondergingen de T10 volledige transsectie-SCI zoals hierboven beschreven, waarna het virus (1.5 μl in volume) onmiddellijk na de operatie met een microspuit in het laesiecentrum werd afgeleverd. Dieren werden twee weken na virusinjectie opgeofferd voor verdere analyse.

BrdU-test

De activering van NSC's in het ruggenmerg werd geëvalueerd door BrdU (5-bromodeoxy-2′-deoxyuridine; Sigma) na AAV-injectie. SCI-ratten waaraan AAV werd toegediend, werden dagelijks intraperitoneaal geïnjecteerd met BrdU (30 mg / kg lichaamsgewicht) na de operatie gedurende 2 weken tot euthanasie. De beschadigde ruggenmergwervels werden verzameld en bevroren coupes (10 µm) werden op een cryostaat bereid. Secties werden voorbehandeld met 2 M HCL gedurende 30 minuten bij 37 ° C, gevolgd door 0.1 M boorzuur (pH 8.5) (Biosharp) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens werden secties geblokkeerd, geïncubeerd met het anti-BrdU en anti-Nestin primaire antilichaam (1:1000; Sigma) overnacht bij 4 ° C en vervolgens Alexa Flour 488/647-geconjugeerde secundaire antilichamen, en vóór observatie tegengekleurd met DAPI.

Blokkering van reactieve astrocyten en C3/C3aR-route bij SCI-muizen

Om reactieve astrocyten na dwarslaesie te blokkeren met behulp van neutraliserende antilichamen [30] werden C57BL/6-muizen in plaats van SD-ratten geselecteerd om T10-transsectie-experiment uit te voeren vanwege de grote vraag naar neutraliserende antilichamen in vivo. Verwacht voor de Sham-groep (zonder SCI; n = 12), alle muizen ondergingen volledige T10-transsectie SCI en geïnjecteerd met drievoudige neutraliserende antilichamen (Neutraliserende Abs-groep; TNFa/IL-1a/C1q, elk 10 mg/kg; n = 12), het controle-IgG-antilichaam (IgG-groep; 10 mg/kg; n = 12) en 0.9% normale zoutoplossing (laesiecontrolegroep; n = 12) via intraperitoneale injectie om de twee dagen. Om de C3/C3aR-route te blokkeren, werd dagelijks een C3aR-antagonist (SB290157; 10 mg/kg) of 0.9% normale zoutoplossing intraperitoneaal geïnjecteerd in SCI- of Sham-muizen. En dieren werden behandeld met EdU (50 mg/kg) om de verspreide NSC's te volgen. 7 dagen na de laesie werden alle dieren opgeofferd om de NSC-activering te evalueren.

Gedragstest

De Basso, Beattie & Bresnahan (BBB) ​​beoordelingstest voor motorvoertuigen [36] werd uitgevoerd 2 dagen vóór het letsel, 1-3 dagen en wekelijks na de operatie om de motorische functies van de achterpoten te evalueren. Ratten werden op een rustige en open plek geplaatst om spontane beweging te garanderen, waarna de loop- en fysieke activiteiten van de achterpoten werden geobserveerd en geregistreerd. De BBB-schaal bestaat uit drie delen: I. de gewrichtsbeweging van de achterpoten, die een score van 0~7 behaalde; II. de loop- en coördinatiefunctie van de achterpoten, die een score van 8-13 scoorden; III. de fijnheid van de poot in beweging, die 14~21 scoorde. Gedragsevaluatie werd wekelijks na een dwarslaesie uitgevoerd door twee onderzoekers die afzonderlijk bekend waren met de BBB-criteria.

Elektrofysiologisch onderzoek

Elektrofysiologische evaluatie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [37, 60] 8 weken na dwarslaesie bij ratten of 6 weken na verwonding bij muizen. De dieren werden opnieuw verdoofd en er werd laminectomie uitgevoerd om het T7- en T13-ruggenmerg bloot te leggen, beide drie segmenten rostraal en caudaal ten opzichte van de laesieplaats. Een bipolaire stimulatie-elektrode met een afstand van 2 mm werd gepositioneerd op het intraspinale rostrale T7-segment, en een zilveren kogelelektrode geplaatst op het caudale T13-segment om de opgewekte respons te registreren. Er werd een blokgolfpuls van 0.1 ms afgegeven met een interval van 10 ms en de veldactiviteit werd versterkt en geregistreerd. Ten minste 20 sporen van elke opnamelocatie werden gemiddeld en de amplitude van het opgewekte potentieel werd gekwantificeerd.

Eiwitarray van hersenvocht van SCI-dieren

Cerebrospinaal vocht (CSF) werd geëxtraheerd met behulp van paracentese uit het cerebellomedullaire reservoir. In het kort, 6 uur na T10 complete transsectie SCI, ratten (n = 4) werden opnieuw verdoofd en gefixeerd met een stereotaxisch apparaat. Vervolgens werd het uitsteeksel van het achterhoofd blootgelegd en werd voorzichtig via het achterhoofdsbeen een glazen capillair in het cerebellomedullaire reservoir ingebracht. Van elke rat werd ongeveer 100 ~ 120 μl CSF verzameld en voor verder onderzoek bij -80 ° C gehouden. CSF-monsters van een gelijk aantal ratten (n = 4) zonder operatie werden als controle gebruikt.

Eiwitmicroarray-analyses van CSF geoogst van de normale / SCI-ratten werden uitgevoerd door G-Series Rat Cytokine Array (RayBiotech, Inc., Guangzhou, China) volgens de instructies van de fabrikant. Er werd in totaal 100 μl monster van elke rat gebruikt en de verkregen ruwe gegevens werden op de achtergrond afgetrokken en genormaliseerd vóór clusteranalyse. Genontologie (GO)-annotatie, bestaande uit drie delen, waaronder moleculaire functie, biologisch proces en cellulaire component, werd toegepast om functies van potentiële genen te identificeren. Mogelijke betrokken signaalroutes werden geanalyseerd door de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database.

Immunofluorescente kleuring

Voor immunocytochemische analyse werden de cellen gefixeerd met 4% PFA en gepermeabiliseerd met behulp van 0.5% Triton X-100, en vervolgens gedurende 5 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd in 1% BSA. Voor immunohistochemie werden de dieren geperfuseerd met 0.9% normale zoutoplossing gevolgd door 4% PFA in 0.1 M PBS (pH 7.2), vervolgens een ruggengraatsegment van 2-3 cm dat het laesiecentrum omvatte, met 2 segmenten erboven (+4 mm) en 2 eronder. (-4 mm), werd ontleed en geëxtraheerd. De monsters werden gedurende 6-8 uur nagefixeerd en gedurende drie opeenvolgende dagen gedehydrateerd in 20% en 30% sucrose. Na ingebed in Tissue-Tek OCT (Sakura), werden de longitudinale plakjes (3 μm) die het laesiecentrum en de transversale secties (10 μm) van het epicentrum van de T10-laesie omvatten, verzameld op een cryostaat en bewaard bij -10 ° C voor verder gebruik . De bevroren coupes van het ruggenmerg werden gedurende 20 minuten in PBS gewassen en ondergingen vervolgens antigeenwinning met behulp van Proteinase K en blokkering met 15% BSA aangevuld met 5% Triton X-0.3 gedurende 100 uur. Na de blokkeringsprocedure werden de gefixeerde cellen en plakjes een nacht bij 2 ° C met de eerste antilichamen geïncubeerd. De eerste antilichamen die in de huidige studie werden gebruikt, waren onder meer: ​​UCHL4 (1:1; Cell Signaling Technology, CST), Nestin (300:1; Cell Signaling Technology, CST), SOX300 (2:1; Abcam), Glial Fibrillary Acidic Protein ( GFAP; 300:1; Celsignaleringstechnologie, CST), Microtubule Associated Protein 300 (MAP2; 2:1; Abcam), Neurofilament 300 (NF-200; 200:1; Celsignaleringstechnologie, CST), CNPase (300:1 Celsignaleringstechnologie, CST), NeuN (300:1; Abcam), C300a (3:1; Abcam), C10aR (3:1; Santa Cruz), NG200 (2:1; Santa Cruz), Doublecortin (DCX; 200:1; Abcam), Ki-300 (67:1; Abcam), Tubulin β800 (3:1; Cell Signaling Technology, CST), BrdU (300:1, Sigma). Na driemaal wassen in PBS werden de cellen en secties vervolgens geïncubeerd met Alexa Flour 1000/488/594-geconjugeerde secundaire antilichamen en tegengekleurd met DAPI (647:1; Sigma). Alle immunofluorescentiebeelden werden verkregen met behulp van een Zeiss LSM 5000 confocale microscoop.

Kwantificering van confocale analyse

Alle confocale beelden van cellen en weefsels van de wervelkolom werden onderzocht met behulp van een Zeiss LSM 880 confocale microscoop en als volgt op een geblindeerde manier gekwantificeerd. Bij elke rat/muis werden 4-5 ruggenmergsecties van verschillende niveaus (waaronder de dorsale, de middelste en de ventrale) geselecteerd. De voor kwantificering gebruikte secties werden zoveel mogelijk uit groepen van hetzelfde niveau onder verschillende omstandigheden geselecteerd. De beelden voor kwantificering werden voornamelijk vastgelegd vanaf de laesieplaats in de longitudinale secties en rondom het centrale kanaal in de transversale secties van SCI-dieren. De diagrammen die illustreren waar microfoto's vandaan komen en de kwantitatieve locaties in gerelateerde figuren werden getoond in Fig. 6A. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een eenmaal herhaald experiment of verkregen van één rat/muis. Alle experimenten werden minstens drie keer uitgevoerd met biologische replicaten.

Om UCHL1-positieve cellen in de laesieplaats van het ruggenmerg te kwantificeren, werd het percentage DAPI-signalen omgeven door UCHL1 geteld. Om de C3 te kwantificeren⁺ reactieve astrocyten, SOX2⁺ NSC's, prolifereerde NSC's en neuronen in vitro en in vivo, C3/GFAP⁺, Ki-67/Nestin⁺, SOX2/Nestin⁺, BrdU/Nestin⁺, BrdU/tubuline β3⁺ dubbelkleurende cellen werden handmatig geteld in hetzelfde gezichtsveld en de verhouding van positieve cellen werd gekwantificeerd. Om het GFP te kwantificeren⁺ cellen geïnfecteerd door lentivirale vector die codeert voor UCHL1 in het laesiecentrum in vivo, dubbele kleuring van GFP / Nestin⁺ NSC's, GFP/NG2⁺ OPC's, GFP/tubuline β3⁺ neuronen, GFP/NeuN⁺ neuronen en GFP/GFAP⁺ astrocyten werden handmatig geteld en de verhouding van individuele cellen tot die van het totale GFP⁺ cellen werden respectievelijk berekend. Om de immunoreactiviteit van Nestin en NF-200 te kwantificeren, werd het relatieve fluorescerende gebied van Nestin/NF-200 in het laesiecentrum van de individuele optische sectie gemeten met behulp van Afbeelding J.

Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR)

Totaal RNA uit NSC's of ruggenmergweefsels werd geëxtraheerd met behulp van Trizol (Invitrogen, life technologies) volgens de reagensspecificatie. De kwantiteit van de RNA-opbrengst werd bepaald door de Nanodrop one (ThermoFisher). Totaal RNA werd onderworpen aan reverse transcriptie naar cDNA met behulp van de PrimeScript RT-reagenskit (Vazyme). Q-PCR-test werd uitgevoerd met behulp van de SYBR Premix EX Taq (Vazyme). De expressieniveaus werden genormaliseerd naar die van glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH). De relatieve expressie van genen werd berekend als vouwveranderingen met behulp van de 2−ΔΔCt-methode. De primersequenties voor genen zijn als volgt. Uchl1, Voorwaartse primer (5′–3′): TGAAGCAGACCATCGGGAAC, Achterwaartse primer (5′–3′): GAGTCATGGGCTGCCTGAAT; Uchl3, Voorwaartse primer (5′–3′): GGTCAGACTGAGGCACCAAG, Achterwaartse primer (5′–3′): CTCATCAGGGTCGCGCTC; Uchl5, Voorwaartse primer (5′–3′): AGACCTTAGCAGAACACCAGC, Achterwaartse primer (5′–3′): CAGCAGTGTACACATGTCCAAAT; gapdh, Voorwaartse primer (5′–3′): TGATTCTACCCACGGCAAGTT, Achterwaartse primer (5′–3′): TGATGGGTTTCCCATTGATGA.

Western blotting

Western blot werd uitgevoerd om eiwitverrijking in cellen en ruggenmergweefsels te detecteren. In het kort werden cellen en ongeveer 1 cm ruggengraatweefsel dat de laesieplaats bevatte, gelyseerd in PIPA (Solarbio) aangevuld met PMSF (1:100; Solarbio) en ultrasoon splitsen op ijs. Een totaal van 20 µg eiwit werd op 10-12% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide-elektroforese (SDS-PAGE) gel gelopen, overgebracht naar polyvinylideendifluoride (PVDF; Millipore, Mississauga, Canada) membranen en geblokkeerd met 5% magere melk. Vervolgens werden de membranen overnacht bij 4 ° C onder zacht schudden geïncubeerd met de eerste antilichamen, gevolgd door een combinatie met met mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerde secundaire antilichamen (1:1000). Eiwitverrijking werd gevisualiseerd via chemiluminescentiereagens en de grijswaardenanalyse van banden werd bepaald met behulp van Afbeelding J. De eerste antilichamen die in dit onderzoek werden toegepast, zijn als volgt: UCHL1 (1:1000; Cell Signaling Technology, CST), proteasoom 20S (1:1000; Affiniteit Biosciences LTD), Ubiquitin (1:1000; Abcam), Nestin (1:1000; Celsignaleringstechnologie, CST), GFAP (1:1000; Celsignaleringstechnologie, CST), MAP2 (1:1000; Abcam), NF- 200 (1:1000; celsignaleringstechnologie, CST), C3a (1:1000; Abcam), C3aR (1:500; Santa Cruz), DYKDDDDK-tag (1:1000; celsignaleringstechnologie, CST), GAPDH (1: 1000, Beyotime Biotechnology), β-actine (1:1000, Beyotime Biotechnology). GAPDH en β-actine werden gebruikt als interne controles.

Statistieken

SPSS (versie 20.0; Abbott Laboratories, Chicago, IL) werd toegepast voor statistische analyse. Onafhankelijke, tweezijdige, ongepaarde studenten t test werd gebruikt voor vergelijkingen tussen de twee groepen. Voor meerdere vergelijkingen werd eenzijdige variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door Tukey HSD post-hocanalyse of Kruskal-Wallis-test met Bonferroni-correctieanalyse geselecteerd. En tweeweg-ANOVA met Tukey HSD werd uitgevoerd voor analyse van BBB-scores. Er zijn geen statistische methoden gebruikt om de steekproefomvang vooraf te bepalen. Dieren werden willekeurig toegewezen aan experimentele groepen. Tijdens de experimentele procedure werd geen blinderingsmethode gebruikt. Er waren geen uitsluitingscriteria voor dieren. De variantie was vergelijkbaar tussen de groepen die statistisch werden vergeleken. Alle gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± de standaardfout van het gemiddelde (SEM) en P < 0.05 werd als statistisch significant beschouwd.

• Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
• PlatoData.Network Verticale generatieve AI. Versterk jezelf. Toegang hier.
• PlatoAiStream. Web3-intelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
• PlatoESG. Automotive / EV's, carbon, CleanTech, Energie, Milieu, Zonne, Afvalbeheer. Toegang hier.
• BlockOffsets. Eigendom voor milieucompensatie moderniseren. Toegang hier.
• Bron: https://www.nature.com/articles/s41419-023-06003-8