Hoofdtekst
]. Bovendien, wanneer genetisch gecodeerd en gekoppeld aan primaire metabole reacties binnen een microbiële gastheer, kunnen meerstaps chemische syntheses in één pot worden uitgevoerd via de fermentatie van duurzame biogebaseerde grondstoffen, in plaats van uit niet-hernieuwbare fossiele brandstoffen. Gecombineerd met de microbiële recycling van 'afval'-grondstoffen zoals lignine en polyethyleentereftalaat (PET)-kunststof tot primaire metabolische substraten, luidt technische biologie voor duurzame synthese een Gouden Eeuw in de industriële chemie in.
Eerder werk in het veld was gericht op platform-/bulk- en fijnchemicaliën die bekende metabolieten in de natuur zijn door hun natuurlijke biosynthetische routes in laboratoriummicroben te reconstitueren en te verbeteren. Deze benadering is echter beperkt tot een fractie van de kleine moleculen die tegenwoordig door de chemische industrie worden gebruikt en daarom is het ontwikkelen van biologische systemen om waardevolle chemicaliën van niet-natuurlijke oorsprong te produceren een kritieke uitdaging voor het veld dat vooruitgaat.
].
]. Toch zijn traditionele productieroutes afhankelijk van niet-duurzame fossiele bronnen (acetyleen of n-butaan) en energie-intensieve chemische processen. Engineering-biologie om BDO-productie uit duurzame grondstoffen door fermentatie mogelijk te maken, is daarom een belangrijke uitdaging.
Figuur 1Metabolische engineering van Escherichia coli voor duurzame synthese van 1,4-butaandiol uit koolhydraatgrondstoffen.
Afkortingen: C. beijerinckii, Clostridium beijerinckii; 4-HB, 4-hydroxybutyraat; M. bovis, Mycobacterium bovis; P. gingivalis, Porphyromonas gingivalis.
Concurrerende routes voor koolstofflux werden geëlimineerd met behulp van het OptKnock-algoritme door meerdere knock-outs te identificeren (ΔadE, Apfl, Aldh, en AMDH) die maximale BDO-productie koppelde aan celgroei, een opbrengst van 0.37 g/g voorspelde onder anaerobe omstandigheden door natuurlijke fermentatieroutes naar ethanol, formiaat, lactaat en succinaat te blokkeren en de BDO-productie aan te sturen om cellulaire redox in evenwicht te brengen. In de praktijk verminderden de knock-outs de celfitness ernstig, met de ΔadEΔpflΔldh middelmatige soort die niet kan groeien onder anaërobe omstandigheden; waarschijnlijk als gevolg van omgeleide koolstofflux door het natieve pyruvaatdehydrogenase, dat verminderde activiteit vertoonde onder de experimentele omstandigheden. Hoewel overwonnen door de beperkende subeenheid (lpdA) met een functionele homoloog van Klebsiella pneumoniae, wijst deze barrière op een algemene beperking van in silicium voorspellingsmodellen om rekening te houden met off-pathway-effecten in complexe metabolische systemen, maar hoe deze kunnen worden beperkt via rationele pathway-engineering. De herstelde stam vertoonde een verbeterde BDO-productie, maar groeide alleen onder micro-aerobe omstandigheden en produceerde aanzienlijke hoeveelheden ongewenste bijproducten zoals acetaat, pyruvaat, ethanol, vastgelopen tussenproducten en γ-butyrolacton (GBL), gevormd door spontane cyclisatie van 4-hydroxybutyryl-. CoA. Om dit aan te pakken, gaven de auteurs prioriteit aan flux door middel van BDO-synthese door knock-out boogA en MDH respectievelijk om transcriptionele repressie van verschillende aëroob tot expressie gebrachte oxidatieve TCA-cyclusgenen te verlichten en de toegang tot de reductieve TCA-cyclus te blokkeren. Geholpen door expressie van een NADH-ongevoelige citraatsynthasemutant GltA(R163L) om TCA-cyclustussenproducten te verhogen, bereikte de resulterende stam 95% koolstofflux naar BDO en een titer van ca. 13 mM na 40 uur. Een laatste evaluatie van de gemanipuleerde stam door pulslabeling met 13C-glucose duidde op een 4-HB-bottleneck in een laat stadium als gevolg van inefficiënte alcohol- en aldehyde-dehydrogenase-activiteit in de stroomafwaartse route. Een codon-geoptimaliseerde aldehyde dehydrogenase van Clostridium beijerinckii werd geïmplementeerd die verbeterde reductie van 4-HB-CoA tot BDO vertoonde in combinatie met endogeen E. coli reductase-enzymen, met minimale concurrerende achtergrondreductie van acetaldehyde tot ethanol.
].
].
]. Industrieel gebruik vereiste uitgebreide gastheerstam- en pathway-engineering (> 50 verdere genetische bewerkingen), naast genetische herconfiguraties die essentieel zijn voor opschaling. In overeenstemming met het oorspronkelijke rapport werden nieuwe wijzigingen aangebracht door een rationeel ontwerp, geholpen door 13C flux en transcriptomische analyses. Knock-outs ΔtriestΔgabD voorkwam dat flux terugkeerde naar de TCA-cyclus door de conversie van succinaat-semialdehyde naar succinaat te beperken bij hoge 4-HB-concentraties, waardoor de BDO-titers werden verhoogd van 18 g/l naar 29 g/l [
]. Verdere spanningsverbeteringen waren gericht op het oplossen van concurrerende nevenreacties en bronnen van zowel snelheidsbeperking als bijproductvorming. Fluxanalyse wees op een snelheidsbeperkend knelpunt in het pad tijdens de laatste reductiestappen van 4-HB naar BDO zodra optimalisaties een schaal van 80-90 g/l bereikten. Als zodanig werden Ald- en Cat2-enzymen ontwikkeld via gerichte evolutie om respectievelijk concurrerende Ac-CoA-reductieroutes te onderdrukken en productremming bij hoge BDO-titers te overwinnen. Eenmaal geïmplementeerd, verminderden de ontwikkelde enzymen de 4-HB-titers met 75%, terwijl de BDO-titers met 20% toenamen tot 110 g/l [
]. Om de vorming van bijproducten aan te pakken, ppc expressie werd verhoogd om de algehele TCA-cyclusflux van pyruvaat te verbeteren. Bovendien, het verwijderen van ATP inefficiënte componenten van de elektronentransportketen (ΔNDHΔappBCΔcydAB), thioesterasen (AybgCΔtesB) en acetaatkinase/fosfotransacetylase (AakA-pta) genen verlaagden CO2, GBL en acetaatvorming, respectievelijk. Dergelijke modificaties waren verantwoordelijk voor het bereiken van een uiteindelijke BDO-titer van 125 g/l.
Om de industriële acceptatie te verbeteren, was een laatste herconfiguratie van genetische delen nodig om de genetische stabiliteit te verbeteren en de verwerkingskosten te verlagen. Dit werd bereikt door chromosomale integratie van de plasmide-gecodeerde pathway-genen onder constitutieve promoters en de verwijdering van onstabiele cryptische profaag. Verdere genetische stabiliteit werd verleend door het muteren van faag-geassocieerde receptorgenen (tonA/lam) en het verwijderen van gedupliceerde genomische regio's. Deze gestabiliseerde stam werd vervolgens onderworpen aan uiteindelijke groeimedia en bioprocesoptimalisaties om stroomafwaartse verwerkingsstappen te minimaliseren, wat de uiteindelijke BDO-productiestam opleverde voor commercialisering.
Het succes van dit werk dient als een mijlpaal op het gebied van microbiële biokatalyse en toont de haalbaarheid aan van technisch de novo biosynthetische routes op schaal. Samen met de voortdurende ontdekking van enzymen, de steeds snellere enzym-engineering en synthetische biologische methoden, ligt er ongetwijfeld een mooie toekomst voor dit veld, aangezien de behoefte aan en vraag naar duurzamere chemische productietechnologieën werkelijkheid wordt.
- Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
- Platoblockchain. Web3 Metaverse Intelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
- Bron: https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00024-0?rss=yes
